Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1 .Психобиологическая модель темперамента 9
1,1.Темперамент. Модели. Методы оценки 9
1.2. Биологические основы конституционально-личностных и поведенческих характеристик
человека и животных 13
2. Эндогенная опиоидная система (ЭОС) 24
2.1. Опиоидные рецепторы (ОР) 27
2.2. Опиоидные пептиды (ОП) 30
2.3. Энкефалиндеградирующие ферменты (ЭДФ) , 34
2.3.1. Классификация и локализация ЭДФ 34
2.3.2. Субстратная специфичность энкефалиназ 36
2.3.3. Ингибиторы ЭДФ 39
Глава II. Материалы и методы
1. Экспериментальные животные 43
2. Обследованные доноры 43
3. Тестирование поведения животных 44
4. Оценка конституционально-личностных характеристик человека 46
5. Радиорецепторное исследование 6-ор мозга крыс 49
6. Исследование активности энкефалиндеградирующих ферментов 51
7. Статистическая обработка результатов 59
8. Материалы 60
Глава III. Результаты исследований
1.Характеристики связывания 5-ор головного мозга у крыс с различными пов еденческими характеристиками 61
1.1. Характеристики связывания 5-ОР головного мозга у крыс с различной двигательной активностью 61
1.2.Характеристики связывания 8-ОР головного мозга у крыс с различным уровнем тревожности 62
2. Определение активности эдф в биологических образцах 66
2.1. Определение параметров эпкефалиназной активности 66
2.2. Условия реакции для определения суммарной активности эпкефалиндеградирующих ферментов 68
2.2.1. Кинетика ферментативного гидролиза Лей-энкефалина 68
2.2.2. рН-зависимость ферментативной деградации Лей-энкефалина. Зависимость скорости реакции деградации Лей-энкефалина от концентрации субстрата и степени разведения плазмы 70
2.3. Определение активности отдельных групп ферментов гидролиза Лей-энкефалина в плазме крови человека 73
3. Активность эдф плазмы крови у взрослых доноров с различными конституционально-личностными характеристиками 77
3.1. Активность эдф плазмы крови у людей с различным уровнем личностной тревожности 77
3.2, активность эдф плазмы крови у людей с различными типами темперамента 78
4. Время полужизни лей-энкефалина в сыворотке крови детей первого года жизни 81
5. Время полужизни лей-энкефалина в сыворотке крови у детей первого года жизни с различными характеристиками темперамента 82
6. Активность эдф у линейных мышей c57black/6 и balb/c различающихся фенотипом эмоционально-стрессовой реакции 84
6.1. Определение активности ЭДФ плазмы крови мышей двух линий 85
6.2. Определение активности ЭДФ в гомогенате мозга мышей двух линий 85
Глава IV. Обсуждение результатов 93
Выводы 108
Список литературы 109
Приложения 131
- Классификация и локализация ЭДФ
- Исследование активности энкефалиндеградирующих ферментов
- Условия реакции для определения суммарной активности эпкефалиндеградирующих ферментов
- Активность эдф у линейных мышей c57black/6 и balb/c различающихся фенотипом эмоционально-стрессовой реакции
Введение к работе
Конституционально-личностные характеристики (КЛХ) влияют на выраженность и характер стресс-индуцированных реакций организма, определяют особенности развития патологических процессов, а в ряде случаев и индивидуальную чувствительность к фармакологическим средствам (Cloninger R. 1993-2003; Пшенникова М.Г. и соавт. 2003; Середенин СБ. и соавт. 1993-2003;).
Индивидуальные особенности поведенческих и психологических реакций обеспечиваются большинством из известных регуляторных систем организма (Hamner М.В., et al., 1996; Gerra G., et al., 2000). Однако, конкретные нейрохимические и нейроэндокринные механизмы, определяющие конституциональные различия, остаются малоизученными. Предполагается, что в основе этих различий лежат различия в функционировании всех основных регуляторных систем организма и, в частности, пептидергических (Pliszka S.R., et al., 1994; Olson G.A.,et al., 1997; Зозуля А.А. с соавт., 1999-2001). В этом плане представляет интерес эндогенная опиоидная система (ЭОС), которая обеспечивает модуляцию основных нейрохимических систем организма в условиях отклонения от гомеостаза (Меерсон Ф.З., 1981; Пшенникова М.Г., 1987, 2004; Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., 1994; Зозуля А.А. 1999; Drolet G., et al.,2001).
