Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 9
2.1. История исследования лакказ 9
2.2. Распространение в природе и физиологические функции лакказ 10
2.3. Общая характеристика лакказ 14
2.4. Структура и строение активных центров лакказ 17
2.5. Субстратная специфичность лакказ 22
2.6. Механизмы катализа 25
2.7. Биосинтез лакказ 29
2.8. Использование лакказ в биотехнологии 30
2.9. Геномная организация лакказ 36
2.10. Экспрессия грибных лакказ 42
3. Материалы и методы 50
3.1. Материалы 50
3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты 50
3.1.2. Носители 50
3.1.3. Реагенты 50
3.2 Методы 52
3.2.1 Культивирование штаммов продуцентов лакказы 52
3.2.2 Получение антигена - дегликозилированной лакказы (Lacl) 53
3.2.3 Иммунизация 54
3.2.4 Тестирование антисывороток методом непрямого ИФА 54
3.2.5 Измерение пероксидазной активности в твердофазных системах... 55
3.2.6 Очистка поликлональных антител 55
3.2.7 Определение специфичности полученных препаратов антител 56
3.2.8 Синтез конъюгатов, меченых пероксидазой хрена (ПХ) 56
3.2.9 Вестерн блоттинг 57
3.2.10 Выделение рекомбинантной лакказы 57
3.2.11 Определение активности лакказы 58
3.2.12 Определение концентрации белка 58
3.2.13 Оценка гомогенности препаратов и определение молекулярной массы 58
3.2.14 Определение изоэлектрической точки 58
3.2.15 Спектральная характеристика 58
3.2.16 Регистрация ЭПР-спектров лакказы 59
3.2.17 Определение количества углеводов 59
3.2.18 Определение температурного и рН-оптимумов активности лакказ и изучение их термостабильности 59
3.2.19 Дифференциальная сканирующая калориметрия 60
3.2.20 Определение кинетических параметров 60
3.2.21 Подбор и оптимизация условий кристаллизации рекомбинантной лакказы 61
3.2.22 Сбор кристаллографических данных и их обработка 62,
3.2.23 Визуализация белковых структур 62
3.2.24 Динамическое светорассеяние 62
3.2.25 Расчет модели взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТ 62
4. Результаты и их обсуждение 50
4.1. Разработка метода иммунодетекции лакказ 66
4.2. Выделение нативной и рекомбинантной лакказ 71
4.3. Изучение спектральных характеристик лакказ 77
4.4. Сравнительная характеристика физико-химических свойств нативного и рекомбинантного ферментов 80
4.4.1 рН-оптимум 80
4.4.2 Термооптимум 81
4.4.3 Термостабильность 82
4.4.4 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДОС) 83
4.5 Каталитические свойства рекомбинантной лакказы 84
4.6 Сравнительное изучение трехмерных структур рекомбинантной лакказы из P. canescens и нативной лакказы из Т. hirsuta 87
4.6.1 Решение и уточнение структуры рекомбинантной лакказы 87
4.6.2 Сравнение последовательностей нативной и рекомбинантной лакказ. 89
4.6.3 Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ 90
4.6.4 Сравнение активного центра нативной и рекомбинантной лакказ... 94
4.6.5 Образование димерной формы 98
4.6.6 Расчетная модель взаимодействия нативной и рекомбинантной лакказ с субстратом АБТС 100
5. Выводы 64
6. Список литературы 107
- Распространение в природе и физиологические функции лакказ
- Геномная организация лакказ
- Разработка метода иммунодетекции лакказ
- Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ
Введение к работе
В настоящее время ферментные препараты находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Особый интерес для промышленного использования представляет лакказа (и-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2), содержащая уникальный ансамбль из четырех ионов меди, которые формируют ее активный центр. Лакказа катализирует окисление субстрата — донора электронов, сопровождающееся восстановлением молекулярного кислорода до воды.
Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году и к настоящему времени она насчитывает более чем столетнюю историю изучения [1]. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 лакказ из различных источников: грибы, растения, насекомые и бактерии. Большая часть практически значимых лакказ выделены из базидиальных грибов, в которых этот фермент играет ключевую роль в процессах биодеградации лигнина, образовании пигментов, детоксификации и т.д. Лакказа является полифункциональным ферментом: в растениях функция лакказы связана с процессом синтеза лигнина; в насекомых она участвует в процессах склеротизации и детоксификации, в частности, при метаболических нарушениях, связанных с обменом железа [2]. Также было показано наличие лакказ или лакказоподобных ферментов в бактериях, однако, классификация и сам факт отнесения этих ферментов к лакказам все еще вызывает споры [3].
Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов, ароматических аминов и других соединений. Субстратная специфичность фермента может быть значительно расширена при использовании редокс-медиаторов. В присутствии редокс-медиаторов лакказы могут окислять нефенольные соединения различной природы. Как правило, значения редокс-потенциала ТІ-центра лакказ (первичного акцептора электронов) лежат в диапазоне от +430 до +790 мВ, однако использование системы
фермент-медиатор позволяет окислять соединения со значениями Е выше +1100 мВ [4]. Кроме того, медиатор действует как подвижный электронный переносчик, позволяющий окислять высокомолекулярные биополимеры, такие как лигнин и целлюлозу.
По каталитическим свойствам, субстратной специфичности и биотехнологическому потенциалу лакказа - практически идеальный катализатор для «зеленой» химии. Тем не менее, промышленное использование лакказ ограничено, прежде всего, отсутствием их крупномасштабного производства и, как следствие, высокой стоимостью ферментных препаратов. Кроме того, большинство исследованных ферментов проявляют максимальную активность в кислой области рН, довольно низкую стабильность при нейтральных и щелочных рН, а также в присутствии органических растворителей, что значительно ограничивает возможности их использования в биосенсорных технологиях, биотопливных элементах и органическом синтезе. Традиционным подходом для решения такого рода проблем является создание высокоэффективных продуцентов гетерологичного белка. Гетерологичная экспрессия секреторных форм лакказ описана для большинства традиционно используемых эукариотических систем: Saccharomyces cerevisiae [5], Yarrowia lipolytica [6, 7], Pichia pastoris [8, 9], Trichoderma reesei [10], Aspergillus oryzae [11], Aspergillus niger [12] и др. Однако высокоэффективного штамма-продуцента рекомбинантной лакказы в этих эукариотических системах так и не создано, а полученные мутантные формы фермента не обладают желаемыми каталитическими характеристиками и стабильностью.
