Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор
1.1. Локализация энтеропептидазы 7
1.2. Структура энтеропептидазы 7
1.3. Активация проэнтеропептидазы 14
1.4. Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы 14
1.4.1 Структурные модификации в процессе активации трипсипогеиа 17
1.5. Специфичность энтеропептидазы 19
1.6. Использование энтеропептидазы для процесс и нга химерных белков 22
1.7. Вторичная специфичность сериновых протеиназ 23
1.8. "Энтеропептидазный линкер" -(Asp)4Lys- в составе природных белков 28
1.9. Роль ионов кальция в энтеропептидазном катализе
1.9.1. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы 30
1.9.2. Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз 32
II. Результаты и обсуждение 36
Глава 1. Структура и иерархия су'бстрат-связывающих центров энтеропептидазы 38
1.1 Первичная и вторичная специфичность энтеропептидазы в сравнении с трипсином
1.1.1. Первичная специфичность 38
1.1.2. Вторичная специфичность 41
1.2. Эффективность энтеропептидазы 51
1.2.1. Субстрат Z-Lys-S-Bzl 54
1.2. Модификация трипсина и трипсипогеиа для обнаружения доменов субстрата, взаимодействующих с SII-центром энтеропептидазы
1.2.2.1. ДФФ-трипсин
1.2.2.2. Ацетилированный трипсиноген
Глава 2. Особенности энтеропептидазного катализа
2.1. Лимитирующая стадия
2.2. Эффект ионов кальция
Глава 3. Пептидные субстраты как модели природных и искусственных белковых субстратов энтеропептидазы. Кальций-зависимый автолиз энтеропептидазы
3.1. Гидролиз "неспецифических"субстратов энтеропептидазы как модель автолиза
3.2. N-концевые пептиды мутантных катионных трипсиногенов человека K23R и D22G
3.3. "Неспецифический" энтеропептидазный гидролиз белков
3.4. Потенциальные и экспериментально обнаруженные центры автолиза энтеропептидазы
3.5. Физиологическая роль кальций-зависимого автолиза трипсина и тяжелой цепи энтеропептидазы
III. Экспериментальная часть
1. Материалы
2. Методы
2.1. Очистка энтеропептидазы
2.2. Определение белка
2.3. Определение активности энтеропептидазы
2.4. Определение активности трипсина
2.5. Определение кинетических параметров гидролиза синтетических субстратов
2.5.1. Определение кинетических параметров гидролиза Z-Lys-S-Bzl
2.5.2. Определение кинетических параметров гидролиза модельных пептидов
2.6. Изучения влияния ионов кальция на эффективность энтеропептидазного гидролиза
2.7. Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой 108
2.8. Получение апо-формы полноразмерной энтсропептидазы и ее укороченной формы 111
2.9. Получение ДФФ-трипсина 111
2.10. Получение ацетилированного трипсиногена 113
2.10.1. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на процесс активации трипсиногена энтеропептидазой 113
2.10.2. Определение влияния ацетилированного трипсиногена на гидролиз GD^K-Nfa энтеропептидазой 114
2.11. Гель-электрофорез 114
2.12. Масс-спектрометрический анализ 114
Выводы 115
Список литературы 116
- Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы
- Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз
- Вторичная специфичность
- Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой
Введение к работе
Важная роль в организме принадлежит высокоспецифическим протеиназам, которые имеют ограниченное число физиологических субстратов, гидролизующихся по определенной пептидной связи. Примерами подобных фермент-субстратных пар являются ренин и ангиотензин, химозин и казеин, плазмепсин (аспартатная протеиназа из малярийного плазмодия) и гемоглобин, тромбин и фибриноген, энтеропептидаза и трипсиноген. В связи с развитием методов генной инженерии большое значение приобретает использование высокоспецифических протеиназ в качестве инструмента для точечного расщепления химерных белков по определенной пептидной последовательности (линкеру), отвечающей специфичности соответствующей протеиназы. Подобные высокоспецифические протеиназы мы назвали "белковыми рестриктазами".
Высокоспецифические протеиназы характеризуются сложной структурной организацией и содержат помимо каталитического и первичного субстрат-связывающего центра, многочисленные домены с определенными функциями'. Изучение регуляции активности таких ферментов заключается в понимании сложного механизма, по которому удаленные друг от друга домены согласованно определяют высокую эффективность и селективность катализа.
