Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 8
2.1. Медьсодержащие оксидазы 8
2.1.1. Аскорбатоксидаза 10
2.1.2. Церулоплазмин 12
2.1.3. Лакказа 15
2.2. Структура медных центров 19
2.3. Спектральные свойства ионов меди 24
2.3.1. Предполагаемый механизм катализа у лакказ 26
2.4. Структурная организация медьсодержащих оксидаз 31
2.4.1. Доменная организация медьсодержащих оксидаз 31
2.4.2. Структуры лакказ 34
2.5. Геномная организация лакказ 37
2.5. ГИзоферменты лакказ 37
2.5.2. Экзон-интронная организация гена лакказ 39
3. Материалы и методы исследования 42
3.1. Материалы 42
3.1.1. Штаммы микроорганизмов и ферменты 42
3.1.2. Носители 42
3.1.3. Реагенты 42
3.2. Методы исследования 43
3.2.1. Культивирование штаммов продуцентов лакказы 43
3.2.2. Выделение хромосомной ДНК 44
3.2.3. Проведение ПНР 44
3.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле 45
3.2.5. Очистка ПЦР-продуктов 45
3.2.6. Рестрикция ДНК 46
3.2.7. Лигирование ДНК 46
3.2.8. Секвенирование ДНК 47
3.2.9. Математическая обработка данных секвенирования 47
3.2.10. Компьютерное моделирование 47
3.2.11. Визуализация белковых структур 47
3.2.12. Выделение и очистка лакказы 47
3.2.12.1. Очистка фермента методом ВЭЖХ 48
3.2.12.2. Очистка фермента методом изоэлектрофокусировапия 48
3.2.12.3. Очистка фермента методом препаративного электрофореза 49
3.2.13. Контроль гомогенности препаратов 49
3.2.14. Определение активности лакказы 49
3.2.15. Определение концентрации белка 50
3.2.16. Выравнивания аминокислотных и нуклеотидных последовательностей лакказ 50
3.2.17. Получение кристаллов лакказы 50
3.2.18. Сбор кристаллографических данных и их обработка 51
4. Результаты и их обсуждение 52
4.1. Определение наличия гена лакказы в геноме базидиальных грибов 52
4.2. Определение аминокислотной последовательности лакказы C.hirsutus клонированием гена с хромосомной ДНК 55
4.2.1. Конструирование и синтез праимеров для клонирования лакказы из C.hirsutus 55
4.2.2. Оптимизация условий проведения ПЦР 59
4.2.3. Оптимизация конструкций новых олигонуклеотидных праймеров для клонирования лакказы из C.hirsutus 61
4.2.4. Получение полных нуклеотиднои и аминокислотной последовательностей лакказы C.hirsutus 63
4.3. Определение полной аминокислотной последовательности высоко редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea 66
4.4. Определение аминокислотной последовательности средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus 72
4.5. Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea 75
4.6. Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ 79
4.7. Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ 80
4.8. Определение видовой принадлежности базидиальных грибов 84
4.9. Структурные исследования лакказ 86
4.9.1. Структуры лакказы C.hirsutus 86
4.9.2. Структуры лакказ C.maxima, C.zonatus 88
4.9.3. Моделирование структур лакказ P.ostreatus и C.fulvocinerea 89
4.10. Анализ аминокислотного окружения ТІ центра лакказ 90
4.13. Анализ второй координационной сферы иона меди ТІ 95
5. Выводы 99
6. Список литературы
- Медьсодержащие оксидазы
- Предполагаемый механизм катализа у лакказ
- Штаммы микроорганизмов и ферменты
- Определение наличия гена лакказы в геноме базидиальных грибов
Введение к работе
Лакказа (я-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) принадлежит к семейству медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до воды, минуя стадию образования перекиси водорода.
Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году и к настоящему времени она насчитывает более чем столетнюю историю изучения[1]. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 100 лакказ из различных источников: грибы, растения, насекомые и бактерии. Большая часть изученных лакказ выделена из базидиальных грибов, в которых этот фермент играет ключевую роль в процессах биодеградации лигнина, образовании пигментов, детоксификации и т.д. Лакказа является полифункциональным ферментом, в растениях функция лакказы связана с процессом синтеза лигнина — биополимера, составляющего до 50% сухой массы древесины; в насекомых она участвует в процессах склеротизации [2] и детоксификации, в частности, при метаболических нарушениях, связанных с обменом железа [3]. Также было показано наличие лакказ или лакказоподобных ферментов в бактериях, однако, классификация и сам факт отнесения этих ферментов к лакказам все еще вызывает споры [4].
Лакказы обладают широкой субстратной специфичностью. Они способны катализировать окисление моно-, ди- и полифенолов, ароматических аминов и других соединений. Субстратную специфичность можно также расширить, используя различные редокс-медиаторы, в присутствии которых лакказы способны также окислять различные нефенольные соединения, такие как соли Мп2+ в составе хелатных комплексов [5].
Все эукариотические лакказы являются гликопротеинами с различной степенью гликозилирования (от 10 до 44%). Активный центр лакказы содержит четыре иона меди, организованных в моноядерный медный центр (ТІ) и трехъядерный медный кластер (Т2/ТЗ). Лакказа является наиболее просто организованной медьсодержащей оксидазой, что позволяет использовать ее в качестве модели в фундаментальных исследованиях медьсодержащих белков [б].
Каталитические свойства фермента и его широкая субстратная специфичность, возможность использования в качестве субстрата акцептора электронов молекулярного кислорода, способность катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму и достаточно высокая стабильность обеспечивают широкое практическое применение лакказ. Первые попытки практического использования лакказы определялись ее способностью эффективно разлагать лигнин в присутствии редокс медиаторов [7]. Этот биополимер является одним из самых устойчивых к химической и микробиологической деградации отходом деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, поэтому альтернативные технологии на основе лакказы, позволяющие резко снизить техногенную нагрузку, вызывали и вызьшают значительный интерес. Широкое использование этого фермента при создании различных типов биосенсоров, в первую очередь, связано с его способностью катализировать реакцию электровосстановления кислорода по безмедиаторному механизму. Возможности практического использования лакказы в биотехнологии и различных отраслях промышленности достаточно полно освещены в обзорах [6-8]. Однако, следует подчеркнуть, что все практические разработки выполнены только на лабораторном уровне.
Наиболее консервативной частью лакказы является активный центр, содержащий четыре иона меди и координирующие их аминокислотные лиганды, формирующие уникальную структуру, определяющую спектральные и каталитические характеристики фермента. Уникальный ансамбль из четырех ионов меди, организованных в моноядерный медный центр (ТІ) и трехъядерный медный кластер (Т2/ТЗ) обеспечивает процесс катализа. Известно, что эффективность катализа у лакказ зависит от структурных особенностей субстрата - донора электронов и окислительно-восстановительного потенциала медного центра (ТІ) фермента (ОВП). Следовательно, наибольший практический интерес представляют лакказы с высоким ОВП, поскольку они способны более эффективно разрушать лигнин и другие соединения как фенольной, так и нефенольной природы [9]. Тем не менее, ответить на вопрос, что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра, до сих пор не удалось. Структурный анализ лакказ из различных источников позволил выдвинуть ряд гипотез, ни одна из которых пока не получила экспериментального подтверждения. Несмотря на использование самых современных физико-химических методов, наличия большого количества данных по аминокислотной последовательности лакказ и структурных данных, однозначную взаимосвязь между структурой фермента и механизмом его действия установить не удается. Также не удается ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы, такие как: какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих ТІ центр, и что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях. Таким образом, изучение генетической организации лакказ и установление структурно-функциональных особенностей данных ферментов является актуальным как с фундаментальной (принципы организации и функционирования медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (создание рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).
Медьсодержащие оксидазы
Медь является важным элементом для живых организмов, поскольку большое количество жизненно важных ферментов (оксидаз) содержат в своем активном центре ионы меди, которые вовлечены в процесс переноса электронов от окисляемого субстрата - донора электронов к субстрату - акцептору электронов, роль которого выполняет кислород. Медьсодержащие оксидазы -ферменты, которые используют уникальные редокс-свойства ионов меди. Исторически наиболее типичными представителями этого семейства ферментов считаются лакказы, аскорбатоксидазы и церулоплазмин. Все эти ферменты содержат в активном центре несколько ионов меди и катализируют четырехэлектронное восстановление молекулярного кислорода до воды при сопряженном одноэлектронном окислении различных субстратов (рис. 2.1) [10].