Для реализации стратегии получения эффективных рекомбинантных продуцентов лакказ необходимо разработать теоретические представления о механизмах биосинтеза и фолдинга сложных белков, в том числе металлоферментов, а также принципах их структурно-функциональной организации. В настоящее время для получения ферментов с измененными
субстратными специфичностями, каталитическими свойствами и
олигомерными структурами используют различные подходы белковой инженерии (рациональный дизайн, направленная эволюция). Для лакказ вышеперечисленные подходы оказались малоэффективными, поскольку ключевым этапом их реализации является получение высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов, которые синтезируют фермент, не уступающий природному аналогу по стабильности и каталитическим характеристикам.
Таким образом, изучение процессов гетерологичной продукции лакказ является крайне актуальным для выяснения закономерностей фолдинга металлоферментов при секреции в эукариотических микроорганизмах. Наиболее перспективно для экспрессии гетерологичных белков использование мицелиальных грибов рода Penicillium, способных секретировать в культуральную жидкость достаточно большие количества белка. Кроме того, использование системы Penicillium позволяет исследовать гетерологичную экспрессию лакказы в новом эукариотическом организме.
Целью настоящей работы было сравнительное структурно-функциональное исследование нативной лакказы Trametes hirsuta и фермента, гетерологически экспрессированного в Penicillium canescens (рекомбинантный фермент).
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
разработка эффективного протокола иммунохимического скрининга
трансформантов;
разработка эффективной системы очистки рекомбинантного фермента;
определение физико-химических и каталитических свойств
рекомбинантной лакказы;
характеристика рекомбинантного фермента на структурном уровне.
2. Литературный обзор
2.1. История исследования лакказ
Лакказа (и-дифенол: кислородоксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) -фермент, катализирующий реакцию восстановления молекулярного кислорода до воды минуя стадию образования перекиси водорода с сопутствующим окислением субстрата донора электронов. Лакказы относятся к классу медьсодержащих оксидаз наряду с такими ферментами, как аскорбатоксидаза, церулоплазмин, билирубин оксидаза и феноксазимсинтаза [13]. Лакказа является ферментом, представляющим интерес не только с фундаментальной точки зрения, но и с практической.
Лакказа была впервые найдена в лаковом дереве Rhus vernicifera в 1883 году. В истории изучения лакказ можно выделить несколько ключевых вех:
S Открытие фермента и его отнесение к классу оксидаз;
S установление состава активного центра - четыре иона меди с
различными спектральными свойствами; S предложена классификация ионов меди в белках по спектральным свойствам (научная группа под руководством профессора В. Malmstrom, 1959 - 1976); / биоэлектрокатализ или прямой перенос электронов на активный центр фермента непосредственно с электрода (научная группа под руководством профессора И.В. Березина, 1978-1980); S определение электронной структуры активного центра лакказ, на основании полученных данных предложен первый механизм катализа (научная группа под руководством профессора Е. Solomon, 1981-2002); S открытие систем лакказа-медиатор (К. Bourbonnais и М. Paice, 1992);
S получение первой пространственной структуры лакказы (научная группа под руководством профессора V. Ducros, 1998); f предложен механизм восстановления дикислорода на основе структурных исследований лакказ (30 структур из 14 организмов) (научная группа под руководством профессора I. Bento, 1998-2009); S предложена упрощенная схема катализа (Е. Solomon, 2007). Хотя история изучения лакказ насчитывает более ста лет физико-химических, биохимических, каталитических, биоэлектрокаталитических и структурных исследований, но до сих пор остается значительное количество нерешенных вопросов:
каков же механизм катализа;
что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра (ТІ);
какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих этот центр;
что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях.
Ответы на перечисленные вопросы имеют как фундаментальное значение - установление механизма функционирования металлоферментов, так и практическое — получение высокоэффективных катализаторов промышленного и медицинского назначения.
2.2. Распространение в природе и физиологические функции лакказ
Лакказы широко распространены в природе, что может объясняться разнообразием выполняемых ими физиологических функций. Они были обнаружены в царствах растений, животных, грибов и бактерий (рис. 1).
Наиболее изученной растительной лакказой является фермент,
выделенный из лакового дерева Rhus vernicifera. Кроме него частично
охарактеризованы лакказы из других растений: Rhus succedanea, Acer
pseudoplatanus, Pinus taeda, Populus euramericana, Liriodendron tulipifera, Nicotiana tobacco и др. [14, 15].
Рис.1 Распространение лакказ в природе.
В животном царстве лакказы обнаружены в насекомых таких, как Bombyx, Calliphora, Diploptera, Drosophila, Lucilia, Manduca, Musca, Orycetes, Papilio, Phormia, Rhodnius, Sarcophaga, Schistocerca и Tenebrio [13,
15].
Большинство описанных в литературе лакказ выделены из высших грибов. Лакказы обнаружены в базидиомицетах, аскомицетах и дейтеромицетах, однако наиболее эффективными продуцентами лакказы являются представители базидиомицетов, относящихся к грибам возбудителям белой гнили древесины.
Впервые лакказа была обнаружена в прокариотических организмах
достаточно давно - в 1993 г. Azospirillum lipoferum — это первая бактерия, в
которой была обнаружена лакказа [16]. На сегодняшний день известно
множество бактерий, способных синтезировать лакказу: Bacillus subtilis, Bordetella compestris, Caulobacter crescentus, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pestis и др. [17]. Как правило, в бактериях лакказы локализованы в периплазматическом пространстве [3].
Кроме лакказ или «истинных лакказ», к классу медьсодержащих оксидаз относят лакказоподобные ферменты, т.е. ферменты, способные окислять обычные субстраты лакказ и неспособные окислять тирозин (тест на «истинность» лакказ). В литературе описано наличие лакказоподобной активности у дрожжей, обитающих на гниющих деревьях [18], актиномицетов и бактерий. Например, представители некоторых семейств стрептомицетов способны синтезировать лакказоподобные ферменты [19].
До сих пор однозначно не определены функции как растительных, так и грибных лакказ [20, 21]. Тем не менее, все исследователи отмечают наличие «альтернативных» функций фермента в зависимости от источника происхождения. Проиллюстрируем данное положение на примере растительных и грибных ферментов. В растениях лакказы участвуют в синтезе лигнина, катализируя свободно-радикальную полимеризацию структурных единиц лигнина: «-кумарового, кониферилового и синапового спиртов. В грибах лакказы играют ключевую роль в процессах модификации, трансформации и деградации лигнина. Согласно мнению ряда авторов, субстратная специфичность и каталитические свойства лакказ обуславливают разнообразие физиологических функций фермента и, как следствие, его широкое распространение в природе. В данном обзоре приведена краткая характеристика достаточно хорошо изученных функций фермента: участие в деградации лигнина, а также в развитии и морфогенезе.