Энтеропептидаза (энтерокиназа) (КФ 3.4.21.9) была открыта в 1899 году в лаборатории И.П. Павлова, который особо подчеркнул ее значение для организма [1,
Энтеропептидаза - высокоспецифическая протеиназа процессинга -находится в начале каскада реакций активации проферментов пищеварительного тракта. Нарушение нормального течения этого каскада может приводить к преждевременной активации проферментов в поджелудочной железе, что, в свою очередь, приводит к тяжелейшему заболеванию панкреатиту.
В данной работе было проведено исследование особенностей структурнсЧ организации энтсропептидазы и ее ферме! ггативных свойств методом субстратного анализа. Проанализированы как независимые свойства доменов, так и условия, при которых проявляется их взаимное влияние.
Трипсиноген - физиологический субстрат энтеропептидазы
При определении полных аминокислотных последовательностей генов, кодирующих энтеропептидазу человека [16, 34], свиньи [22], быка [16, 20], крысы [21] обнаружено, что данные проферменты синтезируются в слизистой дуоденума в виде предшественника, состоящего из 1035 аминокислотных остатков [16]. В ходе активации проэнтеропептидазы происходит расщепление между тяжелой и легкой цепями на участке, содержащем последовательность -Glu-Val-Ser-Pro-LysIle-, которая может быть распознана трипсином или другими трипсиноподобными протеиназами. Кроме того, в ходе активации происходит, по-видимому, отщепление N-концевого гидрофобного сегмента (VaI19-VaI47), который, как предполагается, выполняет функцию мембранного якоря, посредством которого молекула энтеропептидазы связана с мембраной энтероцитов [16]. Механизм активации проэнтеропептидазы точно не известен, однако, для энтеропептидазы свиньи [22] и быка [35] показано, что зрелый фермент начинается с N-концевого SerllS.
Наиболее возможными активаторами проэнтеропептидазы в организме являются трипсин [36] и дуоденаза - протеолитический фермент эпителиоцитов Брунноровых желез слизистой дуоденума [37]. Причем трипсин активирует предшественник энтеропептидазы в сто раз более эффективно, чем дуоденаза. Однако, наряду с этим, нужно отметить, что существуют данные, указывающие на автоактивациию рскомбинантной легкой цепи энтеропептидазы в процессе хранения при температуре -20С [38].
Процесс активации трипсиногена может осуществляться двумя путями: под действием трипсина (автоактивация) [4] или же при участии физиологического активатора трипсиногена - энтеропептидазы [5]. Активация трипсиногена быка происходит путем отщепления короткой N-концевой последовательности Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-, т.н. активационного пептида трипсиногена. В таблице 1 приведены активационные пептиды трипсиногенов ряда организмов.
Установлено, что преждевременная активация проферментов в поджелудочной железе приводит к такому тяжелому заболеванию как панкреатит. Таким образом, автоактивация трипсиногена становится нежелательна и должна быть сведена к минимуму. Из приведенных а табл. 1 данных следует, что в процессе эволюции постепенно сформировался такой аминокислотный состав активационных пептидов трипсиногенов (как это видно у млекопитающих), при котором трипсиноген менее всего подвержен автоактивации. И, действительно, эффективность активации трипсиногена трипсином значительно хуже (на четыре порядка) соответствующей величины для энтеропептидазы [3, 39]. Активационные пептиды трипсиногенов бактерий и грибов не содержат остатки Lys или Arg в положении PI. Следовательно, они не обладают способностью к автоактивации. Хотя трипсины бактерий и грибов значительно отличаются от панкреатического трипсина млекопитающих, они могут гидролизовать пептидные субстраты, содержащие аргинин или лизин в положении Р1. А также ингибируются типичными трипсиновыми ингибиторами [40]. Другие виды позвоночных содержат остатки Lys или Arg в положении Р1 и способны к автоактивации. В настоящее время остается неясной причина эвлюционного развития способности трипсиногенов к автоактивации, хотя можно предположить, что на ранних стадиях эволюции данный механизм являлся единственно возможным для активации трипсиногена [41].