Можно ожидать, что в процесс формирования и проявления поведенческих,
конституционально-личностных особенностей животных и человека
вовлечены как центральные, так и периферические отделы ЭОС. Известно, что в регуляции эмоциональной сферы принимают участие опиоидные рецепторы 5-ти па. Агонисты этих рецепторов способны вызывать антидепрессивный (Baamond A., et al., 1992) и анксиолитический эффекты (Зозуля А.А., 1999). Поэтому есть основания предполагать, что в центральные механизмы регуляции психических функций, в регуляцию поведения животных и особенностей темперамента человека, вовлечены, в частности, и ОР головного мозга.
С другой стороны, функционирование ЭОС зависит не только от состояния ОР, но и от концентрации их лигандов, в частности, опиоидных пептидов. Физиологическое действие Лей-энкефалина, эндогенного лиганда 6-ОР, лимитируется не только процессами синтеза и секреции, но и высокой скоростью его деградации. Время существования ЛеЙ-энкефалина в кровяном русле исчисляется несколькими минутами (Гомазков О.А., 1995; Marini М., et al., 1997; Ашмарин И.П., 1999;). Можно предполагать, что скорость ферментативного гидролиза опиоидных пептидов, так же как и состояние рецепторного звена ЭОС, является существенным фактором, определяющим особенности конституционально-личностных и поведенческих характеристик человека и животных.
Изучение механизмов, определяющих роль ЭОС в развитии конституционально-обусловленных особенностей нейрохимических процессов, имеет не только фундаментальное значение. Можно предполагать, что эти исследования позволят осуществлять предикцию эффективности фармакологических и других воздействий, модулирующих состояние ЭОС, и повысить эффективность их использования в клинике.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является сравнительный анализ параметров ЭОС у людей с различным темпераментом и у животных с различающимися поведенческими характеристиками.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
Определить характеристики связывания 5-ОР стриатума и обонятельных луковиц мозга у крыс с различными поведенческими характеристиками, определяемыми в условиях тестирования животных в системе Auto Track System и приподнятом крестообразном лабиринте.
Разработать методику определения суммарной активности ферментов гидролиза Лей-энкефалина в биологических образцах. Определить активность отдельных групп энкефалиндеградирующих ферментов плазмы крови человека.
Изучить взаимосвязь активности энкефалиндеградирующих ферментов взрослых соматически здоровых доноров с показателями их темперамента.
Провести сравнительный анализ активности энкефалиндеградирующих ферментов сыворотки крови у детей первого года жизни с различными характеристиками темперамента.
Провести сравнительный анализ активности энкефалиндеградирующих ферментов гомогената мозга и плазмы крови мышей линий С57Вlack/6 и Balb/c, имеющих различный фенотип эмоционально-стрессовой реакции.
Научная новизна работы. Впервые экспериментально доказано различие констант связывания центральных опиоидных рецепторов у крыс с различным уровнем двигательной активности и тревожности, то есть у крыс с разными поведенческими характеристиками. Разработана методика, позволяющая одновременно определять активность всех групп энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) в биологических образцах с помощью ВЭЖХ продуктов ферментативного гидролиза равномерно меченного тритием Лей-энкефалина. Впервые обнаружен карбоксипептидазный путь деградации Лей-энкефалина в плазме крови человека. Выявлены межлинейные различия в суммарной активности ЭДФ плазмы крови у мышей линий Balb/c и С57Вlack/6, отличающихся фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Впервые показана зависимость параметров энкефалиназной активности плазмы крови человека от его возраста и пола. Показана взаимосвязь показателей активности ЭДФ с характеристиками темперамента у взрослых и у детей первого года жизни. Исследование активности ЭДФ сыворотки крови детей первого года жизни проведено впервые.
Научно-практическая значимость работы. Разработанный микрометод позволяет исследовать фармакокинетику лекарственных препаратов пептидной природы и метаболизм биологически активных пептидов эндогенного происхождения. Полученные данные, могут быть использованы для предикции клинического эффекта препаратов, модулирующих состояние эндогенной опиоидной системы.
Положения, вынесенные на защиту.
Состояние центральных опиоидных рецепторов различается у животных с разными поведенческими характеристиками.