Наиболее близким родственником МСО является медьсодержащая нитрит редуктаза [11]. Этот фермент обладает схожей структурой с МСО однако, в отличие от представителей данного семейства (табл. 2.1) его основная функция -восстановление субстрата. Поэтому медьсодержащие нитритредуктазы и медьсодержащие оксидазы часто объединяют в одну группу - мультимедные белки МСБ [10].
В настоящее время к семейству МСО относят растительные и грибные лакказы, аскорбатоксидазы, церулоплазмин, бактериальную оксидазу CotA, которую часто называют «бактериальной лакказой»[10, 12]. Этот фермент, локализованный на поверхности эндоспор бактерии B.subtilis, обладает широкой субстратной специфичностью и его основная физиологическая функция -повышение устойчивости эндоспор посредством детоксификации химических веществ, оказывающих на споры негативное воздействие[13, 14]. Также к МСО, согласно мнению ряда авторов [15-17], следует отнести билирубиноксидазу растительного происхождения, феноксазинсинтазу и дигидрогеодиноксидазу (ферменты, участвующие в биосинтезе дрожжевых клеток), СиеО [18], Fet3p [16, 19], CumA [20], MofA [21], MnxG [22] и PcoA [18, 23] (ферменты, катализирующие окисление различных металлов переменной валентности). Описание представителей семейства МСО, источников их выделения и физиологических функций (предполагаемых и установленных) приведено в таблице 2.1. Таким образом, семейство МСО уже не представлено маленькой, как долгое время полагало большинство ученых, а достаточно большой группой ферментов, обладающих не только уникальным ансамблем ионов меди в активном центре, но и полифункциональностыо. Результаты исследований МСО обобщены в ряде обзоров [10, 24], где подробно рассматриваются их биохимические и физико-химические свойства, каталитический механизм и физиологические функции. Однако, несмотря на значительный объем накопленных экспериментальных данных о представителях семейства МСО, наиболее изученными ферментами данного семейства по-прежнему остаются аскорбатоксидазы, церулоплазмин и лакказа.
Аскорбаотксидаза (Ь-аскорбат:02-оксидоредуктаза КФ 1.10.3.3) является медьсодержащим ферментом, состоящим из трех доменов и присутствующим главным образом в высших растениях [10]. Фермент представляет собой 140 кДа-димер, составленньш из мономеров, каждый из которых содержит четыре иона меди: один первого типа, один второго типа и два третьего типа. Активный центр состоит из акцептора электронов - иона меди ТІ и кластера Т2/ТЗ, образованого ионом меди Т2 и парой ионов меди ТЗ [26]. Этот фермент обладает узкой субстратной специфичностью и способен катализировать только окисление аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой кислоты при сопряженном четырехэлектронном восстановлении кислорода до воды. Аскорбатоксидазы, в отличии, от лакказы и церулоплазмина, локализованы в мембране [27].
Биологическая функция аскорбатоксидаз до конца не выяснена до сих пор. Вероятнее всего, этот фермент принимает непосредственное участие в процессе роста растений. Также широко обсуждается роль этого фермента в дыхании растений [28]. Данные предположения базируются на экспериментальных фактах о возрастании уровня экспрессии аскорбатоксидазы у растений под воздействием света [29], либо при их механическом повреждении [10]. Однако, наиболее убедительной является гипотеза об участии аскорбатоксидазы в системе комплексной защиты растений в ответ на стрессорные воздействия, сопровождающиеся образованием различных окислителей в радикальной форме[29, 30].
Кристаллическая структура аскорбатоксидазы была решена одной из первых среди медьсодержащих оксидаз - «голубых оксидаз» (рис. 2.2) [31, 32]. Именно данная структура позволила установить общую архетектонику медьсодержащих оксидаз, состоящих из трех доменов, которые обладает высокой структурной гомологией с купредоксином. Общей чертой структуры также является консервативность строения активного центра и его ближайшего аминокислотного окружения: активный центр локализован между первым и третьим доменом, а основные координирующие ионы меди аминокислотные остатки (гистидины и цистеин) одинаковы.