Известно, что остатки лизина и аргинина по-разному связываются в Si-субстрат-связывающем центре трипсина, что приводит к 5-10-кратному предпочтительному гидролизу аргининовых субстратов [42, 43]. Из табл. 1 следует, что у большинства видов позвоночных в положении Р1 акти ваци он ного пептида трипсиногена Arg отсутствует. По-видимому, наличие остатка лизина в положении Р1 сводит автоактивацию трипсиногена в панкреасе к минимуму. С другой стороны, мутант K23R катионного трипсиногена человека (в соответствии с нумерацией трипсиногена человека) активируется энтеропептидазой значительно более эффективно, чем трипсиноген дикого типа [41]. Возможно, даже незначительное увеличение автоактивации трипсиногена в поджелудочной железе может быть потенциально опасным для организма, при этом небольшое уменьшение аффинности энтеропептидазы не оказывает заметного влияния на процесс активации трипсиногена, благодаря ее высокой каталитической активности и значительному содержанию в дуодснуме.
Сравнительный анализ активационных пептидов трипсиногенов показывает, что последовательность Asp4 строго консервативна в активационных пептид:-х трипсиногенов млекопитающих [41]. Активационные пептиды трипсиногенов насекомых и ракообразных не содержат кислый остаток непосредственно перед Lys-или Arg-Pl. Аминокислотные остатки аспарагиновой кислоты постепенно появляются в составе активационных пептидов трипсиногенов в ходе эволюции позвоночных: два остатка у морской миноги, три или четыре у рыб, амфибий, и птиц, и строго четыре у млекопитающих (табл. 1). С увеличением числа остатков Asp, предшествующих расщепляемой связи Lysl5-Ilel6 (химотрипсиновая номенклатура) уменьшается способность трипсиногена к автоактивации.
Интересным исключением является примитивное позвоночное Squalus acanthias, содержащее мотив Asp4.
Мутации активационных пептидов трипсиногенов, вызывающие развитие панкреатита, представлены в популяции редко встречающимися аллелями, которые постоянно выбраковываются. Однако фиксированные замены ключевых остатков активационного пептида трипсиногена могут приводить к появлению новых функций, несвязанных с пищеварением [41].
Эффект ионов кальция на энтеропептидазный гидролиз
Влияние ионов кальция на эффективность катализируемого энтеропептидазой гидролиза субстратов разного типа до сих пор оставалось не очень понятным; для разных субстратов разными авторами были получены не согласующиеся результаты [56]. Так, активацию трипсиногена необходимо проводить в присутствии ионов кальция для предотвращения автолиза трипсина; ранее было обнаружено, что низкие концентрации кальция (1-2 мМ) повышают эффективность энтеропептидазы по отношению к этому ее природному субстрату [129, 133], а высокие ( 1мМ), напротив, ведут к ингибированию активации [134]. " Баратти и Маро [13, 59] показали, что вторичный субстрат-связывающий центр энтеропептидазы (S2) содержит кластер положительно заряженных аминокислотных остатков, взаимодействующих с отрицательно заряженными Р2-Р5-остаткам и аспарагиновои кислоты активационного пептида трипсиногена; высокая ионная сила замедляет активацию трипсиногена за счет резкого возрастания Кт. Нейтрализация ионами кальция теоретически также должна препятствовать связыванию Р2-Р5 с ферментом, и, таким образом, кальций должен обладать ингибирующим эффектом.
Однако Грант и Хермон-Тейлор [114] на примере синтетического субстрата /?-нафтиламида глицил-тетра-і-аспартил-і-лизина (GD4K-Nfa), также содержащего четыре остатка аспарагиновои кислоты в положениях Р2-Р5, наоборот, обнаружили активирующий эффект ионов кальция: гидролиз GD -Nfa энтеропептидазой человека при рН 8,4 в присутствии 10 мМ Са был в три раза быстрее, чем при содержании Са + 0,1 мМ. Этот эффект был в основном вызван уменьшением Кт (табл. 4). Неожиданным является при этом совпадение этого активационного эффекта иона кальция на гидролиз субстратов с кластером отрицательно заря жен ньіх аминокислотных остатков в положениях Р2-Р5 энтеропептидазой с обнаруженным Абитой и др. [39] и Делажем и др. [135] аналогичным эффектом в случае трипсина. В этих классических работах показано, что неблагоприятное влияние четырех остатков аспараги новой кислоты в Р2—Р5-положениях активациопного пептида трипсиногена натрипсиновый гидролиз, вызванное, по-видимому, негативным электростатическим влиянием на связывание остатков Arg/Lys в положении Р1 с Sl-центром, несет важную физиологическую роль - предотвращение нежелательной автоактивации трипсиногена. Авторами [58] было обнаружено, что при наличии как минимум двух остатков Asp в Р2-РЗ-положениях субстрата связывание иона кальция этими остатками в три-четыре раза уменьшает значение Km, не влияя на kcat.