Процесс ферментативного гидролиза Лей-энкефалина в плазме крови различается у животных с различными поведенческими характеристиками и у людей с разным темпераментом.
Внедрение результатов исследования. Результаты проведённых исследований внедрены в научно-исследовательскую работу ГУ Научного Центра Психического Здоровья РАМН, НЦ наркологии МЗ РФ и РГМУ МЗ РФ.
Классификация и локализация ЭДФ
Энкефалиндеградирующие ферменты классифицируются на аминопептидазы (АП), отщепляющие с N-конца энкефалинов тирозин; диаминопептидазы, гидролизующие связь Гли-Гли, и дикарбоксипептидазы, отщепляющие две аминокислоты с С- конца.
В настоящее время из мозга и других тканей выделено и охарактеризовано значительное число пептидаз, гидролизующих в молекуле энкефалинов определённые связи:
Энкефалиназы отличают по чувствительности к специфическим синтетическим ингибиторам. Так среди АП выделяют бестатинчувствительные и бестатиннечувствительные АП, пуромицинчувствительные и пуромициннечувствительные АП. Среди дипептидиламинопептидаз выделяют каптоприлчувствительные (АПФ) и тиорфанчувствительные (энкефалиназа А).
Среди АП выделяют также растворимые и мембраносвязанные аминопептидазы. Показано наличие в мозге таких пептидаз, как АП-М (пуромицин-нечувствительная, КФЗ.4.11.2), бестатин-чувствительные АП, пуромицин-чувствительные АП, к которым относится и ариламидаза (КФЗ.4.11.11) (Беляев Н.А. с соавт., 1990; 1993). В плазме крови АП составляют до 80% энкефалиндеградирующей активности (Marini М. et al., 1997). Вклад дипептидиламинопептидаз, к которым относятся энкефалиназа В и ДПП-IV не столь велик: в плазме он составляет менее 5% (Беляев Н.А. с соавт., 1990, 1993). К дикарбоксипептидазам, гидролизующим Лей-энкефалин, относят энкефалиназу А (нейтральная эндопептидаза 24.11) и ангиотензинпревращающий фермент (АПФ). Энкефалиназу А называют также металл о пептид азои, поскольку её активность зависит от содержания в среде ионов тяжёлых металлов, она принадлежит к классу тиолзависимых ферментов (Гомазков О.А., 1995). Единственная известная на данный момент карбоксипептидаза, гидролизующая Лей-энкефалин, обнаружена в слизистой оболочке и мышечной стенке желудка человека (Bunnett N.W. et al., 1992).
Энкефалиназы плазмы крови изучены мало. Опубликованные данные позволяют говорить о присутствии в крови не менее семи водорастворимых пептидаз, которые деградируют энкефалины (Marini М. et al., 1990). Среди них имеется пять аминопептидаз, которые определяют приблизительно 80% общей энкефалиидеградирующей активности плазмы крови. Все они примерно в одинаковой степени чувствительны к бестатину и отличаются по хроматографической подвижности на DEAE Fractogel и TSK G4000/3000, а также по чувствительности к каптоприлу и тиорфану. Остальные 20% энкефалиназной активности приходятся на диамино- и дикарбоксипептидазы. Причем диаминопептидаза не ингибируется, а даже активируется вышеуказанными синтетическими ингибиторами. Дикарбоксипептидаза оказалась чувствительной как к тиорфану, так и к каптоприлу, причем ко второму - в более выраженной степени. Однако, несмотря на ингибиторный профиль, этот фермент оказался неактивным по отношению к ангиотензину I, поэтому он не является АПФ (Marini М, et al., 1990).
Открытым остается вопрос о присутствии в крови специфичных к Лей-энкефалину карбоксипептидаз. До сих пор не было обнаружено специфического карбоксипептидазного пути деградации Лей-энкефалина в плазме крови человека и животных (Marini М. et al., 1997; Hiranuma Т. et al, 1998), хотя показана карбоксипептидазная активность в отношении мет-энкефалина (Ашмарин И.П., 1998) и таких регуляторных пептидов, как кинины (11% от общей кининазной активности в плазме крови крыс (Ishida Н. et al., 1989). Присутствующая в крови карбоксипептидаза N, относятся к т.н. энкефалинобразующим (аргинин-специфичным) ферментам, которые отщепляют от Арг-Лей-энкефалина аргинин, никак не влияют на судьбу образованного ими пентапептида (Skidgel R.A. et al., 1984).
