Введение к работе
Актуальность проблеми. В настоящее нремл яелуяан роль фотосинтеза н продукционном процессе не пизнвает сомнскчЛ п доказана большим зхопориминтальнкм материалом ( Пишпорорич, ±УЫ',, i
D настоящее проми одним из нажноПніх механизмов регуляции метаболизма считается образование динамических муло:.-'.-(Jojjmchmux анеамблеЛ-аеооцилтов, составлявших голмолокудяр-нн?. уровень организации Лермонтов ( 1>рплрих, I9EG; Кургане^, 1986, 1989, ІУ9І, ІЖ; .{чпрельліт, 19VI<; Каган, 1;*.9; Ермаков, 1923 ). 'Лсследонание надмолекулярной" организации «{ормвн-tod различных метаболических путеїі является основної! тенденцией современной зилимологии.
Вопрос о возможности образования ассо:іпатов РБКО робко, но все-таки обсумлзлел п література. Наибольшего анлмакня заслуживает предположение о существовании з стромо хлороп-ластов тройного комплекса рзрментоз, состо-гцего из Г.П, ?РА, и РБ*ЯО, которое высказывалось рядом авторов ( Р'.ч»гкэгяку , лпеког , 19G1; :>.:;.-;:.-.;/ -t а) ., '-<ь; А:<%/и , 1970; p.-it -.,..- , 1^70; ;--,т!- і --'72; Романова, 197.), 12:75, Г.-'ЗІ ). .U: :ег=лт-льно, >'-л5,гз->ат-з.тьноо цо-іствио этих ^орм^чтоз мо*.-
но определить по фиксация L< С бикарбоната в присутствии Р5' и АТФ ( Ларичева и др., 1S67 ). тго*т С 1965 ) обнаружил, что суммарная реакция ферментов сохраняется в процессе очистки РБ1>К0 длительное время, sainiu « сотрудниками в IS8G г. ііз листьев гороха, в ІУ8У г. из листьев шпината наделили комплекс ферментов Рч'П, ч>Рл a PDvKO. Gqntero с сотрудниками t 1938 ) выделили из хлорйплаотов шпината функциональный муль-тиформентіш.1 кошілекс, проявляющий пять ферментативных активностей цикла Кальвина. мультиферментішіі комплекс ферментов рлбозофосфатизом?разы, фосфорибулокинази и рибулозобисфосфат-карбоксилазы-был выделен из листьев хлопчатника и было установлено, что по своей природе этот комплекс является структурно-функциональным ( Бабаджанова, Насыров, 1992 ).
Образование комплексов имеет важный биологический смысл 'между функционально связанными ферментами, у которых при ассоциации достигается увеличение эффективности протекания сопряженных реакций вследствие прямой передачи метаболита с одного активного центра на другой; моментальная утилизация образующихся продуктов в сопряженных реакциях обеспечивает термодинамические преимущества ферментативных реакций, протекающих в комплексе I Нэградона, Муронец, 1985 ). Таким образом, очевидна актуальность и необходимость лес ледова ни?, структурно-функциональных особенностей и механизмов регуляции различной сложности диьамичоских ферментных систем с помощью кинетических и биохимических методов.