Трипсиноген содержит два кальций-связывающих центра [136]: один, центр высокой аффинности (рКса2+ = 4,5 [137]), совпадает с аналогичным центром трипсина (кальций-связывающая петля Glu70-Glu80) и обеспечивает стабильность молекулы к автолизу, а второй центр, более низкой аффинности (рКса2+ 2,2) [137], расположен в области четырех остатков Asp активационного пептида и регулирует автоактивацию. При этом характер регулирования процесса автолиза и автоактивации ионами кальция носит противоположный характер: связывание этого иона (4 мМ) первым центром препятствует гидролизу связи Arg 117-VaI 118 (автолизу), и, наоборот, насыщение ионами кальция второго центра (50 мМ) промотирует гидролиз связи Lysl5-llei6 (автоакти вацию).
Таким образом, обнаруженное Абитой и др. [39] промотирующее влияние 50 мМ Са на гидролиз субстратов, содержащих последовательность -(Asp)nLys-; n = 2-4, соответствует насыщению второго кальций-связывающего центра трипсиногена, который, как предполагается, состоит из двух остатков аспарагиновой кислоты (Asp 13 и 14), ближайших к гидролизуемой связи Lysl5-Ilel6 трипсиногена, и вполне логически объяснимо с точки зрения электростатических взаимодействий.
Тот факт, что трипсиноген, содержащий в активационном пептиде последовательность -(Asp Lys-, является очень плохим субстратом трипсина, имеет важный физиологический смысл, - трипсин активирует все остальные ферменты пищеварения из их предшественников, кроме самого себя. В этом случае роль активатора принадлежит специализированному ферменту - энтеропептидазе. Только так возможно предотвратить активацию проферментов в поджелудочной железе и соответственно разрушение собственных тканей организма. С помощью этого тонкого механизма - каскада активации ферментов пищеварения - организм млекопитающих решает задачу расщепления белков пищи без разрушения собственных белков.
В противоположность трипсину, физиологическая роль энтсропептидазы ктк раз и заключается в высокоэффективной активации трипсиногена. Типичные субстраты энтеропептидазы содержат четыре отрицательно заряженных остатка Asp/Glu в положениях Р2-Р5 и одним из превалирующих факторов уникальной специфичности энтеропептидазы считается электростатическое взаимодействие этих остатков с вторичным центром (S2-Lys889) легкой цепи энтеропептидазы [19].
В этой связи, совершенно непонятным является промотирование гидролиза GD4K-Nfa при нейтрализации отрицательно заряженных остатков аспарагинові л кислоты [114], даже количественно совпадающее с аналогичной трехкратной активацией трипсинового гидролиза субстратов такого типа [39].
Кроме того, установлено, что наличие или отсутствие всей тяжелой цепи или ее фрагментов значительно влияет на гидролиз энтеропептидазой ее природного субстрата, трипсиногена. При этом укороченные варианты этого фермента практически одинаково гидролизу ют искусственные субстраты, содержащие последовательность -(Asp)4Lys-, будь они низкомолекулярными (GD K-Nfa) или же высокомолекулярными химерными белками (PrAD4K-P26) [33, 131, 132].