Большинство энкефалиназ существуют как в растворимой, так и в мембраносвязанной форме. В зависимости от этого их молекулярный вес варьирует от 70 до 200 кД. Энкефалиназы синтезируются внутри клеток и затем выбрасываются во внеклеточное пространство или экспозируются на внешней стороне клеточной мембраны.
Остановимся на локализации энкефалиназ. Также как и сами энкефалины, ферменты их деградации обнаружены практически во всех органах и тканях. Горенштейн и Снайдер (Gorenstein С, Snyder S., 1980) приводят данные о распределении в разных отделах мозга крысы энкефалиназ А и В, аминопептидаз и АПФ. Обращают на себя внимание значительные - 4-20-кратные различия в активностях энкефалиназы А и АПФ в разных отделах мозга. Наивысшая активность для этих двух ферментов представлена в стриатуме. В то же время обнаружено равномерное распределение активностей энкефалиназы В и аминопептидазы М, что может указывать на отсутствие существенной функциональной значимости этих ферментов в исследованных зонах мозга. В настоящее время основные данные касаются мембраносвязанных мозговых ферментов гидролизующих энкефалины. В легочной ткани и кровеносных сосудах изучается, в основном, АПФ (Лишманов ЮБ., Маслов Л.Н., 1994; Гомазков О .А., 1995).
Нет оснований для утверждения, что в расщеплении каждого из регуляторных пептидов участвуют какие-то специфические ферменты. Один и тот же фермент может участвовать в метаболизме нескольких пептидов. В таблице 1 приведены регуляторные пептиды, в деградации которых участвуют энкефалиназы. К ним относится большое количество известных ныне пептидов, участвующих в регуляции многих физиологических функций.
Так, например, аминопептидазы, гидролизующие энкефалины, участвуют также в гидролизе брадикинина, вещества Р, нейротензина, нейропептида-Y, тахикининов, натрийуретического пептида, цитокинов (Ашмарин И.П., 1999; Гомазков О.А., 1995). Lee СМ. и Snyder S.H.(1982) описали свойства дипептидиламинопептидазы III (энкефалиназа В), выделенной из мозга крысы (рН оптимум этого фермента составил 9), которая проявляет свою активность в отношении ангиотензиов и энкефалинов (Lee СМ., Snyder S.H.,1982).
В зависимости от условий, АПФ - фермент, превращающий ангиотензин-1 в ангиотензин-П, участвует в последовательном гидролизе энкефалиновой молекулы: сначала образует мет-энкефалин из предшественника Мет-энкефалин-Арг-Фен, а затем, отщепляя С-концевой дипептид, инактивирует его. АПФ также инактивирует вещество Р и брадикинин (Гомазков О.А., 1995), Р-эндорфин и динорфины (Parsons C.G., 1990).
Энкефалиназа А (нейтральная эндопептидаза) не ограничивается действием только на мет- или Лей-энкефалины, но гидролизует также брадикинин (Erdos E.G. et al., 1989; Гомазков O.A., 1995), вещество Р (Erdos E.G. et al., 1989; Waksman C, 1985; Lee СМ., 1988), натрийуретический пептид (Erdos E.G. et al., 1989), соматостатин (Lee СМ., 1988; Feindt J., 1997), цитокины (Erdos E.G. et al, 1989), ангиотензин I (Lee СМ., 1988), холецистокинин (Waksman С, 1985), нейротензин (Waksman С, 1985; Гомазков О.А., 1995), окситощш (Гомазков О.А., 1995). Кроме того, по данным Iwata N. с помощью нейтральной эндопептидазы происходит образование -амилоидного пептида, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера (Iwata N., 2000).
Исследование активности энкефалиндеградирующих ферментов
Мышей декапитировали, полученную гепаринизированную кровь (20 Ед гепарина на 1 мл крови) центрифугировали 10 минут при 1000g при 4С. Супернатант замораживали и хранили при температуре - 20С.
Головной мозг без мозжечка выделяли на холоду сразу после декапитации животных, замораживали и хранили при -20 С. Непосредственно перед использованием мозг размораживали и гомогенизировали в 25мМ Трис-НС1, 0.15М NaCl буфере рН 7.5 (37 С) (соотношение вес/объём - 1/8) в гомогенизаторе Поттера (тефлон/стекло).