Деградация лигнина.
Основным и наиболее убедительным доказательством участия
фермента в деструкции лигнина является исследование
делигнифицирующего потенциала мутантов, дефицитных по лакказному
гену. Показано, что мутанты Sporotrichum pulveridentum, дефицитные по
лакказному гену, не могут осуществлять деградацию лигнина, в то время
как лакказа-положительные ревертанты эффективно осуществляют этот
процесс [21, 22]. Кроме того, было показано, что мутанты гриба «белой
гнили» Pycnoporus cinnabarinus, дефицитные по лакказному гену, не
обладали способностью минерализовать синтетический DHP-лигнин,
содержащий 14С в ароматическом кольце. Однако, способность мутантов
деградировать лигнин восстанавливалась при добавлении чистой лакказы
этого же штамма [23]. Таким образом, в настоящее время нет сомнений в
ключевой роли фермента в деградации лигнина, однако конкретные
реакции, катализируемые лакказой в этом процессе остаются неясны. Ряд
авторов полагает, что при действии на лигнин лакказа катализирует реакции
полимеризации (за счет рекомбинации радикалов), деметилирования и
образования хинонов [20, 23], причем экспериментальные подтверждения
вышеперечисленных реакций получены in vitro как с использованием
синтетического, так и природного биополимеров. В процессе
трансформации лигнина лакказой образуются низкомолекулярные
компоненты, т.е. происходит уменьшение молекулярной массы исходного
субстрата, однако данный процесс сопровождается и образованием
компонентов с более высокой молекулярной массой, что свидетельствует о
реполимеризации образовавшихся низкомолекулярных продуктов [20]. Эти
данные позволили высказать предположение, что основная функция
лакказы в процессе деструкции лигнина заключается не в его окислении, а в
детоксификации продуктов окисления за счет их полимеризации, что
предотвращает взаимодействие последних с гифами грибов [24]. Роль
фермента в процессе деметилирования полимерного лигнина,
представляющим собой ключевой этап биодеградации лигнина, сомнений в
настоящее время не вызывает [23].
Морфогенез.
Лакказы играют важную роль в морфогенезе, в том числе в процессе формирования пигментов. Установлено, что лакказа катализирует синтез пигментов при образовании плодового тела гриба и конидий, а также при росте в условиях глубинного культивирования на средах различного состава. В работе Temp и Eggert [25] сообщается, что при росте гриба Pycnoporus cinnabarinus на среде, содержащей глюкозу, синтезируется лакказа, которая участвует в формировании пигмента (цианобориновой кислоты), который придает характерный красно-оранжевый цвет культуральной жидкости. Синтез данного пигмента наблюдали и при образовании плодовых тел. В грибе Aspergillus nidulans лакказы участвуют в синтезе конидиальных пигментов [26]. Данные по уровню продукции лакказы при вегетативном размножении и развитии плодовых тел у различных грибов достаточно противоречивы [27]. Так, в работе Wood [28] показана значительная продукция лакказы в процессе вегетативного роста гриба Agaricus bispoms, но во время формирования плодового тела детектируемое количество фермента значительно снижается. Однако в ряде других работ показана обратная тенденция [29].
2.3. Общая характеристика лакказ.
Классификация лакказ достаточно условна и зависит от используемого критерия: локализация фермента (внутриклеточная или внеклеточная), диапазон рН, в котором фермент проявляет максимальную каталитическую активность (кислая, нейтральная и щелочная), значение редокс потенциала иона меди первого типа (высоко-, средне- и низко -редокс потенциальная) и строение активного центра (голубые, желтые и белые).
Большинство охарактеризованных грибных лакказ являются
внеклеточными ферментами, хотя многие грибы способны синтезировать
как внутри- так и внеклеточные лакказы. Наличие внутри- и внеклеточных
лакказ было показано для Suillus granulatus [30], Phanerochaete
chrysosporium и Lentinula edodes [31, 32]. Возможно, локализация лакказы
связана с выполняемыми ею физиологическими функциями и/или
определяется количеством субстратов, доступных ферменту.
Внутриклеточные лакказы могут принимать участие в трансформации
низкомолекулярных фенольных соединений, образующихся в клетке [20].
Большинство изученных лакказ представляет собой мономерные
белки и содержат около 500 аминокислотных остатков, хотя показано
существование димеров и тетрамеров [20]. Значения молекулярных масс
лакказ из различных источников варьируют в очень широких пределах от 43
кДа у Tricholoma giganteum [33] до 390 кДа (тетрамер) у Podospora anserine
[34]. Однако, в большинстве случаев для грибных лакказ характерна
молекулярная масса в диапазоне 60 - 70 кДа [35]. Основные различия,
видимо, связаны с углеводной частью молекулы.
Углеводная часть фермента может составлять от 10 до 45 % массы
молекулы белка и содержит такие углеводы, как гексозамин, глюкоза,
манноза, галактоза, фукоза, арабиноза [20]. Для лакказ, выделенных из
растений, характерно высокое содержание Сахаров (40-45%), в то время как
для грибных лакказ содержание углеводов обычно составляет 15-20% от
общей массы белка [19]. Однако, в некоторых случаях содержание Сахаров в
грибах может быть очень низким. Так лакказа, выделенная из
базидиомицета P. eryngii, содержит в своем составе от 1 до 7% углеводов
[36], в то время как лакказы С. fulvocinerea [37] и Botrytis cinerea [38]
содержат 32 и 49% углеводов соответственно, что не характерно для
большей части выделенных и охарактеризованных на сегодняшний день
лакказ. Многие исследователи считают, что углеводная часть молекулы
обеспечивает конформационную стабильность фермента [39]. Так, было
показано, что дегликозилирование лакказы, экспрессируемой Ganoderma
lucidum, приводит к полной потере активности фермента [40]. В то же время
на структурном уровне было установлено, что при дегликозилировании
лакказы из Coprinus cinereus происходит потеря иона меди второго типа
[41]. Таким образом, углеводная часть обеспечивает не только конформационную стабильность лакказы, но и структурированность ее активного центра.