Уникальность именно иона кальция как активатора подчеркивается также тем наблюдением, что соли редкоземельных элементов (La, Pr, Nd, Tb, Но, Lu) являются эффективными ингибиторами катализируемой энтеропептидазой активации трипсиногена [138]. Ионы лантанидов эффективно связываются с тетрааспартилыюй последовательностью акти вацион ного пептида трипсиногена и ингибируют ферментативный катализ: І50 = 3,5-10 " М. Ингибирующий эффект ионной силы, также негативно влияющей на эффективность активации трипсиногена энтеропептидазой, намного слабее; для NaCl І5о 50 мМ [138]. Следует заметить, что концентрации солей лантанидов при этом также значительно ниже, чем требуется для обнаружения трехкратного акти вацион ного эффекта ионов кальция (50 мМ). При активации трипсиногена трипсином ионы лантанидов, наоборот, являются активаторами, также как и ионы кальция, и в этом случае также в значительно более низких концентрациях (1:100) [47].
Еще одним необычным моментом действия ионов редкоземельных элементов на энтеропептидазу является неконкурентный характер этого ингибирования [138]. Во всех вышеперечисленных случаях как активации энтеропсптидазного гидролиза ионами кальция [56], так и трипсинового гидролиза ионами кальция [39, 135] ии лантанидов [47], увеличение скорости ферментативной реакции происходит в основном за счет уменьшения величины Кт. Однако добавление солей лантанидов практически не влияет на величину Кт реакции активации трипсиногена энтеропептидазой, ингибирование происходит за счет уменьшения величины Vma)[ [138].
Вторичная специфичность
Специфичность таких сериновых протеиназ, как химотрипсин и трипсин, в основном определяется P1-S1 взаимодействием. В случае трипсина Asp 189, Gly216 и Gly226 образуют отрицательно заряженный S1-связывающий центр, ответственный за специфичность трипсина по отношению к субстратам, содержащим Arg и Lys в PI. Однако взаимодействие протеиназы с субстратом продолжается и за пределами S1-сайта и часто использует дополнительные центры связывания; с ферментом взаимодействует шесть-семь аминокислотных остатков, расположенных по обе стороны от гидролнзуемой пептидной связи, т.е. в РЗ-РЗ -иоложениях. Вторичные взаимодействия играют не очень значительную роль в специфичности химотрипсина и трипсина (хотя можно судить о тех или иных предпочтениях или, наоборст, невыгодности), однако заполнение этих центров в значительной степени повышает каталитическую эффективность фермента.
Для высокоспецифичсских протеиназ, к которым принадлежит энтеропептидаза, напротив, основным определяющим моментом катализа являются вторичные взаимодействия. В случае типичного субстрата энтеропептидазы это электростатическое взаимодействие четырех отрицательно заряженных остатков Asp в положениях Р2-Р5 субстрата с соответствующим 82-центром - остатком Lys8S9 легкой цепи фермента. Исследованные нами пептиды 1 и 2 (n = 4) (табл. 6) представляют собой такие типичные субстраты энтеропептидазы, низкомолекулярные модели природного субстрата этого фермента, трипсиногепа. Известный ранее синтетический субстрат GD4K-Nfa гидролизуется энтеропептидазой практически с теми же параметрами [132]. Эффективность же трипсинового гидролиза субстратов 1 и 2, напротив, достаточно низкая: kca,/Km = 5,0 мМ -мин"1 и 42-мМ 1-мин"1 соответственно. Такая же низкая эффективность трипе и нового гидролиза обнаружена и в случае GD jK-Nfa - по данным Гранта и др. [114] величину kcat/Km можно приблизительно оценить как 0,1-80 мМ -мин"1 (в зависимости от концентрации ионов кальция).
Известный экспериментальный факт, что отрицательно заряженные аминокислотные остатки (минимум два) в положениях Р2-Р5 исключительно неблагоприятно сказываются на эффективности гидролиза таких субстратов трипсином [39, 135], по-видимому, следует объяснить негативным электростатическим влиянием на связывание Pl-Arg/Lys с S1-центром. Данное явление имеет определенную физиологическую роль - предотвращение нежелательной автоактивации трипсиногепа.
Мы ввели для оценки профиля субстратной специфичности энтеропептидазы по сравнению с таким ферментом широкой специфичности, как трипсин (причем первичный субстрат-связывающий центр SI одинаков у обоих ферментов) величину селективности гидролиза каждого субстрата (ЭГТУТр): отношение значений kcat/Km энтеропептидазиого и трипсинового гидролиза (рис. 6). Таким образом, селективность гидролиза GD4K-F(N02)G и GD4K-Nfa энтеропептидазой по нашим данным, превышает три порядка. Еще выше селективность энтеропептидазного гидролиза (почти шесть порядков) природного субстрата энтеропептидазы трипсиногена.
