Введение к работе
Актуальность проблемы. НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ, КФ 1.2.1.2) окисляют ионы формиата при сопутствующем восстановлении кофермента НАД+ до НАДН:
НСОО" + НАД+ <-> С02 t + НАДН
ФДГ широко распространены в природе: они были найдены в бактериях, грибах и высших растениях. В метилотрофных микроорганизмах этот фермент играет важную роль в обеспечении их энергией, катализируя последний этап катаболизма метанола. В растениях ФДГ участвует в ответе на стрессовые воздействия: в стрессовых условиях содержание этого фермента в митохондриях достигает 9% от всех митохондриальных белков.
Особенностью молекулярного механизма действия ФДГ является прямой перенос гидрид-иона от субстрата на атом С4 никотинамидного кольца НАД+ без дополнительных стадий переноса протона, присутствующих в реакциях, катализируемых другими родственными НАД+-зависимыми дегидрогеназами. Поэтому реакция, катализируемая ФДГ, является удобной моделью для изучения механизма переноса гидрид-иона в каталитическом центре НАД+-зависимых дегидрогеназ методами квантовой механики и молекулярной динамики. ФДГ используется на практике для регенерации кофермента НАДН в ферментативных процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. Практическая необратимость формиатдегидрогеназной реакции и широкий рН-оптимум активности сделали этот фермент универсальным биокатализатором, способным эффективно работать при значениях рН, оптимальных для целевого процесса.
Ранее проведен большой объем исследований по кинетическим и физико-химическим свойствам ФДГ в растворе из ряда организмов. Решены пространственные структуры апо- и холо-форм ФДГ из метилотрофной бактерии Pseudomonas sp.101 (РэеФДГ) с разрешением около 2 А и структура апо-формы ФДГ из метилотрофных дрожжей Candida Boidinii (СЬоФДГ) с разрешением 1.7 А. Предложен молекулярный механизм действия фермента, многие детали которого подтверждены методом сайт-направленного мутагенеза и методами молекулярного моделирования. Однако, ряд важных вопросов, связанных с особенностями каталитического действия фермента, оставались невыясненными. В частности, оставался открытым вопрос о том, как устроены холо-формы эукариотических ФДГ, в том числе активный центр и сайт связывания кофермента. Неизвестно, какие структурные особенности определяют отличия эукариотических ФДГ от бактериальных по таким параметрам как кинетический механизм, активность и термостабильность. Кроме того, к моменту начала работы не было получено пространственных структур ФДГ с атомным разрешением, которые могли бы уточнить некоторые детали молекулярного механизма
действия фермента и послужить надежной стартовой моделью для его
исследования методами квантовой механики. Таким образом, изучение
структурно-функциональных особенностей НАД+-зависимых
формиатдегидрогеназ из различных организмов является актуальным как с фундаментальной (особенности структурной организации ФДГ из различных организмов и детали молекулярного механизма действия ФДГ и процессов переноса гидрид-иона в каталитических центрах НАД+-зависимых дегидрирогеназ в целом), так и с практической точки зрения (разработка рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).
Цель работы. Целью данной работы является структурное исследование ФДГ из различных организмов. Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:
Получение кристаллов апо- и холо-форм НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp. С-1 (МогФДГ) и высшего растения Arabidopsis thaliana (АгаФДГ).
Решение пространственных структур апо- и холо-форм МогФДГ и АгаФДГ методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.
Сравнительный анализ решенных структур с ранее известными структурами ФДГ.
Научная новизна. Впервые решены пространственные структуры апо- и холо-форм МогФДГ и АгаФДГ. Структуры АгаФДГ являются первыми структурами растительных ФДГ, причем структура холо-АгаФДГ является первой структурой холо-формы эукариотической ФДГ. Проведен сравнительный анализ решенных структур с ранее исследованными структурами ФДГ, выявлены структурные отличия бактериальных и эукариотических ФДГ. Решена структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации, представляющая собой редкий пример структуры апо-формы НАД+-зависимой дегидрогеназы в закрытой конформации, характерной для холо-формы ферментов. Показана роль связывания кофермента, структурирования С-концевого фрагмента 375-399 и связывания субстрата/ингибитора в переходе бактериальных ФДГ к закрытой конформации. Впервые решена структура ФДГ с атомным разрешением (структура тройного комплекса МогФДГ-НАД+-азид с разрешением 1.1 А) и подтвержден ряд предположений о молекулярном механизме действия ФДГ.
Личный вклад автора. Поиск и оптимизация условий кристаллизации, участие в сборе дифракционных данных, обработка полученных данных. Решение и уточнение пространственных структур. Анализ полученных атомных моделей. Большая часть работы выполнялась лично соискателем, за исключением работы по кристаллизации, решению, уточнению и анализу структур апо-МогФДГ (разрешение 2.3 А) и холо-МогФДГ (разрешение 1.95 А), которая проводилась совместно с Е.В. Филлиповой. Большая часть работы (более 85%) выполнялась соискателем.