Следует также отметить, что наличие углеводной части у белков секретируемых в окружающую среду, связано с защитой от протеолиза и инактивации свободными радикалами, что очень важно для грибных лакказ, основная функция которых деградация лигнина (процесс проходящий с образованием свободных радикалов) [20].
Диапазон изоэлектрических точек лакказ из различных источников очень широк (от 2.6 до 7.0), причем для ферментов растительного происхождения характерны нейтральные значения изоэлектрических точек, а для лакказ микробного происхождения - кислые [20, 21].
Большинство грибов способны продуцировать несколько изоформ и/или изоферментов. Однако об изоферментах правомерно говорить только в том случае, когда установлено наличие более одного гена лакказы в геноме микроорганизма и исследуемый фермент является белковым продуктом конкретного гена. Базидиомицет P. ostreatus секретирует восемь различных изоформ лакказы, шесть из которых были выделены, очищены и охарактеризованы [42-44]. Установлено, что на количество секретируемых изоферментов и изоформ сильное влияние оказывают не только условия культивирования, но и наличие индукторов [45, 46]. Базидиомицет Р. pulmonarus способен продуцировать три изофермента, два из которых (lccl и 1сс2) экспрессируются всегда, а третий изофермент 1ссЗ может быть обнаружен только в случае культивирования гриба в присутствии индукторов [21]. Гриб М. quercophilus способен продуцировать три конститутивных изоформы и четыре индуцибельных формы лакказы в зависимости от условий культивирования [21].
Продукция нескольких изоформ и/или изоферментов лакказы
позволяет окислить более широкий круг субстратов и/или свидетельствует о
различных механизмах регуляции биосинтеза [47].
Лакказы обладают уникальным строением активного центра, в который входит ансамбль из четырех ионов меди: одного иона меди первого типа (ТІ), одного иона меди второго типа (Т2) и двух ионов меди третьего типа (ТЗ). Классификация ионов меди, входящих в активный центр лакказ, основана на их спектральных характеристиках [15]. Ионы меди I типа характеризуются сильным поглощением в области около 600 нм (є ~5000 М~ ^см-1), поэтому лакказы имеют интенсивную голубую окраску, и также слабым параллельным расщеплением в спектрах ЭПР (g|| = 2.30, Ац = (40-95)-10"4 см-1) [15, 48]. Моноядерный Т2-центр фермента, невидимый на электронных спектрах поглощения, а на спектрах ЭПР характеризуется сверхтонким расщеплением (g|| = 2.24, Ац =(140_200)-10~^ см~[), типичным для ионов меди в тетрагональных комплексах [15, 48]. ТЗ-центр лакказ -биядерный медный центр, ионы меди которого спарены антиферромагнитно через гидроксидный мостик, в результате чего этот центр является диамагнитным и не детектируется в спектрах ЭПР. Он может быть идентифицирован по наличию плеча в УФ-области спектра в районе 330 нм (є=2800 М-1-см"1) [15].
2.4. Структура и строение активных центров лакказ.
Впервые пространственная структура была получена и решена для лакказы, выделенной из гриба Coprinus cinereus, с удаленным ионом меди второго типа [41]. Позже удалось получить структуры лакказ, содержащие все ионы меди. На данный момент получено и решено более 30 структур лакказ из 14 организмов (табл. 1):
Столь малое количество опубликованных структур лакказ, по
сравнению с другими ферментами (например, для целлюлаз (КФ 3.2.1.4)
известно 135 структур, а-амилаз (КФ 1.2.1.1) - 110
() объясняется
сложностями, возникающими при кристаллизации фермента.
Таблица 1. Структуры лакказ
Анализ экспериментальных данных по кристаллизации лакказ различного происхождения позволяет сделать ряд выводов:
S ферменты, обладающие схожими физико-химическими
характеристиками (изоэлектрической точкой, молекулярной массой и количеством углеводов на молекулу белка) могут образовывать кристаллы в различных условиях;
V ферменты с удаленным ионом меди Т2 кристаллизуются лучше, чем нативный фермент и позволяют получать структуры с более высоким разрешением, что может быть связано с изменением пространственной структуры (частичным «разрыхлением»);
S значительные трудности представляет кристаллизация средне- и
низкоредокспотенциальных лакказ, что достаточно . трудно
объяснить имеющимися данными об их первичной структуре,
физико-химическим и биохимическим свойствам.
В настоящее время разрешение структур лакказ из различных
организмов варьирует от 1.3 А до 2.85 А, причем более высокое разрешение
характерно для структур лакказ грибного происхождения. Так, самое
высокое разрешение было достигнуто для лакказы из аскомицета
Melanocarpus albomyces. Для лакказ из базидиомицетов получены как
структуры с высоким разрешением, так и ниже 2 А (табл. 1). Исходя из
существующих данных по подбору условий кристаллизации лакказ, можно
предположить, что на качество получаемых кристаллов влияет:
гомогенность ферментного препарата (отсутствие изоформ и изоферментов) или преобладание одной формы фермента в растворе;
наличие однородности по составу, строению и пространственному расположению углеводной части фермента, а не по количеству углеводов.
Структуры лакказ, выделенных из различных источников, очень похожи. Для лакказ характерна трехдоменная архитектура белковой глобулы (рис. 2).
Молекулы лакказ в основном представляют собой мономеры, состоящие из трех последовательно соединенных купредоксинподобных доменов, плотно упакованных в глобулу.
ТІ-медный центр расположен в третьем домене и координирован
двумя имидазолами гистидина и сульфгидрильной группой цистеина (рис.
3), которые образуют тригональную структуру. Он входит в состав
субстратсвязывающего «кармана», в формировании которого принимают
участие аминокислотные остатки второго и третьего доменов, и удален от
поверхности белка ~6.5 А.
Рис. 2 Структура лакказы из гриба Trametes hirsuta Одной из основных характеристик лакказ являются стандартные окислительно-восстановительные потенциалы медных центров. В зависимости от значения реокспотенциала иона меди первого типа, лакказы делят на низко-, средне- и высокоредокспотенциальные ферменты [61]. Значение потенциала ТІ-центра определено для многих лакказ (табл.2). Как видно из приведенных данных, именно для базидиомицетов, относящихся к группе грибов возбудителей белой гнили характерны высокие значения окислительно-восстановительного потенциала ионов меди ТІ центра.
Hull!