Отмеченное выше более выраженное для трипсина, чем для энтеропептидазы, предпочтение остатка Arg в Р1-положении приводит к меньшей (как минимум, на порядок) селективности гидролиза, аргининового субстрата 3 по сравнению с лизиновыми (1 и 2).
Мы исследовали также особенности энтеропептидазного гидролиза субстратов с укороченным энтеропептидазным линкером - содержащих 1-2 остатка Asp/Glu, предшествующих Lys/Arg гидролизуемой связи (пептиды 4-12). Гидролиз субстратов с п 4 значительно менее эффективен, чем гидролиз типичны. энтеропептидазных субстратов (п = 4). Значения кса1/Кга для таких субстратов (за исключением лишь пептида 5) не превышают 10% соответствующей величины для высокоэффективных субстратов 1-3. Более подробно кинетика "неспецифического" энтеропептидазного гидролиза будет рассмотрена ниже (гл. 3), однако следует также заметить, что, как показано в гл. 2 ("Особенности энтеропептидазного катализа"), лимитирующей стадией гидролиза типичных высокоэффективных субстратов энтеропептидазы с n = 4 (например, 1-3) является деацилирование. Напротив, субстраты с п 4 гидролизуются энтеропептидазой с лимитирующей стадией ацилирования. Лишь в последнем случае приведенные в табл. 6 значения кинетических констант кса, = к2 и Кт являются истинными; для субстратов с кг к3 данные величины в общем случае являются эффективными. Поэтому для корректного сравнения эффективности энтеропептидазного (и трипсиновогс) гидролиза всего ряда изученных субстратов можно использовать только значения константы второго порядка к«а,/Кт.
Оказалось, что субстраты с п 4, различающиеся по количеству (один или два) и природе (аспартил- или глутамил-) отрицательно заряженных аминокислотных остатков, практически одинаково гидролизуются энтеропептидазой (пептиды 4, 6 и 7; 8, 9 и 12). То же касается субстратов, содержащих Arg или Lys в положении Р1 (10 и 11). В то же время более значительное влияние н эффективность гидролиза субстратов с п 4 оказывает общая длина полипептиднои цепи с обеих сторон гидролизуемой пептидной связи (Р2-Рп- и РГ-Рп -участки), а также природа аминокислотных остатков, заменяющих заряженные остатки аспарагиновой или глутаминовой кислоты в положениях РЗ-Р5.
Так, субстраты 8 (MLTAEEK-AA) и 9 (LTAEEK-AAV) содержат два-три аминокислотных остатка в области уходящей группы РГ-Pn , а субстраты 5 (LTAEEK-A) и 7 (MLTAEEK-A) - только один. Несмотря на то, что все эти пептиды - фрагменты р-цепи гемоглобина быка - имеют одинаковую аминокислотную последовательность в положениях Р6-РГ, эффективность гидролиза пептидов первой группы на два порядка превышает эффективность гидролиза пептидов второй группы (табл. 6). Такая же закономерность обнаружена для трипсинового гидролиза пептидов 6-9 (табл. 6). Эффективность гидролиза еще одной субстратной пары - 10 и 11, также лишенных Р2 -остатка, тоже достаточно невысока. При этом для каждой из исследованных субстратных пар 6-7 и 8-9 удлинение полипептидной цепи в области N-концевого фрагмента субстрата не приводит к повышению эффективности его гидролиза. Таким образом, эффективность энтеропептидазного и трипсинового гидролиза для субстратов такого типа определяется длиной уходящей С-концевой группы.