На основаїши вышеизложенного била сформулирована цель настоящей работы: изучение структурно-функциональных особенностей мультиферментного комплекса цикла лальвина. Кроме того, предполагалось исследовать механизмы функционирования и реі'уляции актлвности этих (іермектоз в различных олигомер-ных состояниях и выявить особенности каталитических свойств свободных и организованных в комплекс ферментов кинетическими методами, а тлкхе определить ионпзируюиу.еся группи активного центра ферментов и ооль сульфгидрильных групп, принимающих участие б каталитическом акте рибоэофосфатизомеразной, фос-форибулокиаазной и рибулозобисфосфаткарбоксилязьоД реакций.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить елвдугаде ііксЕирк...еатальнио задачи:
-выделить электрофоротически гомогенные :!;;опараті: фер.,кц-тов Pvll, ФРК і! РБ'МО, получить субъединицы изучаемых формэитов, определять величину их молекулярних масс, а тзкпо і::г.;г;лить комплексы этих ферментов ;
-определить у выделенных ;<о;,і:ло;'.сот .iep-:sHT!-.y" ппепэрз-тов наличие каталитически}' активностей ферменте;.' "и:;ла Лаль-вина ;
-исследовать регуляции аминокислота:.::! и мэтзбо;-:гт',:.,л цикла Калышна активности PwII и *Р.\, а такте зг.соц:!ЗТ"впце возможности субъедпкп; РчИ при діглоризацин';
-исследовать влияние ркбулозебгефосфзтз I IT'' ) - субстрата карбокснлазноЛ рсакп;:;; га рпбозефосфатлзомерззпуо тл:::г-ность различных ферментных препаратов, а тглеже влияние глб::~ зо-5-фосфлта ( ?54> ) - мотаболптг-аред'иественника на 1\хтл;>~ нссть ФРК ;
-исследовать влияние рН на активность ферментов и рслъ оульфгидрильных групп, определить кх количество, изуч',г;ъ субстратную стабилизацию судьфгидрилышх групп актппнчх центрез РФИ и №\;
-провести кинетические исследования і":р:^::~аг:;знь'х активностей мультиферментных ЯОМПЛСлООЗ.
Научная новизна к практическая значимое??, работ;;.
В работе развинтится новые представления о фзруонт.*"; цикла Кальвина - рибозофосфатизег.юразо, фосфор;5булон;-назг, -л рибулозобисфосфаткарбоксалазе.
Впервые выделен из листьев хлопчзтнпкэ сорта І0В-Ф т-у.'гь
ТИферМОНТННЙ КОИПЛЄКС О МОЛеКуЛЯрНОІІ МЗССОЙ 5R0 КДз, Гф;/;ІВ~
ляющиЯ шесть ферментативных активностей - рлбозофосф?.тп:-.е.-,г~ разную, фосфорибулокиназнуи и рибулозобисфосфаткарбсксилазнуя, а также фосфогл/цераткиназкую ( ФГК, 111/ 2.7.2.3 ), гллперзль-дегидфосфэтдегидрогеназнуи { ГА'РД, !К> 1.2.1,13 ) и фруктозо-бисфосфатазную С ФБ^г, liv 3.1.3.II ). Проявлений шести яхткл-ностой ферментов цикла Кзльвинз позволяет назвать этот комплекс мультифе^мептімм ко:лллексо:л-зесоцнато* цикла Кальвина. Впервые ;:з листьев хлопчатника виде ієн днухфврмэнтннл комплекс Рі'И-і.'РіІ v 2х^л ). іЗиделон.-і!:;; кошіекс обладает ;.:о-ле/.улярно.і .7.3000.; 1ьО к.із и состоит из трех идентичных субь-одикиг. с :.:оле.:уллр:го;: .uccoii СО .<.",а. :Го;м;ио[Шс температуры
4 инкубации ира денатурации позволяет получить модифицированные субгедашщи с молекулярной массой 52 кДа, Выделенный комплекс проявляет три 'іорментатяшше активности : рибозофосфат-иэо-леразнуы, фосфорибулокиназнув и рибулозобисфос±аткарбокси-лаэнуи.
Впервые установлене, что 4ерлантішо препараты с различной молекулярной массой - 52, ІВ0, 240, 400, 4Ь0 и 520 кДа проявляют по три аналогичные ферментативные актиьности : рибо-зофосфатизомеразную, фосфориоулокиназную и рчбулозооисфосфзт-карбоксилазную. Ото дает основание считать, что ^.ергленти цик-ла Кальвина существуют ь различной tjop-ло - стабильных мульти-ферментних комплексов и динамических комплекс.ов-лссоциатов.
Определены значения рН, при которых происходит ионизация аминогрупп у ферментов РОИ, OR' и РБ^О. Результаты изучения влияния рН на максимальную скорость и .^, катализируемых зти-мл іер.Льііта.'уШ реакций, дают основание очи гать изменение значений рН сигналов для образования i^up ле нт—оу ^ctj <:і тни к комплексов и поддеропил специфической каталитически активной коїЦор.лациі) ферментов. Следовательно, величина рН является регулирующим фактором, обеспочинаюцим настройку активного центра фермента на начальні:!! зтап - еі изивание с субстратом и послонункіие конформационные изменения, необходимее для осуществления каталитических актов.