2.13
Нв395 НЬ64
^N^^
237 N
Gly67
НиЗЯЗ
НЫ53
НйЗИ)
N—7 ' г—N
НМ47 / /216 /"Ч 2.10 \ \ Н
Л/ /ТЗЛ \/
' 2.S2
\ 03
О"
|61
/ Z15 \ТЗ,/
НЬбб
НЯОЭ
Рис. 3 Структура активного центра лакказы Trametes hirsiita [60]. Таблица 2. Значения окислительно-восстановительных потенциалов ионов меди ТІ центра лакказ
Как правило, ТІ центр удален от Т2/ТЗ кластера на 12 А и связан с ним высококонсервативным для лакказ трипептидом His — Cys - His.
Трехъядерный кластер Т2/ТЗ расположен между первым и третьим доменами и имеет аминокислотные лиганды в каждом из них [53, 55]. Три иона меди кислород-восстанавливающего кластера Т2/ТЗ образуют почти правильный треугольник, с расстояниями от 3.7 до 5.1 А. Ион меди Т2 имеет два Ne2 лиганда от двух гистидиновых аминокислотных остатков и один кислородный лиганд 02, образуя тригональную плоскую конфигурацию. В качестве кислородного лиганда может выступать молекула воды или ОН- группа [15]. Как правило, расстояние между Т2 и ТЗ центрами составляет 4 А [52, 57], однако ввиду лабильности иона меди второго типа это расстояние варьирует от 3,8 А до 4,7 А.
Каждый из ионов меди ТЗ-пары координируется тремя гистидиновыми аминокислотными остатками и кислородным лигандом, расположенным между двумя ионами ТЗ. Координация каждого из них может быть описана как искаженный тетраэдр. Расстояние между ионами меди ТЗ может изменяться от 3.7 А до 5.1 А.
2.5. Субстратная специфичность лакказ
Лакказа обладает широкой субстратной специфичностью, катализируя окисление различных соединений, включая орто-, пара-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, лигнин, некоторые неорганические ионы и арилдиамины [20, 21, 63]. Существует предположение, что фермент окисляет фенольные гидроксилы субстратов с образованием феноксильного радикала, который вступает в неферментативные реакции деметоксилирования лигнина и метоксифенольных кислот, а также реакции образования хинонов и окислительного элиминирования карбоксильных групп [63]. Кроме того, установлено, что лакказа катализирует реакцию образования структурного лигнина по свободно радикальному механизму из различных органических соединений: конифериловый спирт, кумариновый
спирт, синаповый спирт [21].
Как было сказано выше, лакказы способны окислять большое число различных соединений, однако значение каталитических констант опубликованы только для небольшой группы субстратов (табл. 3).
Таблица 3. Кинетические характеристики лакказ из различных источников.
Н.д. - нет данных
Как видно из данных таблицы 3, значения Кт варьируют от 2 до 5000 цМ. Сравнение значений Кт показывает, что лакказы из различных источников имеют различное сродство по отношению к одному и тому же субстрату. Значительные отличия также наблюдаются и в значениях kcat по одному и тому же субстрату для лакказ из различных источников (табл. 3).
Большинство лакказ обладают высоким сродством к АБТС и сирингалдазину и характеризуются высокими значениями каталитических констант для этих субстратов, тогда как окисление гваякола и 2,6-диметоксифенола происходит значительно медленнее, а константы
Михаэлиса, соответственно, выше. С другой стороны, значения кш для одной лакказы по разным субстратам, как правило, не различаются более чем в 10 раз. Это объясняется тем, что к^д/ описывает скорость переноса электронов внутри молекулы белка после связывания с субстратом [73].
Использование лакказ совместно с редокс-медиаторами позволяет расширить спектр окисляемых субстратов. Как правило, значения редокс-потенциала ТІ-центра лакказ лежат в диапазоне +430 мВ до +790 мВ (табл. 2), однако использование системы лакказа-медиатор позволяет окислять молекулы со значениями Ес выше +1100 мВ (рис. 4) [4].
ок
Лакказа
Лакказа
Медиатор
Медиатор.
Субстрат
Субстрат,
Лакказа Лакказа
АБТС > АБТС" —>
0.7 В 1.1В
АБТС2*
Лакказа
ГБТ>Ы-ОН > ГБТ>НО'
1.1 В
Рис. 4. Схематический механизм действия систем лакказа-медиатор.
2.6. Механизмы катализа
Несмотря на большое количество исследований, посвященных медьсодержащим оксидазам, в том числе и лакказам, все еще не существует единого мнения относительно пути движения электронов в белковой глобуле при катализе [78]. Известно что ион меди ТІ принимает электроны от субстратов-доноров электронов, которые затем переносятся на трехядерный медный кластер Т2/ТЗ, где происходит восстановление молекулярного кислорода до воды. Таким образом, катализ можно условно
Распространение в природе и физиологические функции лакказ
Лакказы играют важную роль в морфогенезе, в том числе в процессе формирования пигментов. Установлено, что лакказа катализирует синтез пигментов при образовании плодового тела гриба и конидий, а также при росте в условиях глубинного культивирования на средах различного состава. В работе Temp и Eggert [25] сообщается, что при росте гриба Pycnoporus cinnabarinus на среде, содержащей глюкозу, синтезируется лакказа, которая участвует в формировании пигмента (цианобориновой кислоты), который придает характерный красно-оранжевый цвет культуральной жидкости. Синтез данного пигмента наблюдали и при образовании плодовых тел. В грибе Aspergillus nidulans лакказы участвуют в синтезе конидиальных пигментов [26]. Данные по уровню продукции лакказы при вегетативном размножении и развитии плодовых тел у различных грибов достаточно противоречивы [27]. Так, в работе Wood [28] показана значительная продукция лакказы в процессе вегетативного роста гриба Agaricus bispoms, но во время формирования плодового тела детектируемое количество фермента значительно снижается. Однако в ряде других работ показана обратная тенденция [29].