Исследование состояния аскорбатоксидазы в растворе позволило выявить ряд особенностей данного фермента. В отличии от лакказы и церулоплазмина, которые преимущественно существуют в форме мономеров, для аскорбатоксидазы более характерной пространственной структурой является гомодимер, причем данный гомодимер значительно стабильнее мономера.
Предполагаемый механизм катализа у лакказ
Несмотря на большое количество исследований, посвященных медьсодержащим оксидазам, в том числе и лакказам, все еще не существует единого мнения относительно пути движения электронов в белковой глобуле при катализе [91]. Известно что ион меди ТІ является первичным акцептором, электронов при окислении субстратов. Далее электроны движутся к трехядерному медному кластеру Т2/ТЗ, где происходит восстановление молекулярного кислорода до воды. Фактически катализ можно разделить на две стадии — перенос электрона от субстрата на ТІ и далее на Т2/ТЗ кластер и восстановление дикислорода до воды в Т2/ТЗ кластере. Первая стадия катализа достаточно хорошо изучена на примере аскорбатоксидазы и лакказы[29].
В работе Мессершмидта впервые было указано, что His506 - Cys507 -His508 служит мостиковым лигандом между двумя окислительно-восстановительными центрами ионов меди аскорбатоксидазы [92], обеспечивая наиболее благоприятный путь переноса е. Разница ОВ потенциалов ТІ и ТЗ (движущая сила е) была измерена и составляла -AG = 30 мВ. Значения энергии реорганизации и фактора электронного связывания авторы подбирали эмпирически. К сожалению, полученные рассчитанные данные, не смогли дать четкого ответа на вопрос, что является скорость лимитирующей стадией в каталитическом цикле: внутримолекулярная скорость переноса электронов или взаимодействие с кислородом в трехъядерном медном кластере. В этой работе предполагалось, что перенос і от ТІ к ТЗ ионам меди может проходить через связи аминокислотных остатков или туннельным переносом (пространственно) или комбинацией обоих путей.
Альтернативный комбинированный путь от медного иона ТІ к трехъядерному кластеру включает в себя перенос электрона от Sr атома Cys507 к углеродному атому основной полипептидной цепи и через водородную связь от этого углерода к N атому His 506. Оценка наиболее вероятного пути электронного переноса была просчитана теоретически Мессершмидтом с соавт.[28], используя алгоритм для расчета путей электронного переноса в металлопротеинах, разработанный Бератаном и Онучиком [93]. Согласно этим расчетам, наиболее благоприятный путь состоит из четырех ковалентных связей и водородной связи между карбонильным кислородом основной цепи Cys507 и N атомом His506. Второй наиболее вероятный путь содержал сильно ковалентную связь между N1 иС атомом 506 аминокислотного остатка [94]. Вследствие высокой гомологичности с лакказой подобные выводы могут быть сделаны и для этого фермента: наиболее вероятным представляется путь от серы экваториального цистеина ТІ к его карбонильному кислороду, затем через водородную связь KN His452, координирующему один из ионов меди ТЗ [10].
Фактически перенос электрона на ТЗ-кластер завершает первую стадию катализа, за которой следует стадия восстановления кислорода и образование воды. Точный механизм восстановления кислорода не установлен. На сегодняшний день предложены две схемы возможного восстановления дикислорода до воды в центре Т2/ТЗ кластера (рис 2.5) [63, 95].