Определены различные по своей природо, функционированию и местоположению сульфгидрильные группы ферментов. Очевидно, что в осуществлении катализа принимают участие только быстро-реагируюдне сульфгидрллышв групгш. Суйъодиница Pill содержит одну сульггидрнльную группу, п для фермента 'Poll, субьедшшцы ОРК и большой субъединицы РБілО при проведении каталитических актов требуются по дзе сульфгидрильные группы.
Обнаружено защитное действие субстратов активное га суоъ-едшшц Pill, .Jep,:eii-roH РК1 и 1РК і:ри ипі'иоиі оьании суль|гид-ральних групи 5(5»-длтиоо;:с;С-нитроснкзоатои) { ДЇЇЇЬ ). Сравнение степеня защитного действия "ри0030-5-tocJaTd и риГ.уюэс-б-фооіать { Py5w ) на воестановлешіе іосіори^улоликазной активности ГРК доказало, что большой эффективностью обладает рийозс-5-іосфат.
Іія осчовннии асуча^'я соотношения ста: сни їл-.гл*л\\ лпния
СуЛЬфГИДрИЛЫШХ ГруПП,ГіаЩЛТІІОГО '3;1,;,М;?.'- СуСЛТр.:..'^ .1 Я.''Л;1К!.ч
их на восстановление цюртаит&тлвплЛ м: :-л.;<сл: pv.." ; ;.;)oc;'y;~ изоморази и ^ос'іоріїбулокинаии іш..-рв;;о су v .;--. ;:-.:. :rv. .'.:..;.'. у участив сульфгидрлльних групп, расі-'О/тг:;:-?-.l^il- -: ;: ,' :::.,... центрах ііермшггоЕ, со степенью аллос.^ріі';.--:!>: .; -.::<:: ..^.::--'mz взаимодействий, а также .охашізг:,.: s:.i;-z,vi.*
Обнаружена рогуляцкя но тлпу обр:.г.:е:< '"- ' -' ::.-j.",:-ъс-::-:-фосфатом рлбозо'І'ОС-іатнзомсрззноІ! ^:-:::-.1.::,:-: с:\:;:': -і.. уЛ ?;: :~ ішц Pvll, 2хМ И ор:.'.-лглых npcnapvr : І1.',., '-і.' :: і -.'-,, ".:-.:.-нол особенностью тлсого мохлнлзт! ;'-:ь'7/,-г"!.'г. :.-лу..-:".г -.;.-: іїіїє тройного г.оглілі-хсз >іор.-оч7-'::;.'. у..:-:::іга:->;, г;;:. 11- '!--ляетсл пэло;;:лтельпам "оду^іто;;;:.' у vy.loc;^T;!30',iopi3i(0.t '.",-тдвіюсти. Даниил .-лзханпзм рогу: :у:;: ::'.г: включаться лл.і :>: ключдтьсл б злізмозмлст;: от с.-... -..:..--:.:.- лощецура.,.:.1 ?о* .; РБі> і! числа 1|упк!;лониру;уулх ікг:л:;!<:' : лллос:т';;);п^с.<::х ;;'"-: ''
В C00T3E0 раЗЛЛЧНИХ pop:.» -:іир,.'."!ГГ;)В.
Иперішо установлена коорА!:н::рз;:.!НН.-:; -:.:?;:л=ул, ::о;';,.;;'~ локнназной актишюо'Гл vPX і.:ета6о;пг:см-:;г;,;;:г ..-;';.;.:..::; : J". '. Доііствуя как аллосторлчоскліі rvlio.rrop, ;';.: осу.. ,-.; ;..!: - -;у-ляции непоерздсгвоіто сппзивплеь с лллг/уу " -;.".<:: ,..;!,;/ . uPrt. Уеоліічшшо іосЛорлбулог.піі'^зпг:-: ciira.-Vtiocv:; г.: :-.; ;:.;: :-исладстааа кон^ормациопних nopucvpe-.h: хо.гьу^хі .; .-:.-7:-:и'::;. ;-. заіших с полощітельниги: аллостор;:чоаі:і-::.'і кгі.; о:р.:-:;:, .- . -...- мотропнимл кооперативним;! нза;і:,:одолеть;:)Г.и а-:тл."нпх ;: .:.v:'----терлческнх цонтрав <1.ерм-эптси.