Классификация лакказ достаточно условна и зависит от используемого критерия: локализация фермента (внутриклеточная или внеклеточная), диапазон рН, в котором фермент проявляет максимальную каталитическую активность (кислая, нейтральная и щелочная), значение редокс потенциала иона меди первого типа (высоко-, средне- и низко -редокс потенциальная) и строение активного центра (голубые, желтые и белые). Большинство охарактеризованных грибных лакказ являются внеклеточными ферментами, хотя многие грибы способны синтезировать как внутри- так и внеклеточные лакказы. Наличие внутри- и внеклеточных лакказ было показано для Suillus granulatus [30], Phanerochaete chrysosporium и Lentinula edodes [31, 32]. Возможно, локализация лакказы связана с выполняемыми ею физиологическими функциями и/или определяется количеством субстратов, доступных ферменту. Внутриклеточные лакказы могут принимать участие в трансформации низкомолекулярных фенольных соединений, образующихся в клетке [20]. Большинство изученных лакказ представляет собой мономерные белки и содержат около 500 аминокислотных остатков, хотя показано существование димеров и тетрамеров [20]. Значения молекулярных масс лакказ из различных источников варьируют в очень широких пределах от 43 кДа у Tricholoma giganteum [33] до 390 кДа (тетрамер) у Podospora anserine [34]. Однако, в большинстве случаев для грибных лакказ характерна молекулярная масса в диапазоне 60 - 70 кДа [35]. Основные различия, видимо, связаны с углеводной частью молекулы. Углеводная часть фермента может составлять от 10 до 45 % массы молекулы белка и содержит такие углеводы, как гексозамин, глюкоза, манноза, галактоза, фукоза, арабиноза [20]. Для лакказ, выделенных из растений, характерно высокое содержание Сахаров (40-45%), в то время как для грибных лакказ содержание углеводов обычно составляет 15-20% от общей массы белка [19]. Однако, в некоторых случаях содержание Сахаров в грибах может быть очень низким. Так лакказа, выделенная из базидиомицета P. eryngii, содержит в своем составе от 1 до 7% углеводов [36], в то время как лакказы С. fulvocinerea [37] и Botrytis cinerea [38] содержат 32 и 49% углеводов соответственно, что не характерно для большей части выделенных и охарактеризованных на сегодняшний день лакказ. Многие исследователи считают, что углеводная часть молекулы обеспечивает конформационную стабильность фермента [39]. Так, было показано, что дегликозилирование лакказы, экспрессируемой Ganoderma lucidum, приводит к полной потере активности фермента [40]. В то же время на структурном уровне было установлено, что при дегликозилировании лакказы из Coprinus cinereus происходит потеря иона меди второго типа [41]. Таким образом, углеводная часть обеспечивает не только конформационную стабильность лакказы, но и структурированность ее активного центра. Следует также отметить, что наличие углеводной части у белков секретируемых в окружающую среду, связано с защитой от протеолиза и инактивации свободными радикалами, что очень важно для грибных лакказ, основная функция которых деградация лигнина (процесс проходящий с образованием свободных радикалов) [20]. Диапазон изоэлектрических точек лакказ из различных источников очень широк (от 2.6 до 7.0), причем для ферментов растительного происхождения характерны нейтральные значения изоэлектрических точек, а для лакказ микробного происхождения - кислые [20, 21]. Большинство грибов способны продуцировать несколько изоформ и/или изоферментов. Однако об изоферментах правомерно говорить только в том случае, когда установлено наличие более одного гена лакказы в геноме микроорганизма и исследуемый фермент является белковым продуктом конкретного гена. Базидиомицет P. ostreatus секретирует восемь различных изоформ лакказы, шесть из которых были выделены, очищены и охарактеризованы [42-44]. Установлено, что на количество секретируемых изоферментов и изоформ сильное влияние оказывают не только условия культивирования, но и наличие индукторов [45, 46]. Базидиомицет Р. pulmonarus способен продуцировать три изофермента, два из которых (lccl и 1сс2) экспрессируются всегда, а третий изофермент 1ссЗ может быть обнаружен только в случае культивирования гриба в присутствии индукторов [21]. Гриб М. quercophilus способен продуцировать три конститутивных изоформы и четыре индуцибельных формы лакказы в зависимости от условий культивирования [21]. Продукция нескольких изоформ и/или изоферментов лакказы позволяет окислить более широкий круг субстратов и/или свидетельствует о различных механизмах регуляции биосинтеза [47]. Лакказы обладают уникальным строением активного центра, в который входит ансамбль из четырех ионов меди: одного иона меди первого типа (ТІ), одного иона меди второго типа (Т2) и двух ионов меди третьего типа (ТЗ). Классификация ионов меди, входящих в активный центр лакказ, основана на их спектральных характеристиках [15]. Ионы меди I типа характеризуются сильным поглощением в области около 600 нм (є 5000 М см-1), поэтому лакказы имеют интенсивную голубую окраску, и также слабым параллельным расщеплением в спектрах ЭПР (g = 2.30, Ац = (40-95)-10"4 см-1) [15, 48]. Моноядерный Т2-центр фермента, невидимый на электронных спектрах поглощения, а на спектрах ЭПР характеризуется сверхтонким расщеплением (g = 2.24, Ац =(140_200)-10 см [), типичным для ионов меди в тетрагональных комплексах [15, 48]. ТЗ-центр лакказ -биядерный медный центр, ионы меди которого спарены антиферромагнитно через гидроксидный мостик, в результате чего этот центр является диамагнитным и не детектируется в спектрах ЭПР. Он может быть идентифицирован по наличию плеча в УФ-области спектра в районе 330 нм (є=2800 М-1-см"1) [15].
Геномная организация лакказ
Прежде всего, следует отметить, что данные о геномной организации лакказ ограничены. В настоящее время не опубликовано ни одного обзора, содержащего систематизированные сведения о принципах генетической организации данных ферментов, что очевидно. связано недостаточным массивом экспериментальных данных и, как следствие, с отсутствием установленных закономерностей.
Как и пероксидазы лакказы могут содержать несколько генов в одном организме и экспрессировать несколько изоферментов. Так, для лакказы из Т. versicolor выделено и описано два изофермента LCCI и LCCIV [97] которые кодируются разными генами, для Т. villosa описано также два гена [98], а для R. solani - четыре lccl, 1сс2, 1ссЗ и 1сс4 [99]. Базидиомицет Р. ostreatus экспрессирует в общей сложности до восьми изоформ лакказы, которые кодируются шестью генами рохс poxl, рох4 poxalb, рохЗ, и рохЗа [44]. Таким образом, достаточно сложно разделить продукцию изоферментов (шесть) и продукцию изоформ (восемь) данным штаммом. Уровень экспрессии того или иного изофермента зависит главным образом от условий культивирования P. ostreatus. Как правило, наиболее сильное влияние на экспрессию той или иной изоформы оказывает соотношение в среде ионов меди и азота [100]. Также, влияние на экспрессию изоферментов оказывают различные регуляторные последовательности соответствующего гена.
Все лакказы за исключением бактериальных лакказоподобных оксидаз имеют интроны в составе гена. Обобщающего анализа экзон-интронной структуры генов лакказ в настоящее время не существует, а день наиболее изученным с точки зрения экзон-интронной структуры генов является семейство лакказ, продуцируемых базидиомицетом P. ostreatus.