Практическая значимость работы. Значительно расширена структурная основа для понимания механизма действия используемого в биотехнологии фермента. Полученная структурная информация может быть с успехом использована для дальнейшего дизайна рекомбинантного биокатализатора для систем регенерации никотинамидных коферментов в биотехнологии. Предложен ряд перспективных мутаций для увеличения термостабильности АгаФДГ и повышения сродства АгаФДГ и СЬоФДГ к НАД+.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: международная конференция «Biocatalysis - 2007» (Москва, 2007), VI Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2007) (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Recent Developments in Macromolecular Crystallography (India, Pune, 2008), международная конференция "Рентгеновское, Синхротронное излучения, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии" (Москва, 2009).
Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых журналах (из них одна статья в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ), одна статья в сборнике и 6 тезисов конференций.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 157 ссылок. Работа изложена на 133 страницах, содержит 46 рисунков и 6 таблиц.
Обсуждена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи исследования.
Рассмотрена физиологическая роль ФДГ в различных организмах, проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей фермента. Проанализирована литература по кинетическим свойствам ФДГ в растворе, по пространственным структурам ФДГ и по исследованию механизма действия этого фермента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объекты исследования
В качестве объекта исследования были выбраны НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы из метилотрофной бактерии Moraxella sp. С-1 (МогФДГ) и высшего растения Arabidopsis thaliana (АгаФДГ). Белки были
экспрессированы, выделены и очищены сотрудниками группы генетической инженерии и белкового дизайна кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ под руководством профессора В.И. Тишкова.
2. Кристаллизация
Кристаллизация проводилась методом диффузии в парах в висячих каплях при температуре 20С в термостатированной комнате. В случае кристаллизации холо-формы ФДГ к раствору белка добавляли кофермент НАД+ и азид натрия до концентрации каждого 5 мМ. Раствор белка с концентрацией от 6 до 14 мг/мл перед кристаллизацией центрифугировался. Для приготовления каждой капли бралось 2 мкл белка и смешивалось с резервуарным раствором в соотношении 1:1. После нахождения первоначальных условий кристаллизации для улучшения качества и размеров кристаллов проводилась серия экспериментов по оптимизации состава противораствора и концентрации раствора белка. Оптимизированные условия кристаллизации представлены в таблице 1.
Таблица 1. Условия кристаллизации МогФДГ и АгаФДГ.
3. Рентгеноструктурный эксперимент, решение и уточнение пространственных структур
Дифракционные данные были получены: на станции К4.4 Курчатовского центра синхротронного излучения и нанотехнологий (структуры апо-МогФДГ-закрытая и холо-АгаФДГ), на источнике рентгеновского излучения ELLIOT GX-6 с вращающимся анодом в Институте Белка РАН, г. Пущино (структура хол о-МогФДГ (1.95 А)) и на станциях Х11 и Х13 синхротрона Гамбургского отделения EMBL (структуры апо-МогФДГ, хол о-МогФДГ (1.1 А) и апо-АгаФДГ). Статистические характеристики наборов дифракционных данных представлены в таблице 2.
Таблица 2. Статистические характеристики наборов дифракционных данных. В скобках приведены данные для последнего слоя разрешения.
Дифракционные данные для структур апо-МогФДГ и холо-МогФДГ (1.1 А) были обработаны программами DENZO и SCALEPACK. Данные для структуры апо-МогФДГ-закрытая обрабатывались программой AUTOMAR. Дифракционные данные для всех остальных структур были обработаны программой XDS. Пространственные структуры были решены методом молекулярного замещения по программе MOLREP. В качестве стартовой модели для решения структур апо- и холо-МогФДГ использовались структуры одной субъединицы апо- и холо-РэеФДГ, соответственно. Для решения структур апо- и холо-АгаФДГ использовалась структура кофермент-связывающего домена холо-МогФДГ, каталитические домены были достроены в процессе уточнения вручную. Кристаллографическое уточнение структур проводили по программе REFMAC. Для всех неводородных атомов структуры холо-МогФДГ (1.1 А) температурные факторы уточнялись в анизотропном приближении, все остальные структуры уточнялись в изотропном приближении. При уточнении структуры холо-МогФДГ (1.1 А) и структуры апо-АгаФДГ (1.7 А) учитывался вклад атомов водорода в рассеивание. Для визуального контроля за ходом уточнения, внесения существенных изменений в атомную модель структуры и локализации молекул воды использовали графическую программу COOT. Статистические характеристики уточнения структур и атомных моделей приведены в таблице 3.
Таблица 3. Статистические характеристики уточнения структур и атомных моделей.