Линотнчоскио исследопліш tl<3p..'.QHTa?,u?iiL';: х-:.-i!-\-:.-.:: мульті!-і:ср:;.ентішх комплексов п црисутстм'Д су5стї,-.::н ' :::-. : :: обнаруклтъ функциональные свойства, хлрлхтор.'ічо д-v: »..у/,:.?.;Ь;р-ментішх комплексов - іізллчио "нанрзвленіїого" треаосз ^v.vq» точних мета болдтов, "облегченного катал.: за" з и.осуленг ; -г п>: регуляторних эффектов, а тлку.є аллост«р;г<>зскуь роу.л-лл л,;гі:з-ности, осуществлямцуюся на уро t-з рд-іл/.чних :;о^!1."-з,<-,:с.- <: іуі'.-.ео-цизтивішЛ моханлз;* уогу.гВДії ні у;.и;;.і-.- :<зм::л'.:кпо;:~ллсО:ЛаїЗ!і,
Лолучепнио результати позполліл: -.і\і:.-і";ь мл;~-д о оу.;о'.тіг— ь.інни -Іор.'зні'оБ :ui:<."j :іллььй:п ь рззл,ри.** ;с-{-і:іл - а.г-.'одлой, стасильніх .іуль?лі«і;':,:.знт.^х кзмлл.;.-;;.г,з, длгЦ'/ичч^к;-;>: и/.иги-1вр'.!і'Нтн.;х .охпєксок-з^.о.-иітой л мотл^олэкз. Сул-^гко^лкгл tc-pv.0HTOh ,:л.<ла лілі.»ияз в ргізллч,ч..х {ор',их :-к-о<І7^л,-:»"і д.тя
реализации регуляторних механизмов разных уровней.
Полученные наш и имеющиеся в литература экспериментальные дэнные обобщены в виде схемы иерархии механизмов регуляции активности различных форм последовательно действующих в цикле Кальвина ферментов.
Результаты проведенных нами экспериментальных исследований представляют ' научный интерес для развития теории ферментативного катализа, теоретических и прикладных аспзктов япліскернол знзи:.'.ологик и биотехнологии, разработки тест-систем на зысокоактивный фотосинтетический аппарат для генетико-сеяек-ционных работ по вызедению высокопродуктивных форм растений. Объединение ферментов цикла Кальвина в мультиферментіше комплекси значительно сокращает объем генетико-селекционных работ, так как возрастание каталитической эффективности одного из них инициирует повышение каталитической эффективности других ферлентов.
Апробация результатов исследований. Основные результаты работы былл доложоны или представлены на ІУ Всесоюзном биохимическом съезде ( .Ленинград, 1979 ), на П,ШДУ,У Конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана (. Фрунзе, 1976; Душанбе, 1981; Ашхабад, 1906; Ташкент, 1991 ), на Всесоюзных совещаниях: "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе" ( Пущина, 1981 ), "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С^-растениях" ( Таллинн, 1983 ), "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе" ( Пущкно, 1985 ),на Всесоюзном научно-методическом семинаре "Результаты и перспективы использования модельного растения арабидопсис в космических исследованиях" ( Душанбе, 1986 ), на П Всесоюзном съезде физиологов растений ( Минск, 1990 ), на Международной конференции "Итбги и перспективы энзимологических исследований метаболизма углерода при фотосинтезе" ( Душанбе, 19'Л ,, на конференциях молодых ученых и специалистов Таджикистана ( Душанбе, 1980, 1984, 1985 ), на Конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского государственного университета ( Душанбе, 1987-1996 ), на заселениях научных обществ Физиологов растений Таджикистана и Тажикского отделения биохимического общества ( Дуианбе, 1995 ), на I Кб».] эрекции Ассоциации "Еенщинн науки Таджикистана" 1 Душанбе, І996 ).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы '12 пе-
чатіша работа.
Структура и объем диссертации. Дяссортз!":гі ч з лохина на 273 страницах машинописного текста, содерул? 60 рисунков, 23 таблиц и состоит из введения, шести глаз, заключайся, выводов а списка цитированной литературы, пклйчапэдего 293 работ.
Похожие диссертации на Структурно-функциональные особенности мультиферментного комплекса цикла Кальвина