Определение лимитирующей стадии реакции гидролиза ряда синтетических субстратов энтеропептидазой
Очистку энтеропептидазы проводили по методу [33]. Все стадии очистки осуществляли при 4С. Слизистую двенадцатиперстной кишки быка (700-800 г) экстрагировали с 2,1 л 0,1 М уксусной кислоты, рМ 4,0, содержащей 1% тритона X 100 и 20 мМ СаСІ2, в течение 4 ч при осторожном помешивании. Экстракт центрифугировали при 17500xg в течение 30 мин. Супернатант разбавляли в 10 раз 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, содержащем 50 мМ СаСЬ (буфер А) и концентрировали ультрафильтрацией до 1,5-2 л ("Pelikon", Amicon). Белковый раствор смешивали с 300 г СМ-32-сефарозы, уравновешенной буфером А, в течение 15-17 ч при осторожном встряхивании. Целлюлозу восстанавливали центрифугированием при 3000xg. Супернатант концентрировали ультрафильтрацией до 0,8-1 л, доводили рН до 8,0 1 М Tris и добавляли NaCI и OG до концентрации 0,5 М и 1%, соответственно. , Последовательно соединяли три колонки, содержащие аффинные сорбенты 1 или 1А (20 мл), 2 (50 мл), и 3 (100 мл), соответственно, и уравновешивали 10 мМ Tris-HCl буфера, рН 8,0, содержащем 0,5 М NaCI, 50 мМ СаС12, и 0,1% OG (буфер В). Белковый раствор наносили на систему аффинных колонок; скорость элюции 5 мл/ч. Колонки промывали буфером В до отсутствия поглощения при 280 нм и предколонки 1 и 2 отсоединяли. Колонку 3 промывали 0,1 М формиатом натрия, рН 3,0, содержащем 0,1 М NaCI, 50 мМ СаС!2 и 0,1% OG (буфер С). Фракции, содержащие энтеропептидазу, объединяли, концентрировали ультрафильтрацией (Centricon-30, Amicon). Затем разбавляли в 100 раз водой и снова концентрировали вышеуказанным способом. Препараты энтеропептидазы хранили в 50%-ном глицерине при -20С не допуская замораживания.
Концентрацию белка измеряли по методу [170], используя набор Bio-Rad Protein Assay. В качестве стандарта использовали Ig G быка. Активность энтсропептидазы определяли из активации трипсиногена согласно методу [12] с некоторыми модификациями. За единицу активности принимали такое количество энтсропептидазы, которое продуцирует 1,0 нМ трипсина из трипсиногена в активационной смеси за минуту. Смесь содержала энтеропептидазу ( 0,03 Е/мл), ОД М ацетат натрия, рН 5,0, 50 мМ СаСЬ (буфер Д), и 50 мкл раствора трипсиногена (0,1 мг/мл 1 мМ НС1) в конечном объеме 0,5 мл. Активационную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37С. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М ПСІ. Триптическую активность 75-мкл аликвот из инкубационной смеси измеряли спектофотометрически на спектрофотометре GiIford-2400-2 (США) при 405 нм и 25СС в 1-см термостатируемой кювете по гидролизу субстрата BAPNA (1,14-10" М) в 0,1 М Tris-HCl буфере, рН 8,0, содержащем 50 мМ СаС12 (буфер Е) и 10% ДМСО в конечном объеме 1,5 мл. Степень автоактивации трипсиногена (не превышающую 5-10% от количества трипсина энтеропептидазного происхождения) брали в расчет при вычислениях. При постройке калибровочной кривой использовали известные концентрации трипсина, Молярность раствора трипсина высчитывали титрованием активного сайта Gdn-Bz-ONp. Концентрацию растворов энтеропептидазы определяли титрованием активных центров с использованием Gdn-Bz-OMum согласно [12]. В качестве стандарта использовали раствор трипсина, концентрацию активных центров которого определяли титрованием Gdn-Bz-ONp. Активность энтеропептидазы 100%-ой частоты в наших экспериментах составляла 1840 Е/мг. Активность трипсина определяли, регистрируя увеличение оптической плотности при 405 нм, 25С происходящее при гидролизе BAPNA с образованием р- нитроанилина. Реакционная смесь содержала 1,425 мл раствора BAPNA (1,14-10"3 М) в 0,1 М Tris-HCl буфере, рН 8,0, содержащем 50 мМ СаС12, 10% ДМСО и 5-Ю мкл раствора трипсина (1,085-10" М) в кварцевой кювете шириной 1 см. По калибровке, 1-Ю 6 М трипсина соответствует скорости гидролиза 0,0193 ЄД.