. Получение сыворотки крови детей первого года жизни.
Взятие венозной крови детей первого года жизни осуществлял медицинский персонал Измайловской Детской ГКБ. Сыворотку крови получали в результате стандартной процедуры, включающей 30-мин. Инкубацию венозной крови при 37С с последующим обведением сгустка стеклянной палочкой и центрифугированием (1000g, 10 мин, 4С). Полученные сыворотки замораживали и хранили при -20С,
Получение плазмы крови взрослых доноров.
Взятие венозной крови проводили натощак в 8.30 - 9.30 утра. Непосредственное взятие крови из локтевой вены взрослых доноров осуществляли сотрудники кафедры МГМСУ.
В качестве антикоагулянта использовали гепарин (20 Ед на 1 мл крови). Полученную кровь центрифугировали 10 минут при 1000g при 4С. Супернатант замораживали и хранили при температуре — 20С.
Постановка ферментативной реакции.
Плазму или сыворотку размораживали и центрифугировали (1000g, 5 мин, 20С). Полученный супернатант использовали при постановке реакции.
Инкубационная смесь (конечный объем 50 мкл) содержала 10-кратно разведенную плазму или сыворотку крови, 25 мМ трис-HCl (рН=7,5), 0,15М NaCl, 1 мкКи (150 нМ) 3Н-Лей-энкефалина с удельной активностью 120 Ки/ммоль. Инкубацию проводили при температуре 37С и останавливали добавлением 5 мкл 0,2 М НС1. Для определения зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в инкубационную среду добавляли холодный Лей энкефалин в концентрации от 100 мкМ до 3.5 мМ. Время инкубации проб при определении значений времени полужизни Лей-энкефалина и максимальной скорости реакции составляло 15 минут.
При определении активности ЭДФ мозга инкубационная смесь содержала гомогенат мозга мышей в концентрации по белку 0.05-3.0 мг/мл.
Максимальную скорость реакции (Vmax) определяли при концентрации холодного Лей-энкефалина в инкубационной среде 1.5 мМ.
Энкефалиназную активность определяли по скорости накопления радиоактивных продуктов ферментативной деградации Н-Лей-энкефалина. Скорость реакции определяли по изменению относительного содержания радиоактивных продуктов гидролиза в общей радиоактивности реакционной смеси в единицу времени. Для разделения продуктов и субстрата реакции использовали методы тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
. ТСХ продуктов ферментативного гидролиза Н-Лей-энкефалина.
Для оценки общей энкефалиназной активности использовали метод ТСХ продуктов ферментативного гидролиза 3Н-Лей-энкефалина. В зависимости от типа используемых хроматографических пластинок его проводили, применяя одну из хроматографических систем;
1) Этилацетат:изопропанол:вода:уксусная кислота 40:40:1:19 для силикагельных пластинок (Merck, Германия) (Rf [Leuj-энкефалина составлял 0,54, продуктов гидролиза - 0,25-0,42) и силикагельных пластинок SILICA GEL 6061 (фирма EASTMAN, Kodak Company, США) (Rf: ЛеЙ-энкефалин - 0.75, продуктов гидролиза - 0,20-0,65) (Беляев и соавт., 1983 г.). 2) 2-Бутанон:трет-бутанол:аммиак:вода 2:2,4:1:1 для силикагельных пластинок Silufol, (Rf Лей-энкефалина составляет 0,8, продуктов гидролиза 0,10-0,68) (Золотарёв Ю.А.). В процессе подбора условий была установлена относительная длина пробега (Rf) «холодных» Лей-энкефалина и его фрагментов (Sigma, USA), которые проявляли 1% раствором иингидрина в ацетоне. На пластинках «Silufol» в системе 2-бутанон:трет-бутанол:аммиак:вода 2:2.4:1:1 она составила: для Лей-энкефалина - 0.8, Тир-Гли-Гли-Фен - 0.68, Гли-Гли-Фен-Лей - 0.67, Тир -0.53, Тир-Гли - 0.60, Тир-Гли-Гли - 0.55, Гли и Гли-Гли — 0.10 - 0.20. На пластинках «Silica Gel 6061» в системе этилацетат:изопропанол:вода:уксусная кислота 40:40:1:19 Rf для Лей-энкефалина составила — 0.75, фрагментов Лей-энкефалина — 0.20 - 0.65. На пластинках «Merk» в той же системе Rf Лей-энкефалина составила 0.54, фрагментов Лей-энкефалина - 0.25-0.42. 7 1 т Rf для равномерно меченных маркеров Н-Тир-Гли, Н-Тир-Гли-Гли и Н-Лей-энкефалина (любезно предоставленых сотрудником Института Молекулярной генетики РАН Ю.А.