1. Структуры холо- и апо-форм МогФДГ
Холо-форма МогФДГ
Пространственная структура холо-МогФДГ содержит в независимой части элементарной ячейки одну молекулу белка в закрытой конформации в комплексе с НАД+ и ионом азида, аналогом субстрата в переходном состоянии ферментативной реакции. Молекулу димера МогФДГ образуют субъединицы, связанные кристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка (Рис. 1). На С-конце полипептидной цепи структуры холо-МогФДГ были обнаружены 8 дополнительных аминокислотных остатков (392-399), которые не удавалось локализовать по картам электронной плотности в структуре холо-РэеФДГ. Часть дополнительных остатков образуют а-спираль а20 и способствуют более прочному междоменному взаимодействию в результате образования двух водородных связей (Asn317-Glu397) и гидрофобного кластера (Тгр99, Рго314, Туг396 и Тгр177 соседней субъединицы димера). Два С-концевых остатка 400-401 не локализованы.
Полипептидная цепь субъединицы МогФДГ организована в глобулярную двухдоменную структуру, подобную структуре РэеФДГ: кофермент-связывающий домен образован аминокислотными остатками
147-333, а каталитический сформирован остатками 1-147 и 333-401 (Рис. 1). Холо-МогФДГ и холо-РэеФДГ имеют практически одинаковый ход полипептидной цепи: при суперпозиции отдельных субъединиц этих структур RMSD Са атомов равно 0.42 А. Отклонения, превышающие 1 А, были обнаружены только в каталитическом домене. Вторичные структуры холо-МогФДГ и холо-РэеФДГ практически одинаковы (Рис. 2). Однако МогФДГ и РэеФДГ отличаются организацией димерного контакта: при практически одинаковой площади (3953 и 3799 А2, соответственно), димерный контакт в хол о-МогФДГ содержит 54 водородных связей, а в холо-РэеФДГ - 42 водородных связей. При этом все водородные связи между субъединицами в димере холо-РэеФДГ сохраняются и в холо-МогФДГ.
Рис. 1. Ход полипептидной цепи димерной молекулы МогФДГ в холо- (слева) и апо- (справа) форме. Левая субъединица димера окрашена в голубой цвет, кофермент-связывающий домен правой субъединицы - в фиолетовый, каталитический домен правой субъединицы - в розовый. В структуре холо-МогФДГ остатки 375-391, не структурированные в апо-МогФДГ, показаны моделью красного цвета, дополнительные остатки 392-399 (относительно структуры холо-РэеФДГ) -темно-красного цвета, молекула НАД+ - зеленого цвета, ион азида - красного цвета. Ось второго порядка, связывающая субъединицы димера, направлена перпендикулярно плоскости рисунка.
Кофермент связывается в междоменной щели и взаимодействует в основном с остатками кофермент-связывающего домена (Рис. 3). В связывании кофермента в структурах холо-МогФДГ и холо-РэеФДГ участвуют одинаковые остатки и молекулы воды, единственным отличием является отсутствие молекулы воды у атома N1A кофермента в МогФДГ. Каталитические центры холо-РэеФДГ и холо-МогФДГ устроены практически одинаково (Рис. 4). Единственным отличием является наличие водородной связи между ионом азида и остатком His332 в структуре холо-МогФДГ (расстояние равно 3.2 А, в холо-РэеФДГ - 3.6 А). Наличие этой связи подтверждает высказанную ранее на основе теоретических расчетов и данных сайт-направленного мутагенеза гипотезу о том, что остаток His332 может образовывать водородную связь с субстратом как в комплексе Михаэлиса, так и в переходном состоянии ферментативной реакции.