Первая схема базируется на данных исследования механизма катализа для нативного фермента и его производных (форма с удаленным ионом меди второго типа форма, содержащая ртуть вместо иона меди первого типа и комплексы с азидом) физико-химическими методами и теоретических расчетах. Наиболее вероятным представляется следующая схема восстановления (рис. 2.7 Б). После четырехэлектронного переноса на кластер начинается последовательное восстановление всех трех ионов меди кластера, причем первым восстанавливается ион меди ТЗ альфа, который имеет самую низкую энергию. Последние исследования позволили установить, что отрицательно заряженный остаток аспарагина вблизи ионов меди Т2 и ТЗ бета, значительно снижает восстановительный потенциал этих ионов. Параллельно восстановлению ТЗа идет протонирование цЗ-оксо центра и дОН- лиганда, которые затем диссоциируют из от восстановленного ТЗа центра. Следующей стадией является восстановление Т2. Ключевым шагом в этом процессе является образование мостикового гидроксила между Т2 и ТЗв, благодаря которому возможен быстрый электронный перенос на Т2 центр. Следовательно, эта модель предполагает образование пары ионов меди смешанной валентности. Дальнейшее восстановление иона меди ТЗб постулируется как быстрый процесс переноса электрона по дипептиду цистеин-гистидин между ТІ и ТЗ, и сопровождается протонированием мостикового гидроксила с последующей диссоциацией двух молекул воды из кластера.
Вторая предложенная схема базируется только на структурных данных [95]. Согласно этой схеме первой стадией является транспорт дикислорода в активный центр, причем все три иона меди находятся в окисленном состоянии +2. Далее при взаимодействии полностью восстановленного трехъядерного медного кластера с молекулой кислорода происходит образование пероксидного интермедиата. При переносе двух электронов происходит восстановление иона меди Т2 и одного иона меди из ТЗ центра, что в свою очередь приводит к восстановлению дикислорода, что сопровождается перестройками в активном центре с образованием связей между ионами меди и кислородными лигандами. Следующие два электрона, перенесенные в кластер, и последующее протонирование приводят к образованию пероксоформы, которая затем превращается в два гидроксила, один из которых становится мостиковым между ионами меди ТЗ. Второй гидроксил мигрирует к Т2, формируя структуру аналогичную аскорбатоксидазе в «покоящейся» форме. Дальнейшие превращения включают протонирование гидроксильной группы, связанной с ионом меди ТЗ, образование молекулу воды и ее выход через канал. Второй мостиковый гидроксил между ионами меди ТЗ также протонируется с образованием молекулы воды, которая транспортируется из молекулы по тому же каналу.
Штаммы микроорганизмов и ферменты
В качестве объекта исследования были выбраны следующие штаммы-продуценты лакказ из коллекции Ботанического Института им. Комарова РАН (ЛЕ(БИН)): 1. Coriolus hirsutus {Trametes hirsuta (Wulfen) Pilat, 1939); 2. Coriolus zonatus {Trametes ochracea (Pers.) Gilbe&Ryvarden, 1897); 3. Cerrena maxima {Trametes maxima (Mont.) A. David&Rajchenb, 1985); 4. Coriolopsis fulvocenerea {Coriolopsis caperata Murrill, 1908);. 5. Pleurotus ostreatus ((Jacq.) P. Kumm&Pilzk,1871); 6. Androdiella faginea (Vampola et Pouzar, 1996); 7. Xerula radicata (Relhan&Dorfelt, 1975). Следует отметить, что классификация базидиальных грибов достаточно запутана и поэтому в работе будет использовано то название штамма, которое он имеет в коллекции ЛЕ(БИН)а со ссьшкой на современное название согласно CABI Bioscience и базе данных CBS (www.indexfungorum.org).
Носители
Для выделения лакказы использовали следующие носители: ДЕАЕ-це ллю лозу ("Whatman"), волокнистую ДЕАЕ-целлюлозу (НПО-Биолар), ДЕАЕoyopearl-650M ("Toyo-soda", Япония), Супердекс-200 ("Pharmacia", Швеция), Сефадекс G-25 ("Pharmacia", Швеция), Chelex-100 ("BioRad").
Реагенты
В работе по очистке лакказы использовали следующие реагенты фирмы "Sigma" (США): пирокатехин, "Sigmacoat", сульфат аммония; фирмы "Merck": 2,2 -бихинолин, гуанидин хлорид, дисульфонат баскупроина; фирмы "Pharmacia" (Швеция): Pharmalyte, рН 2.5 - 5.0; фирмы "Pierce" (США): коммерциализированный набор для определения концентрации белка с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 2.0 мг/мл; фирмы "Hampton Research" (США) наборы Crystal Screen I, Crystal Screen II и Crystal Screen Cryo, ПЭГ 1000, ПЭГ 8000. Bee неорганические реагенты имели марку "ХЧ" и "ОСЧ".