Количество интронов в генах лакказ этого организма колеблется от 10 в случае гена изофермента рохЗ до 21 в случае рохЗа. Гены лакказ рохс, poxl и рох4 обладают одинаковым экзон-интронным составом и содержат по 19 интронов, при том, что аминокислотные последовательности этих ферментов отличаются. Так уровень гомологии по аминокислотной последовательности между лакказами рохс и poxl составляет 89%, а между рохс и рох4 - 78%. Сравнение аминокислотных последовательностей рохс, poxl и рох4 показывает, что их взаимная гомология также достаточно высокая 75%. Исключением является изофермент рохЗа, имеющий низкий уровень гомологии по аминокислотной последовательности как по отношению к остальным изо ферментам; так и по отношению к другим грибным лакказам. Так уровень гомологии между парами лакказ рохЗа и poxalb, а также между рохЗа и рохс составляет 45% и 47% соответственно [44].
Как уже было отмечено выше, объем данных по генетической структуре лакказ ограничен, но уже имеющиеся данные показывают значительные отличия экзон-интронной организации генов, кодирующих различные изоферменты, что согласуется с результатами исследования физико-химических и биохимических свойств данных изоферментов (табл. 4). Именно поэтому в настоящее время при исследовании генетической организации лакказ из различных организмов, прежде всего, сравнивают их нуклеотидные и аминокислотные последовательности, с уже имеющимися в базах данных, затем проводят филогенетический анализ различными методами (метод ближайшего связывания, максимального приближения, байесовский вывод) и устанавливают степень генетической и эволюционной взаимосвязи. Обнаружив генетически-эволюционную близость изучаемой лакказы с теми ферментами, для которых физико-химические свойства уже известны, многие исследователи прогнозируют для нее схожие характеристики [101], а некоторые авторы делают подобные заключения на основании только сравнительного анализа экзон-интронных структур лакказных генов [102].
Действительно сравнительный анализ филогенетического положения аминокислотных последовательностей лакказ (рис. 9) и их характеристик, представленных в таблице 4, позволяет заключить, что эволюционно близкие ферменты, т. е. находящиеся рядом на филогенетическом дереве, обладают схожими биохимическими и физико-химическими свойствами. Тем не менее, имеющиеся в литературе данные недостаточны для выявления таких закономерностей. Именно поэтому при изучении свойств грибных лакказ и их генетической организации необходимо использовать комплексный подход: изучать биохимические, физико-химические свойства, субстратную специфичность, каталитические параметры и пространственную структуру фермента, а также его генетическую организацию и условия биосинтеза. Только такой подход позволит выявить основные закономерности взаимосвязи между молекулярно-генетической организацией лакказ и их функциональными характеристиками и заложить, таким образом, фундаментальные основы генетической паспортизации штаммов базидиальных грибов, имеющихся в Российских коллекциях микроорганизмов.
Разработка метода иммунодетекции лакказ
Многими исследовательскими группами были предприняты неоднократные попытки создания высокоэффективных систем экспрессии рекомбинантных лакказ (см. литобзор). Анализ литературных данных свидетельствует о трудностях при получении такого штамма - реципиента, которые связаны как с правильным фолдингом белковой глобулы, в том числе встраиванием ионов меди, так и с особенностями штамма, экспрессирующего лакказу. Оценить корректность фолдинга без проведения структурных исследований достаточно затруднительно. Но только для одной лакказы из аскомицета М. albomyces были получены структуры нативного и рекомбинантного белков [49]. Следует подчеркнуть, что экспрессия лакказы аскомицетов в аскомицетах позволяет получить близкие по структуре и физико-химическим свойствам ферменты, что, очевидно, связано со сходными путями синтеза и экспрессии ферментов в донорном и реципиентном штаммах. Однако лакказы аскомицетов относятся к группе низко редокс-потенциальньтх ферментов и характеризуются достаточно низкой термостабильностью. Поэтому поиск эффективной системы гетерологичной экспрессии высоко редокс-потенциальных грибных лакказ остается актуальной.
В данной работе в качестве системы экспрессии лакказного гена (lacl) базидиального гриба Г. hirsuta была выбрана гетеро логичная белковая экспрессия в грибах РепісіШит, поскольку их использование в качестве реципиентов для крупномасштабной экспрессии (продукции) гетерологичных белков имеет ряд преимуществ: 1) эти грибы способны секретировать достаточно большие количества белка в культуральную жидкость; 2) ферменты, продуцируемые ими, хорошо зарекомендовали себя с точки зрения безопасности для здоровья человека; 3) за многие годы использования этих грибов для крупномасштабных процессов ферментации накоплен значительный объем информации в данной области.
Основными этапами получения рекомбинантных ферментов являются: 1) выделение генов целевых ферментов; 2) создание экспрессионных плазмид с включенной структурной частью гена, которая состыкована с фрагментами промоторных областей и нуклеотидными последовательностями, кодирующими сигнальные пептиды, и получение штаммов-трансформантов; 3) проведение скрининга и отбор клонов трансформантов с высоким уровнем экспрессии; 4) выделение и изучение свойств рекомбинантного фермента.
Первый и второй этапы были успешно осуществлены в ходе исследований, проводившихся совместно с лабораторией Оптимизации экспрессии генов ИНБИ РАН. Для экспрессии гена lacl Т. hirsuta в грибе Р. canescens использовали сильный промотор гена bgaS Р-галактозидазы Р. canescens, ее лидерный пептид и терминатор транскрипции. Плазмиды pBGlac и pBGmlac, несущие интронированный и неинтронированный гены лакказы lacl соответственно, были введены в геном мутантного по гену нитратредуктазы (niaD) штамма P. canescens РСА-10 путем котрансформации с плазмидой pSTA-ІО, несущей комплементирующий ген niaD A. niger.