AKVLCV
aIkvvcv
FYK a|ne yatknJp
LYD AGJKHAAdIeE ______________
РзєФдГ 65
МогФДГ 65
АгаФДГ 65
СЪоФДГ 35
LQ-- SAID LQ--AAID LQ--AAAA LP YINQTJG
РэеФДГ 135 МогФДГ 135 АгаФДГ 135 СЪоФДГ 107
a|gl
c]n
*
s i svaehvvmmi lslv|rn snsvaehvvmmvlglvrIn vvsvaedelmrililm vvsvaehvvmtmlvlv
RIGLAV RIG l|v RIGKLL RIGYRV
LHY
|lhy
redmyIgai lneml~pk|( ieelvIaqj
PELEKElTlGAl
kdaeek|vg[arr
РэеФДГ 207 МогФДГ 207 АгаФДГ 135 СЪоФДГ 179
IVN
|lvn
АІЕІ
AVAR
Ps-ФДГ 278 МогФДГ 278 АгаФДГ 135 СЪоФДГ 251
"*1 f*I
YSKGN
yskgnatggIsee aakIyeklda
РэеФДГ 345 МогФДГ 345
L I VQlGGALAGTGAHS L I v[o G GGLa[gVGAH S
Y I VKD GlELlA |PQ Y|R
АгаФДГ
СЪоФДГ
FEREL|VDAD|VVI S
L E К H LHDIaEV IIS
VLI S
LDQH I PDlAD
аб
D YQ
*|
ave[sg
LAGYA
GD GD
L|GYA I GGYS
q|lr|gygg|d
Ґ*
a!8 [312
ІрізМ IggIalIa gggla[
'PFVlPAYLT IPFWPAYLT 'PFHPAYVT
Q Q
l~l~l
all
qIlgsvIg allgsvs g
ID ID
1*1
a9
WN WN
_iJgag
|*| al2
I ADCV I ADCV W N v| A G I A
weIvaai A
|VVTL VVTL VIVI I VTV
rCPLHPE rCPLHPE
fMPLTEK IAPLHAG
KlElLlIlGlK
kells[kfkkg
|pcbo|
S GT
S GT
S GT
S GT
mBn kBg A g|n АМІТ PHY
*
a20
-l-l-l-l-l-l-l-l-l-l-l-l-l
ATGGSEEAAKFKKAV-
Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей всех ФДГ, для которых решены пространственные структуры. Остатки, участвующие в димерном контакте, выделены зеленым фоном. Остатки, не локализованные ни в одной из пространственных структур каждого фермента, выделены красным цветом. Каталитически важные остатки отмечены звездочками. Остатки, участвующие в димерном контакте и элементы вторичной структуры приведены для холо-форм ферментов, за исключением СЬоФДГ.
N Leu 257
wat12 NGI7203
NGIy200
N ІІЄ202 N Arg201
NH1 Arg201
Wat243 Wat305 NZ Arg204
Wat240
0D2 Asp221
NE2His379
NE2His220 Wat31
N Leu257
OH Tyr381
0E2 Glu141
N Tyr144
OG1 Thr143
NH2 Агд2Я4
NH1 Агд264 N,-N,-N)
NE2 His332
O.N I
іЛЛ/ OD2ASp308
OD2 Азр125
0D1 Asp308
I I
N.N
О Thr2B2
o;n
« C.'N /
Wat84 0,'N^ J -c;N
c;n
OGSer174 „ t
OsN PN 0,N N Ile202
NArg201
/
I 0,A PA O^
Wat94
OG Ser330
Wat21
C/A . 0,'A
-0;'A OD1 Asp221
/ 9j'a OD2 Asp221
Wat165 "* NE2His258
N ІІЄІ22
ND2 Asn146
ЫН2 Arg284
NH1Arg284 "---n-n.
NE2 His332
N Gly335
0D2 АзрЗОВ OD1 Asp30S
OG Ser334
0D2 Asp 125
CeN^ ,C2N
N,N OAsn2B2
Wat233 o3'N^c -c,'N
О Asn254 N Gly203 N Gly200
Wat237
\
/
Wat249 Wat236 0,A PA O^A
/SA
NH1 Arg201 Wat241 csA
NH2Arg201
С/A , О'A
Wat242
*\ I
C,A — C='V
/
0, A 0D1 Asp221
Wat239 NH1 Arg222
NE2 Arg222
Wa.245 N<* Wa.244
0 Arg378
OG Thr258
Рис. 3. Схема связывания НАД+ и иона азида в структурах холо-МогФДГ (слева) и холо-АгаФДГ (справа). Водородные связи показаны пунктиром. Остатки, отличающиеся характером боковой цепи в этих структурах, выделены синим цветом. Остатки и молекулы воды, не участвующие в связывании кофермента в одной из структур, выделены красным цветом. Остатки каталитического домена обведены рамкой. Молекулы воды, сохранившиеся и в структуре апо-МогФДГ-закрытая, выделены синим фоном на схеме для холо-МогФДГ.
Рис. 4. Каталитический центр холо-МогФДГ (слева) и холо-АгаФДГ (справа). Водородные связи изображены в виде красных пунктирных линий. Структура холо-РэеФДГ приведена моделью черного цвета.
Апо-форма МогФДГ
В независимой части элементарной ячейки структуры апо-МогФДГ содержится два димера фермента в открытой конформации, образованные субъединицами (А)(В) и (C)(D). Субъединицы в димере связаны некристаллографическими поворотными осями второго порядка (Рис. 1). Все субъединицы в структуре апо-формы МогФДГ очень похожи: RMSD Са атомов при попарном наложении субъединиц равно 0.35-0.46 А. В субъединицах (А) и (D) были локализованы по 374 аминокислотных остатка, а в субъединицах (В) и (С) по 369. Таким образом, как и в апо-РэеФДГ, большой С-концевой фрагмент (остатки 375-401) структуры апо-МогФДГ не локализован. Апо-МогФДГ имеет более открытую (на 2-5 при сравнении разных субъединиц) конформацию по сравнению с апо-РэеФДГ.
