Введение к работе
Актуальность проблемы. Основные компоненты цитохром Р450 — содержащей микросомальной монооксигеназной системы печени являются мембрапосвязанными белками. Поэтому после выделения этих белков в очищенном состоянии необходимо поместить их в некоторое гидрофобное окружение, чтобы воссоздать функциональную активность полной монооксигеназной системы или отдельных её компонентов. Реконструкция данной ферментной системы может быть осуществлена в растворе в присутствии ионных или неионных детергентов или фосфолипидов (Miwa et al., 1979; Kaminsky et al., 1987; Kanaeva et al., 1992). Но поскольку естественным окружением мембранных белков является липидный бислой, то встраивание очищенных компонентов микросомальной монооксигеназной системы в фосфолипидные везикулы (получение протеолипосом) является в большинстве случаев предпочтительным способом реконструкции. В этой реконструированной системе условия функционирования ферментов наиболее приближены к таковым в нативной мембране.
В настоящее время существуют разные методы, позволяющие реконструировать цитохром Р450 в фосфолипидных везикулах. Получаемые протеолипосомы функционально активны в окислении различных субстратов, могут быть подобны микросомам по липидному составу, соотношению белок/липид, размеру и по кинетике некоторых реакций. Поэтому цитохром Р450 — содержащие везикулы нашли широкое применение для изучения структуры фермента (Uvarov et al., 1993, 1994; Kunz et al., 1991; Vergeres et al., 1989), его взаимодействия с редокс — партнерами (Gut et al., 1982; Taniguchi et al., 1987; Taniguchi and
Pyerin, 1988) и липидным бислоем (Kawato et al., 1982; Bosterling and Stier, 1983).
Однако, как бы ни были подобны протеолипосомы микросомам, они являются всего лишь моделью последних. Поэтому вполне возможно, что какие—то структурно — функциональные характеристики цитохрома Р450, встроенного в фосфолипидные везикулы, могут быть отличны от таковых микросомального гемопротеина. На свойства цитохрома Р450 могут оказывать влияние, в частности, условия и метод получения протеолипосом. Однако, до настоящего времени не было проведено сравнительного изучения свойств цитохрома Р450, реконструированного в протсолипосомах различными методами.
С другой стороны, функциональное состояние цитохрома Р450 может в значительной степени зависеть от присутствия в протеолипосомах других белков — компонентов микросомальной монооксигеназной системы, в первую очередь цитохрома Ь5. Большинство данных о влиянии цитохрома Ь5 на цитохром Р450 было получено при реконструкции гемопротеинов в растворе или липидных мицеллах. Поэтому представляло интерес изучить влияние цитохрома Ь5 на функциональные свойства цитохрома Р450 в мембране протеолипосом.
Цель настоящей работы — сравнить функциональные свойства цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4, реконструированного в протеолипосомах различными методами, в отсутствии или присутствии цитохрома Ъ5.
Задачи исследования: 1. Сравнить кинетические параметры Н202— и ГПК — зависимого окисления бензфетамина цитохромом Р450 микросом и цитохромом Р450 2В4, встроенным в протеолипосомы.
Исследовать влияние метода получения протеолипосом, а также встраивания в них цитохрома Ъ5 на данные параметры. 2. Сопоставить цитохром Р450 микросом с цитохромом Р450 2В4, встроенным в протеолипосомы, по значениям констант равновесия и термодинамическим параметрам спиновых переходов гемопротеина и образования его комплекса с субстратом. Исследовать влияние встраивания цитохрома Ъ5 в мембрану протеолипосом на эти величины.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенного исследования установлено, что цитохром Р450 2В4, реконструированный в протеолипосомах в отсутствии других белков, и цитохром Р450 микросом существенно отличаются друг от друга по значениям констант равновесия и термодинамическим характеристикам процессов спиновых переходов гемопротеина и взаимодействия его с бензфетамином, а также по значениям Кт для Н2О2 в реакции N—деметилирования бензфетамина. Показано, что высокое значение Kjn для Н2О2, полученное для цитохрома Р450 2В4 протеолипосом, не может быть полностью объяснено более глубоким, чем в микросомах, погружением гемопротеина в липидныи бислой. Обнаружено, что метод реконструкции цитохрома Р450 2В4 в фосфолипидных везикулах не оказывает существенного влияния на исследованные свойства фермента. Это в значительной степени облегчает сопоставление экспериментальных данных, полученных с использованием протеолипосом, реконструированных различными методами. Установлено, что различия в функциональных свойствах цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4 протеолипосом заметно уменьшаются при совместном встраивании в протеолипосомы цитохромов Р450 2В4 и Ъ5. Эти результаты подтверждают существенное влияние взаимодействий цитохрома
Ь5 с цитохромом Р450 на функциональные свойства последнего. Данные о влиянии цитохрома Ь5 на термодинамические параметры спиновых переходов цитохрома Р450 и его взаимодействия с субстратом позволяют сделать некоторые предположения о механизмах модулирующего эффекта цитохрома Ь5 на цитохром Р450 и определить перспективные направления дальнейших исследований этих механизмов.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 9-й Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Цюрих, Швейцария, 1995) и на И—ом Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Лос Анжелес, США, 1996). Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН и кафедры биохимии МБФ РГМУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на
стр. машинописного текста, включает 5 таблиц и 7 рисунков и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение полученных результатов", "Выводы" и "Список литературы".