Для проведения селекции клонов трансформантов P.canescens, характеризующихся наиболее высокой продукцией рекомбинантной лакказы, необходимо было разработать эффективную систему детекции фермента в культуральных жидкостях трансформантов P.canescens. Как правило, при создании системы экспрессии любого фермента возникает проблема скрининга трансформантов. Иногда для того, чтобы найти наиболее эффективный продуцент, исследователям приходится тестировать сотни трансформантов. В случае экспрессии лакказ для такого скрининга обычно применяются стандартные микробиологические методы. В этом случае скрининг проводят путем пересева трансформантов на твердую питательную среду, содержащую субстрат, способный изменять цвет под действием лакказы (чаще всего используют АБТС) [98, 99, 105]. Об уровне биосинтеза фермента трансформантом судят по скорости появления и интенсивности окраски, формирующейся вокруг колонии. Не смотря на то, что этот метод позволяет значительно сократить время анализа по сравнению с методом глубинного культивирования, он имеет ряд существенных недостатков. Например, наличие ложноположительных результатов. Поэтому в последнее время все чаще для детекции лакказы применяют иммуноферментный анализ с использованием высокоспецифичных антител. В качестве антигенов для получения поликлональных антител были использованы препараты нативного (гликозилированного) и дегликозилированного фермента. Антитела, полученные к нативным лакказам, могут иметь низкую иммуноспецифичность, что обусловлено наличием углеводной части. В результате иммунизации таким препаратом антитела могут вырабатываться как на белковую часть молекулы, так и на углеводную. В этом случае возможно, что антитела будут связываться со многими белками, продуцируемыми данным организмом, имеющими схожую углеводную часть. Согласно современным представлениям, системы гликозилирования у штаммов одного рода достаточно консервативны, следовательно, и экспрессированный белок и конститутивные белки данного штамма будут иметь идентичные или близкие по составу и структуре углеводные части [126]. При использовании в качестве антигена препаратов, не содержащих углеводную часть, антитела будут вырабатываться только на белковую часть молекулы, что значительно повысит их иммуноспецифичность.
Сравнение пространственных структур нативной и рекомбинантной лакказ
Подобное изменение возможного места связывания катион-радикала АБТС с молекулой рекомбинантной лакказы приводит к перераспределению зарядов на поверхности белковой глобулы (рис. 30). При этом с одной стороны, происходит увеличение зоны положительного заряда в области ТІ медного центра, что в результате может приводить к увеличению скорости переноса электрона с поверхности белковой глобулы на ТІ медный центр.
С другой стороны, уменьшение расстояния от катион-радикала АБТС до Т2/ТЗ кластера может приводить к снижению потенциала последнего и, соответственно, к увеличению скорости внутримолекулярного переноса электрона с ТІ медного центра на Т2/ТЗ кластер рекомбинантной лакказы. Совокупность этих процессов, по всей видимости, и обуславливает наблюдаемое увеличение значений каталитических констант для субстрата АБТС у рекомбинантной лакказы по сравнению с нативной.
Таким образом, проведено сравнительное исследование физико-химических и каталитических свойств нативной и гетерологически экспрессированной лакказы базидиального гриба Т. hirsuta, показавшее сходство исследуемых ферментов. Наблюдаемое увеличение температурного оптимума и термостабильности рекомбинантной лакказы позволило высказать предположение о влияние углеводов на стабильность фермента. Структурные исследования подтвердили отличия экспрессированной формы от нативного фермента, связанные с наличием дополнительного сайта гликозилирования (Asn377) и различным строением углеводных цепей. Полученные данные могут быть использованы для поиска штаммов — реципиентов с системой гликозилирования, которая обеспечивает стабильность экспрессированного фермента. К сожалению, структура всех углеводов как в нативной, так и в рекомбинантной лакказах не установлена методом РСА. Очевидно, необходимы другие подходы для установления структуры углеводов (например, ЯМР), что требует проведения дальнейших исследований.
Кроме того, анализ структурных данных показал, что заселенность Т2 медного центра в рекомбинантной лакказе составляет 0,5, что может объясняться наличием в растворе молекул белка с отсутствующим ионом меди второго типа. На основании полученных данных выдвинута гипотеза о существовании специфических механизмов регуляции встраивания ионов меди в молекулу фермента. Возможно, именно наличие таких механизмов и обуславливают низкий уровень продукции лакказы при гетерологичной экспрессии. 1 1. Получены поликлональные антитела к нефолдированной лакказе Т. hirsuta, обладающие более высокой специфичностью по сравнению с антителами к нативному ферменту, что позволило разработать высокочувствительный метод скрининга лакказ в культуралыюй жидкости иммуноблоттингом. 2. Разработан эффективный протокол очистки рекомбинантной лакказы, позволяющий получить гомогенный фермент. Сравнительный анализ физико-химических свойств гомогенных препаратов нативной и рекомбинантной лакказ показал увеличение молекулярной массы с 67 до 72 кДа, pi с 4,0 до 4,3, температурного оптимума на 10С, термостабильности на 70 минут и количества углеводов на молекулу с 12 до 16%. Значение энтальпии плавления для рекомбинантной лакказы, рассчитанное по данным ДСК анализа, превышало аналогичный параметр для нативной более чем в 1.5 раза. Полученные данные свидетельствуют о разных механизмах гликозилирования лакказы для нативного и рекомбинантного штаммов-продуцентов. 3. Показано, что кинетические параметры окисления фенольных субстратов нативной и рекомбинантной лакказами практически одинаковы, в то же время установлено возрастание значений каталитических констант в 1.3 раза при окислении нефенольных субстратов рекомбинантным ферментом по сравнению с нативным. 4. Впервые решена структура базидиальной лакказы Т. hirsuta, экспрессированной в аскомицете P. canescens, с разрешением 2.3 А. Структуры нативного и рекомбинантного фермента могут быть совмещены по координатам всех Са атомов с r.s.m.d. 0.3 А, что указывает на отсутствие значительных отличий в ходе их полипептидных цепей. 5. Установлены различия в строении углеводной части нативной и рекомбинантной лакказ по сайтам гликозилирования Asn54, Asn217 и Asn436 и наличие дополнительного сайта гликозилирования Asn377 у рекомбинантного фермента, что обуславливает его более высокие температурный оптимум и термостабильность. 6. Анализ карт электронной плотности активного центра нативной и рекомбинантной лакказ показал, что их ТІ медные центры имеют идентичную структуру. Заселенность иона меди Т2 составляет 0.8 и 0.5 для нативного и рекомбинантного фермента соответственно. Таким образом, в препарате рекомбинантной лакказы могут присутствовать молекулы белка с удаленным ионом меди второго типа. 7. Проведено компьютерное моделирование взаимодействия нативного и рекомбинантного фермента с нефенольным субстратом АБТС. Показано уменьшение расстояния от Т2/ТЗ медного кластера до катион-радикала АБТС в случае рекомбинантной лакказы, обусловленное изменением строения углеводной цепи по сайту гликозилирования Asn436.