Как и в апо-РэеФДГ, боковая цепь остатка каталитического центра Arg284 имеет разные конформации в различных субъединицах, что свидетельствует о его конформационной подвижности в апо-форме. Конформация петли каталитического центра 122-125 различна в субъединицах структуры апо-МогФДГ, что подтверждает высказанное ранее предположение о её гибкости в апо-форме ФДГ. Боковые цепи остатков Arg222, His223, His258 и Glu260 аденин-связывающего сайта имеют различные конформации во всех субъединицах (как и в апо-РэеФДГ), что позволяет сделать вывод о лабильности аденин-связывающего сайта ФДГ в открытой конформации в отсутствие кофермента.
Как следует из сравнения структур апо- и холо-форм МогФДГ, при связывании НАД+ и иона азида молекула МогФДГ приобретает закрытую конформацию, как это было описано ранее для РэеФДГ. Каталитический домен смещается как единое целое в сторону кофермент-связывающего на угол ~12 (на 2-4 больше, чем для РэеФДГ), что приводит к компактизации каталитического центра. При этом структурируются остатки каталитического центра 123-124 и Arg284 и остатки аденин-связывающего сайта Arg222, His223, His258 и Glu260. Кроме того, структурируются С-концевые остатки
375-399 с образованием а-спиралей а19 и а20 (Рис. 1, Рис. 2). Небольшие отличия в организации доменов в апо- и холо-МогФДГ (отклонения Са атомов на 1.0-2.4 А относительно домена, к которому они относятся) вызваны связыванием кофермента (остатки 223-224, 257-262), структурированием С-концевых остатков (130-136, 223-224, 257-262, 316-317), структурированием каталитического центра (123-124) и подстройкой остатков, участвующих в междоменных взаимодействиях (17-29).
2. Структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации
Пространственная структура апо-формы МогФДГ в закрытой конформации представляет собой редкий пример структуры апо-формы НАД+-зависимой дегидрогеназы с закрытой междоменной щелью. Кристаллы апо-МогФДГ в закрытой конформации изоморфны кристаллам холо-МогФДГ. Ход полипептидной цепи этих структур практически одинаков: RMSD Са атомов при суперпозиции по 399 остаткам составляет 0.31 А. При этом различия более 1 А в положениях Са атомов наблюдаются только в области связывания адениновой части кофермента (остатки 222-224). Как и в холо-МогФДГ, в структуре апо-МогФДГ-закрытая структурированы С-концевые остатки 375-399 (Рис. 1). Таким образом, переход фермента к закрытой конформации сопровождается структурированием С-концевого фрагмента 375-399 даже без связывания кофермента.
В междоменной полости структуры апо-МогФДГ-закрытая локализованы молекула воды и ион сульфата на месте связывания пирофосфатной части НАД+, а также молекула глицерина с половинной заселенностью и молекула воды на месте связывания никотинамидной части НАД+ и субстрата (т.е. в каталитическом центре). Других молекул, связанных на месте НАД+, обнаружено не было. В структуре апо-МогФДГ-закрытая шесть из девяти молекул воды, участвующих в связывании НАД+ в структуре холо-МогФДГ, имеют те же позиции и вовлечены в такую же сетку водородных связей, что и в хол о-МогФДГ (Рис. 3). Возможными причинами кристаллизации апо-МогФДГ в закрытой конформации являются наличие дополнительных С-концевых остатков 392-399 и связывание иона сульфата на месте пирофосфатной части НАД+, поскольку эти факторы способствуют междоменным взаимодействиям. Кроме того, нельзя исключать возможное влияние межмолекулярных контактов в кристалле на конформацию фермента. Молекула глицерина в каталитическом центре не могла способствовать кристаллизации фермента в закрытой конформации, поскольку глицерин содержался только в растворе криопротектанта, в который кристаллы помещались непосредственно перед сбором данных.
Остатки каталитического центра структуры апо-МогФДГ-закрытая находятся практически в тех же конформациях, что и в холо-МогФДГ (отклонения в позициях атомов не превышают 0.6 А), т.е. находятся в каталитически-активной конформации. Этот факт является значительным
отличием структуры апо-МогФДГ-закрытая от структур апо-РэеФДГ и апо-МогФДГ, в которых остатки каталитического центра, относящиеся к разным доменам, пространственно удалены друг от друга из-за открытой конформации фермента, петля 122-125 имеет две конформации основной цепи, а остаток Arg284 имеет несколько конформации боковой цепи. Таким образом, можно сделать вывод, что переход фермента к закрытой конформации приводит к фиксации остатков каталитического центра в каталитически-активной конформации даже без связывания кофермента.