В экспериментах по генной инженерии использовали реактивы марки «Molecular Biology Grade»: акриламид, М,К-метиленбисакриламид, ЭДТА и мочевина («Bio-Rad», США); трис-(гидроксиметил)-аминометан («Merck», Германия); борная кислота («Sigma», США); ТЕМЕД и персульфат аммония («IBI», США); амберлит («Serva», Германия). Эндонуклеазы рестрикции EcoRI (20 ед/мкл), SacII (10 ед/мкл), Ndel (10 ед/мкл), Xhol (10 ед/мкл), Sail (10 ед/мкл), BseX3I (10 ед/мкл), ХтаШ (10 ед/мкл) были производства фирмы «New England Biolabs» (США, 2000 ед/мкл), ДНК-лигаза фага Т4 - фирмы («Fermentas» (США, 30 ед/мкл). Для проведения ПЦР использовали ДНК-полимеразы Pfu Turbo («Stratagene», США) или Taq («Сибэнзим», Россия) или, в случае когда требовалось получить ПЦР-фрагменты большой длины, Long PCR Enzyme Mix («Fermentas», США). В работе также применяли отечественные реактивы -изопропанол (х.ч.), этиловый спирт-ректификат. Очистку воды проводили на установке MilliQ («Millipore», США).
Штаммы, предоставленные сотрудниками коллекции Ботанического Института им. Комарова РАН, хранили на агаризованных косяках, которые готовили путем разбавления сусла водой в объемном соотношении 1:4 с добавлением 2% агара при температуре +4С. Культура хранилась без пересева от 6 месяцев до одного года без потери биосинтетической активности.
Выращивание посевного материала проводили на питательной среде с начальным значением рН 6.0 следующего состава (г/л): глюкоза - 10.0; пептон -3.0; КН2Р04 - 0.6; ZnS04 х 7Н20 - 0.001; К2НР04 - 0.4; FeS04 х 7Н20 - 0.0005; MnS04 - 0.05; MgS04 х 7Н20 - 0.5.
При выращивании посевного материала поверхностным способом в колбу объемом 750 мл, содержащую керамические бусы и 150 мл питательной среды, вносили кусочки мицелия с агарового косяка и инкубировали при 26 - 28С в течение 6-8 сут. Далее часть выращенного таким способом мицелия отбирали и использовали для выделения хромосомной ДНК, с оставшейся частью мицелия проводили глубинное культивирование.
При глубинном культивировании продуцентов лакказы в питательную среду вышеуказанного состава вносили дополнительно CuS04 в количестве 0.25 г/л и СаС12 в количестве 0.5 г/л для индукции биосинтеза лакказы. Инокулят вносили в колбы емкостью 750 мл со средой в количестве 10 - 15 % от объема среды. Культивирование осуществляли на круговых лабораторных качалках при 120 - 160 об/мин и температуре 27 - 28С в темной аэрируемой камере.
Для выделения хромосомной ДНК брали мицелий, полученный после поверхностного культивирования на 8-10 сутки, который промьшали дистиллированной водой, после чего просушивали между слоями фильтровальной бумаги. Высушенный мицелий перетирали в ступке в среде жидкого азота до получения однородного бело-желтого порошка. Выделение ДНК из полученной измельченной грибной биомассы проводили согласно протоколам для выделения ДНК «DNeasy Plant Mini Kit (50)» («Qiagen», США). ДНК определяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Полученные образцы хромосомной ДНК хранили при температуре -20С.
Праймеры для проведения ПЦР подбирали, исходя из следующих соображений: 1. Праймер должен быть как можно более комплементарен матричной ДНК. 2. Варьирование длины праймера должно быть от 20 до 30 нуклеотидов, причем количество вырожденных нуклеотидов должно быть не больше 25% от общей длины праймера. 3. Праймер не должен содержать самокомплементарных участков.