Д405/МИН. Кинетические параметры гидролиза Z-Lys-S-Bzl энтеропептидазрй, препаратами легкой цепи энтеропептидазы (ЭП 784-1035), а также трипсином определяли спектрофотометрически, регистрируя увеличение оптического поглощения при 324 нм и 25С. Реакционная смесь содержала определенное количество фермента (0,2 нМ энтеропептидазы; 0,61 нМ легкой цепи энтеропептидазы; 0,65 нМ трипсина), 0,1 мМ ДТДП в 0,1 М Tris-HCl буфере, рП 8,0, в конечном объеме 1,5 мл. Концентрация субстрата изменялась от 2-Ю"5 М до 13-Ю 5 М. Начальную скорость гидролиза субстрата (шесть-восемь концентраций для каждо.о фермента, не менее трех серий) определяли непосредственно при 324 нм. Концентрации гидролизованнного субстрата были вычислены при помощи коэффициента молярной экстинкции Дз24, определенного при полном гидролизе известных концентраций субстрата. Измеряли увеличение оптической плотности субстрата (ДБз24) в присутствии 20 мМ ДТДП в 0,1 М Tris-IICl буфере, рП 8,0, до внесения фермента и после внесения фермента и измерения кинетики. Кювету оставляли на 10-12 часов до полного гидролиза субстрата. Найденное значение Дє при рН 8,0 составило 16067 моль" -см" . При определении кинетических параметров (Кт и kcat) гидролиза субстрата расчет проводили по методу Ейзенталь - Корниш-Боуден [171] (табл. 7). Ошибка эксперимента не превышает 10-20%. ВЭЖХ-метод, Инкубировали 0,25-10 мМ каждого пептида (0,01-0,5 мМ в случае GD4K-F(N02)G и G5DK-F(N02)G; 0,01-1,8 мМ в случае APFD4KIVGG, APFD4RJVGG и APFD3GKIVGG) с ферментом в 0,1 М Tris-HCl буфере, рН 8,0, при 37. Концентрация энтеропептидазы была 72,8 нМ (AT, ПЬ-(2-8) и ПЬ-(1-8)), 33,3 нМ [ПЬ (1-9)], 22,6 нМ (WDDRG, WDDKG и lib (2-Ю)), 1,96 нМ (APFD4RIVGG), 9,08 нМ (APFD4KIVGG), 21,75 нМ (APFD3GKIVGG) и 1 нм (G5DK-F(N02)G и GD4K-F(N02)G). Для трипсинового гидролиза применяли концентрации трипсина 2,5 мкМ (для ПЬ-(2-8)), 30 нМ (для lib (1-9)), 0,58 мкМ (в случае G5DK-F(N02)G) и 1 мкМ (в случае GD4K-F(N02)G). Константы гидролиза пептидов энтеропептидазой и трипсином определяли при инкубировании не менее шести концентраций соответствующего субстрата с ферментом. При определении значений k ,at/Km энтеропептидазного гидролиза субстратов Fib (1-9) и НЬ (2-10) использовали низкие концентрации субстрата- 10"5-10 4М ([S] Кт). В определенные интервалы времени, соответствующие не более 20% превращения каждого субстрата, отбирали из инкубационной смеси по 6-8 проб (2-5 мкл; 5-; 20-мкл в случае APFD4KIVGG, APFD4R1VGG и APFD3GKIVGG), разбавляли в 10-25 раз 0,1%-ной (10-50% для APFD4K1VGG, APFD4RIVGG, APFD3GKIVGG) TFA и хранили при температуре -70С. Анализировали состав аликвоты с помощью ВЭЖХ в 0,1%-ной TFA на колонках Nucleosil 7/С8 (4x250 мм) («Macherey-Nagel», Германия), градиент ацетонитрила 0-60%; Nova-Pac С8 (3,9x150 мм) («Waters», США), градиент ацетонитрила 0-40% за 35 мин; скорость элюции 1 мл/мин; Luna СІ8 (2x250 мм) («Phenomenex», США), градиент ацетонитрила 0-60%; скорость элюции 0,3 мл/мин (рис. 14, 15, 16). Начальную скорость реакции рассчитывали по соотношению площадей пиков субстрата и одного из продуктов; поправку на разницу в молекулярном оптическом поглощении при 222 нм вносили после полного гидролиза. Для доказательства структуры продуктов гидролиза собирали аликвоты индивидуальных пиков и анализировали с помощью масс-спектрометрии (MALDI).