Сравнение структур апо-МогФДГ-закрытая и холо-МогФДГ показало, что связывание кофермента вызывает конформационные изменения фермента, которые не происходят при переходе фермента в закрытую конформацию без связывания кофермента. В сайте связывания адениновой части НАД+ позиции Са атомов в этих структурах различаются более чем на 0.5 А для остатков 221-226, 259-260 и 379-383 (Рис. 5). В структуре апо-МогФДГ-закрытая эти три фрагмента не связаны между собой водородными связями, а боковые цепи четырех остатков (Arg222, Glu260, His379 и Ser382) разупорядочены и не локализованы по картам электронной плотности. Кроме того, в сайте связывания адениновой части НАД+ не обнаружены дополнительные молекулы, что указывает на заполнение этого сайта неупорядоченным растворителем в отсутствие кофермента. Таким образом, независимо от конформации фермента, ряд остатков аденин-связывающего сайта разупорядочен в апо-форме МогФДГ.
Рис. 5. Аденин-связывающий сайт в
структурах апо-МогФДГ-закрытая
(зеленая) и холо-МогФДГ (малиновая). Водородные связи изображены в виде красных пунктирных линий. Боковые цепи остатков Arg222, Glu260, His 379 и Ser382 в структуре апо-МогФДГ-закрытая не локализованы по картам электронной плотности.
Рис. 6. Различие конформации петли 221-226 в апо-МогФДГ-закрытая (серая), апо-МогФДГ (фиолетовая), апо-РэеФДГ (зеленая), холо-МогФДГ (красная) и холо-РэеФДГ (желтая). Структуры совмещены по всем Са атомам кофермент-связывающего домена.
В холо-форме МогФДГ кофермент образует пять водородных связей с остатками на участках 221-226, 259-260 и 379-383: с остатками Asp221 (две связи), Glu260, His379 (через молекулы воды) и Ser380 (Рис. 5, Рис. 3). По-видимому, взаимодействие с коферментом вызывает смещение этих трех участков друг навстречу другу, что приводит к образованию пяти прямых водородных связей между ними. В результате, область связывания адениновой части НАД+ структурируется и компактизируется (Рис. 5). Максимальный сдвиг Са атомов происходит на участке 221-226 кофермент-связывающего домена и составляет 2.3 А (остаток His223). Конформация этой петли одинакова в структурах апо-МогФДГ, апо-МогФДГ-закрытая и апо-РэеФДГ, несмотря на то, что в случае апо-МогФДГ-закрытая фермент имеет закрытую конформацию. Конформация петли 221-226 в холо-формах МогФДГ и РэеФДГ также совпадает и отличается от её конформации в апо-формах (Рис. 6). Таким образом, можно сделать вывод, что изменение конформации петли 221-226 вызвано только связыванием кофермента, и не связано с переходом фермента в закрытую конформацию.
Решение уникальной структуры апо-формы МогФДГ в закрытой конформации позволило более полно охарактеризовать роль С-концевого фрагмента 375-399 и кофермента в стабилизации закрытой конформации бактериальных ФДГ. Остатки каталитического домена 375-391 структурируются при переходе фермента к закрытой конформации и способствуют её стабилизации, поскольку в результате этого между каталитическим и кофермент-связывающим доменами образуется 7 дополнительных водородных связей посредством этих остатков. Дополнительные остатки МогФДГ 392-399 также участвуют в междоменных взаимодействиях, образуя две водородные связи (Asn317-Glu397) и гидрофобный кластер (Тгр99, Рго314, Туг396 и Тгр177 соседней субъединицы димера).
Кофермент связывается в основном с кофермент-связывающим доменом, но также образует 9 водородных связей (6 из них через молекулы воды) с каталитическим доменом (Рис. 3). Таким образом, кофермент значительно стабилизирует закрытую конформацию фермента, поскольку он связывает домены между собой. Однако, кофермент также способствует структурированию С-концевого фрагмента 375-399, поскольку образует водородные связи с остатками His379 (через молекулу воды W21), Туг381 (через молекулы воды W27 и W84) и Ser380 (Рис. 5). Кроме того, связывание кофермента вызывает изменение конформации петли 221-226 (Рис. 6), приводя к образованию пяти водородных связей между этой петлей и С-концевыми остатками 379-382 (Рис. 5), что также способствует структурированию С-концевого фрагмента 375-391 и является междоменными взаимодействиями.
Данные малоуглового рентгеновского рассеивания свидетельствуют о том, что одного кофермента недостаточно для перехода ФДГ в закрытую
конформацию, также необходимо связывание субстрата (иона формиата) или ингибитора (иона азида). Анализ структур ФДГ показал, что это происходит по двум причинам. Во-первых, субстрат/ингибитор связывается с остатками из обоих доменов, связывая их между собой. Во-вторых, отрицательный заряд субстрата/ингибитора способствует уменьшению электростатического отталкивания между положительно заряженными остатком каталитического центра Arg284 и никотинамидной частью НАД+.