Золотаревым,), совпадали с Rf соответствующих «холодных» маркеров. Для разделения продуктов гидролиза Лей-энкефалина на каждую дорожку хроматограммы при постоянном подсушивании малыми лорциямии наносили по 2-5 мкл реакционной смеси и «холодного» Лей-энкефалина (0.4 мг/мл). Хроматографическую пластинку помещали в насыщенную парами камеру. Хроматографию проводили при комнатной температуре. После проведения ТСХ хроматограмму быстро высушивали в потоке горячего воздуха. На хроматограмме вырезали пятна, соответствующие маркерам (проявленным 1% раствором нингидрина в ацетоне), помещали их в сцинтилляционные флаконы, добавляли 0.4 мл воды для экстракции пептидных фрагментов из силикагеля и, после 30 минутного перемешивания, заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8. Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном спектрометре «Minibeta», (фирма LKB, Швеция). Эффективность счёта составляла 25%.
Каждую точку определяли как среднее из 3-5 независимых экспериментов. Концентрации продуктов гидролиза определяли по относительному содержанию радиоактивности в соответствующих пиках, с учётом удельной радиоактивности отдельных аминокислот, входящих в состав данных фрагментов. На рис.2 представлена типичная хроматограмма продуктов гидролиза Н-Лей-энкефалина в плазме крови человека.
Условия реакции для определения суммарной активности эпкефалиндеградирующих ферментов
На рисунке 4 приведены типичные кинетические кривые распада Лей-энкефалина при различных разведениях плазмы. Протяженность линейного участка кинетической кривой зависит от степени разведения плазмы. Так при двукратном разведения линейный характер зависимости сохраняется в течение 2-3 минут, а 100% распад Лей-энкефалина наблюдается уже через 20 минут инкубации. При 10-кратном разведении плазмы, скорость реакции не зависит от времени на протяжении 25 минут, а выход кинетической кривой на плато, соответствующее полному гидролизу пептида, происходит более чем через 40 минут.
Приведенные на рис.4 данные получены при исходной концентрации Лей-энкефалина 0.3 мкМ. При более высоких концентрациях пептида протяжённость начального линейного участка кривой увеличивается. Поскольку на этом участке скорость распада Лей-энкефалина не зависит от времени, можно предполагать наличие псевдо-стационарных условий реакции, которые необходимы для того, чтобы кинетика распада Лей-энкефалина описывалась уравнением Михаэлиса-Ментен. 2.2.2. рН-зависимость ферментативной деградации Лей-энкефалина. Зависимость скорости реакции деградации Лей-энкефалина от концентрации субстрата и степени разведения плазмы.
Кривая рН-зависимости (рис.5) в диапазоне рН 5.5-9.0 имеет кол околообразную форму, причем интервал рН, при котором наблюдается максимальная активность ферментов, соответствует значениям 7.4-7.6, то есть физиологическим значениям рН крови. Поэтому далее в исследовании использовали рН 7.5.
При исследовании зависимости скорости гидролиза Лей-энкефалина ЭДФ плазмы крови от концентрации субстрата в инкубационную среду, параллельно с фиксированным количеством меченого пептида (0.30 мкМ), добавляли «холодный» Лей-энкефалин в концентрациях, возрастающих до 3 мМ (см. рис.6). При высоких разведениях плазмы (1:8 и 1:10) линейный участок кривых насыщения наблюдается в пределах концентраций субстрата от 0 до 0.4мМ, а выход кривой на плато, соответствующее максимальной скорости реакции Vmax, происходит при концентрации Лей-энкефалина более 1.0 мМ. При более высоких концентрациях ферментов насыщение в использованном диапазоне концентраций субстрата не достигается.
Таким образом, подобраны условия для определения выбранных параметров активности пол и ферментной системы деградации Лей-энкефалина в плазме крови: 10-кратное разведение плазмы, время инкубации проб в течение 15 минут, концентрация меченного Лей-энкефалина равная 0.3 мкМ при определении i\i2 и концентрация «холодного» Лей-энкефалина равная 1.5 мМ при определении Vmax , рН равное 7.5.