Определение наличия гена лакказы в геноме базидиальных грибов
Для быстрого определения продукции лакказы грибами используется метод по наличию соответствующей активности (так называемый «plateest») [115]. Главным недостатком данного метода является его низкая достоверность, поскольку в некоторых случаях комплекс окислительных ферментов экспрессируемый грибом, не содержащий лакказу, может дать положительный результат в тесте. Следует также отметить, что лакказы базидиальных грибов кодируются сложным семейством генов и в одном штамме может содержаться как один, так и несколько генов изоферментов. Поэтому разработка высокоточного экспресс метода определения наличия гена лакказы в геномах различных грибов с последующим определением его нуклеотидной и кодируемой им аминокислотной последовательностей является очень актуальной проблемой.
Для этой цели был разработан экспресс метод определения гена лакказы с помощью ПЦР. На основании результатов анализа более 100 аминокислотных последовательностей лакказ, имеющихся в базе данных, были выделены 4 консервативных участка.
Аминокислотные остатки, входящие в их состав, являются консервативными для всех лакказ и отвечают за связывание ионов меди, формирующих активный центр фермента. Используя эти участки, были разработаны и синтезированы праймеры, представленные в таблице 4.1.
Праймеры LacAl For и LacAlL For разработаны на один и тоже же участок в гене и отличались только в 6-м триплете - ТТ(ТС) и (CT)T(GC) соответственно. Такие два практически одинаковых праимера на один участок были синтезированы потому, что у лакказ в этом положении равновероятно может находится как остаток фенил ал анина, так и лейцина.
Используя ДНК исследуемых штаммов, которые были описаны выше, была проведена оптимизация условий ПЦР со следующими парами праймеров: LacAl For- LacA4 Rev LacAlL For- LacA5 Rev LacAl For- LacA5 Rev LacA2 For- LacA4 Rev LacAlL For- LacA4 Rev LacA2 For- LacA5 Rev
Наиболее оптимальной для амплификации оказалась следующая программа: 1 цикл (5 мин. 95С), далее: 5 циклов (1 мин. 90С, 2 мин. 65С, 1 мин. 72С), 5 циклов (1 мин. 90С, 2 мин. 62С, 1 мин. 72С), 10 циклов (1 мин. 90С, 2 мин. 60С, 1 мин. 72С), 10 циклов (1 мин. 90С, 2 мин. 58С, 1 мин. 72С), 1 цикл (10 мин 72С). Эта программа использовалась в всех последующих экспериментах «touch down».
Все исследуемые штаммы, кроме Xerula radicata, при амплификации с данными праймерами давали отчетливо видные ПЦР-продукты, последующее секвенирование которых показало, что они являются частью генов лакказы. Полученные данные свидетельствуют о том, что все исследуемые штаммы кроме Xerula radicata имеют гены лакказы. Это предположение подтверждается данными глубинного культивирования, поскольку все изученные штаммы, за исключением X.radicata, секретировали при культивировании лакказу в культуральную жидкость, из которой были выделены очищенные препараты фермента.
В случае базидиомицета Antrodiella faginea при использовании пар праймеров LacAl For- LacA5 Rev было получено два отчетливо видимых продукта, которые по массе отличались на 180 н.п. Дальнейшее выделение, очистка и секвенирование этих ПЦР-продуктов показало, что оба они являются изоферментами лакказы. Эти данные могут свидетельствовать о наличии двух отличающихся генов лакказы в базидиомицете.
Разработанная универсальная ПЦР-методика по определению наличия генов лакказ в различных штаммах базидиомицетов позволяет в короткий срок определять наличие или отсутствие гена лакказы, его частичную нуклеотидную последовательность и, как следствие, оценить уровень гомологии этой последовательности с уже известными.
Неоспоримым достоинством данной методики следует также считать возможность определения полной последовательности гена лакказы, включая интроны, с использованием метода инвертной ПЦР, причем даже в тех случаях, когда не известны ни аминокислотная, ни нуклеотидная последовательности.
Определение полной нуклеотидной последовательности с использованием геномной ДНК обладает рядом достоинств по сравнению с методом определения последовательности через клонирование кДНК, поскольку исключает возможные ошибки, которые могут возникнуть при проведении реакции обратной транскрипции. Кроме того, данный метод позволяет определить экзон-интронную структуру гена лакказы.