3. Структуры холо- и апо-форм АгаФДГ
Холо-форма АгаФДГ
При анализе пространственных структур АгаФДГ выяснилось, что ход полипептидной цепи АгаФДГ и РэеФДГ на участке 48-374 (нумерация по РэеФДГ) практически одинаков. Поэтому, для удобства сравнительного анализа, остатки структур АгаФДГ были пронумерованы в соответствии с аминокислотной последовательностью 48-374 РэеФДГ (Рис. 2).
В независимой части элементарной ячейки структуры холо-АгаФДГ содержится 6 молекул (т.е. 12 субъединиц) АгаФДГ в закрытой конформации в комплексе с НАД+ и ионом азида. В ходе сравнительного анализа выяснилось, что в структуре присутствуют два сорта этих молекул: две молекулы (А)(В) и (C)(D), в которых субъединицы похожи друг на друга, и остальные четыре молекулы, в которых субъединицы одной молекулы несколько отличаются. Субъединицы холо-АгаФДГ отличаются относительным расположением каталитических доменов относительно соответствующих кофермент-связывающих (разница 0.7-2.7) и конформацией остатков 39-48 (максимальное различие в позициях Са атомов 4.8 А). На Рис. 7 представлена суперпозиция по Са атомам
кофермент-связывающих доменов
максимально различающихся
субъединиц в структуре - (А) и (I) (RMSD Са атомов составляет 0.53 А).
gpf^'
Остатки 39-48
Рис. 7. Суперпозиция по кофермент-связывающим доменам субъединиц (А) (синяя) и (I) (зеленая) структуры холо-АгаФДГ. Молекула НАД+ показана фиолетовым цветом, ион азида - красным цветом.
Полипептидная цепь субъединицы АгаФДГ организована в глобулярную двухдоменную структуру, подобную структуре бактериальных ФДГ (Рис. 8): кофермент-связывающий домен АгаФДГ образован аминокислотными остатками 147-333, а каталитический домен сформирован остатками 28-146 и 334-378. Во всех субъединицах структуры холо-АгаФДГ
не локализованы по картам электронной плотности шесть N-концевых остатков (Рис. 2). С другой стороны, в отличие от структур холо-форм бактериальных ФДГ, в структуре холо-АгаФДГ локализованы все С-концевые аминокислотные остатки полипептидной цепи. Отчасти, это связано с тем, что в АгаФДГ С-конец короче на 22 остатка, чем в РэеФДГ.
Рис. 8. Ход полипептидной цепи димерной молекулы АгаФДГ в холо- (слева) и апо-(справа) форме. Окраска приведена в соответствии с элементами вторичной структуры. Некристаллографическая ось второго порядка, связывающая субъединицы димера, направлена перпендикулярно плоскости рисунка. Молекула НАД+ показана моделью малинового цвета, ион азида - красного.
Кофермент-связывающие домены МогФДГ и АгаФДГ имеют практически одинаковый ход полипептидной цепи (Рис. 9) и основные элементы вторичной структуры (Рис. 2). Значение RMSD Са атомов при суперпозиции остатков 147-333 холо-форм МогФДГ и АгаФДГ составило 0.96 А, различия в позициях Са атомов сравниваемых остатков не
превышают 2.3 А.
Рис. 9. Сравнение кофермент-
связывающих доменов
субъединиц (А) холо-форм
АгаФДГ (синяя) и МогФДГ
(темно-красная) при
суперпозиции по остаткам 147-333. Молекула НАД+ показана фиолетовым цветом, ион азида - красным цветом.
Сравнение каталитических доменов структур холо-АгаФДГ и холо-МогФДГ при суперпозиции по остаткам 30-38 (1-9 в МогФДГ), 49-146 и 334-369 приведено на Рис. 10. N-концевые остатки 39-48 и С-концевые остатки 370-378 структуры холо-АгаФДГ в сравнении не участвовали, поскольку ход полипептидной цепи ферментов на этих участках значительно отличается. Значение RMSD Са атомов при такой суперпозиции составило 0.58 А, при этом различия в позициях Са атомов сравниваемых остатков не превышают
1.3 А. На участках 30-38 (1-9 в МогФДГ), 49-146 и 334-369 основные элементы вторичной структуры каталитических доменов структур холо-АгаФДГ и холо-МогФДГ практически одинаковы, за исключением небольших отличий в их длине (Рис. 2).
Рис. 10. Сравнение каталитических доменов холо-форм АгаФДГ (синяя) и МогФДГ (темно-красная), при суперпозиции по остаткам 30-38 (1-9 в МогФДГ), 49-146 и 334-369. Отличающиеся остатки МогФДГ 10-48 и 370-399 показаны красным цветом. Молекула НАД+ показана фиолетовым цветом, ион азида - красным цветом.