Кроме того, установлено, что применение ЭДТА (3 мг/мл) в качестве антикоагулянта при взятии крови приводит к снижению общей активности ЭДФ плазмы крови на 20 - 30 % по сравнению с гепаринизированной плазмой. Поэтому в приведенных исследованиях в качестве анти коагулянта использовали исключительно гепарин.
Активность эдф у линейных мышей c57black/6 и balb/c различающихся фенотипом эмоционально-стрессовой реакции
На рисунке 9 представлены типичные кинетики гидролиза Лей-энкефалина в плазме крови мышей двух линий. При двух- и пятикратном разведении плазмы крови у мышей обеих линий кинетические кривые имеют линейный участок на протяжении от 10 до 15 минут. При разведении 1:10 линейная зависимость сохраняется на протяжении 20 минут как у мышей С57Вlack/6, так и у мышей Balb/c.
Скорость гидролиза 3Н-Лей-энкефалина линейно зависит от степени разведения плазмы вплоть до разведения 1:5 (рис. 10). Поэтому в дальнейших исследованиях использовали 10-кратное разведение плазмы крови и 15-ти минутную инкубацию.
Скорость гидролиза Лей-эикефалина в плазме крови мышей линии Balb/c составляет 50+6 нМ/мии, а у мышей линии С57В1аск/6 - 38±5 нМ/мин. Таким образом, у мышей линии Balb/c, предрасположенных к поведенческим проявлениям тревоги, время полужизни энкефалина достоверно меньше, чем у более эмоционально стабильных, низкотревожных мышей С57В1аск/6 (1.94± 0.05, п=10, и 2.23+0.07 мин, п=10, соответственно, р 0.05).
. Определение активности ЭДФ в гомогенате мозга мышей линии Balb/c и С57В1аск/б.
На рисунке 11 представлена кинетика гидролиза 150 нМ Лей-энкефалина при различных концентрациях гомогената мозга мышей Balb/c и С57В1аск/6. Показано, что при концентрации белка 0,75 мг/мл количество образовавшихся продуктов гидролиза линейно зависит от времени инкубации на протяжении 30 минут как у Balb/c, так и у С57В1аск/6 (рис.11). При повышении концентрации белка от 1 до 1,5 мг/мл линейный участок кинетической кривой сокращается до 10-15 минут, после чего кривые начинают выходить на плато.
При концентрации белка равной 0,75 мг/мл. линейный участок кинетической кривой у мышей обеих исследуемых линий сохраняется на протяжении 30 минут инкубации.
Скорость реакции деградации Лей-энкефалина на начальном участке кинетической кривой линейно зависит от концентрации белка вплоть до 1 мг/мл (Рис. 12). В связи с этим, в дальнейших исследованиях использовали 15-ти минутную инкубацию и концентрацию белка в пробе 0,75 мг/мл.
Значение скорости гидролиза Н-Лей-энкефалина в гомогенате мозга составило соответственно 3,4 ± 0,3 нМ/мин на мг белка у Balb/c и 4,0±0,4 нМ/мин на мг белка у С57В1аск/6.
При поиске возможных межлинейных различий в активности ЭДФ мозга мышей, помимо ферментативной активности гомогената также изучали активность водорастворимых и мембраносвязанных ЭДФ. На рисунке 13 представлены типичные кинетические кривые гидролиза Н-Лей-энкефалина ЭДФ гомогената, а также мембранной и водорастворимой фракции гомогената мозга мышей Balb/c. Полученные кинетические кривые линейны на протяжении 30 минут, и позволяют рассчитать начальную скорость гидролиза в соответствующих фракциях.
В таблице 10 представлены значения удельной активности ЭДФ гомогената мозга мышей изучаемых линий и его отдельных фракций.
Таким образом, установлено, что около 60% активности ЭДФ гомогената мозга мышей обеих линий приходится на долю водорастворимых ферментов и лишь 40% на долю мембраносвязанных, при этом основная удельная активность (на мг белка) приходится на водорастворимые ферменты. Значение скорости гидролиза 3Н-Лей-энкефалина в обеих фракциях гомогената мозга мышей Balb/c достоверно не отличалось от значений скорости гидролиза у мышей линии С57/Вlack/6.