Основные отличия пространственной структуры АгаФДГ от структур бактериальных ФДГ заключаются в замене длинной N-концевой петли 10-48 коротким участком 39-48 и в отсутствии С-концевых остатков 375-378 и 383-401 (Рис. 10). Остатки 40-46 образуют дополнительную, по отношению к структурам бактериальных ФДГ, а-спираль а0 (Рис. 2). Из-за отличия в организации N-конца площадь димерного контакта в АгаФДГ меньше на 24% в сравнении с МогФДГ и составляет 3023 А2. При этом в димерном контакте АгаФДГ участвует всего 32 водородных связи, что гораздо меньше в сравнении с 42 у РэеФДГ и 54 у МогФДГ.
Анализ структуры холо-АгаФДГ, являющейся первой структурой холо-формы эукариотической ФДГ, показал, что каталитические центры эукариотических и прокариотических устроены практически одинаково (Рис. 4). Каталитический центр АгаФДГ отличается только одной заменой Thr282Asn среди остатков, имеющих водородные связи с субстратом и/или коферментом. Однако эта замена не приводит к изменению количества и характера водородных связей, поскольку 282-й остаток в этих структурах взаимодействует с коферментом посредством атома кислорода основной цепи.
Связывание кофермента в структурах холо-АгаФДГ и холо-МогФДГ значительно отличается (Рис. 3). Водородные связи между молекулой кофермента и остатками Ser147, Ser380, His258 и Glu260, присутствующие в структуре холо-МогФДГ, в структуре холо-АгаФДГ отсутствуют или заменены на водородные связи через молекулы воды. Причем дополнительных, относительно структуры холо-МогФДГ, прямых водородных связей
кофермента с белком в структуре холо-АгаФДГ нет. В результате, адениновая часть кофермента, имеющая две прямые водородные связи с белком в структуре холо-МогФДГ (с остатками His258 и Glu260), в структуре холо-АгаФДГ имеет только опосредованные молекулами воды водородные связи с белком. Пирофосфатная часть кофермента также образует на две водородные связи меньше: в структуре АгаФДГ остаток Ser147 заменен на валин, а остаток Ser380 заменен на Gln376 (пространственное расположение остатка Gln376 в структуре холо-АгаФДГ эквивалентно расположению остатка Ser380 в структуре холо-МогФДГ). При этом в структуре холо-АгаФДГ больше на три водородных связей кофермента с молекулами воды, связанными с ферментом. Гидрофобный аденинин-связывающий карман кофермент-связывающего домена в АгаФДГ и МогФДГ устроен практически одинаково. На основе проведенного анализа пространственных структур для улучшения связывания кофермента предложены мутации Val147Ser, Thr258His, Lys260Glu и Gln376Ser для АгаФДГ и мутации Val119Ser, Gly233Glu и Ala356Ser для СЬоФДГ.
Апо-форма АгаФДГ
В независимой части элементарной ячейки структуры апо-АгаФДГ находится одна молекула фермента в открытой конформации, т.е. две субъединицы, связанные некристаллографической поворотной осью симметрии второго порядка (Рис. 8). Субъединицы в структуре апо-формы АгаФДГ очень похожи: RMSD Са атомов при попарной суперпозиции субъединиц равно 0.05 А. В апо-АгаФДГ, как и в холо-АгаФДГ, не локализованы по картам электронной плотности шесть N-концевых остатков (Рис. 2). В отличие от структур апо-форм бактериальных ФДГ, в структуре АгаФДГ локализованы все С-концевые аминокислотные остатки полипептидной цепи, также как и в холо-форме.
Апо-форма АгаФДГ имеет гораздо более открытую конформацию, в сравнении с бактериальными ФДГ, что может быть объяснено заменой длинной жесткой петли 10-48 на короткий и гибкий участок 39-48 в пространственной структуре АгаФДГ (Рис. 7, Рис. 10). Как и в апо-формах других ФДГ, остатки каталитического центра в апо-АгаФДГ, относящиеся к разным доменам (Ие122 и Asn146 каталитического домена и Arg284 и His332 кофермент-связывающего домена), пространственно разнесены друг от друга из-за расхождения доменов в открытой конформации фермента. Остаток Arg284 имеет одну конформацию, однако атомы боковой цепи этого остатка имеют относительно высокие температурные факторы, что свидетельствует о его высокой конформационной подвижности. Петля каталитического центра 122-125 имеет такую же конформацию, как в холо-АгаФДГ.
Как следует из сравнения структур апо- и холо-форм АгаФДГ, при связывании НАД+ и иона азида молекула АгаФДГ приобретает закрытую конформацию, как и в бактериальных ФДГ. Каталитический домен
смещается как единое целое в строну кофермент-связывающего на угол ~22, что на 10-14 больше, чем для бактериальных ФДГ, из-за более открытой конформации апо-АгаФДГ. Небольшие отличия в организации доменов в апо- и холо-АгаФДГ (отклонения Са атомов на 1.0-3.4 А относительно домена, к которому они относятся) вызваны связыванием кофермента и образованием водородных связей с приблизившимися остатками С-концевого фрагмента 369-378 к кофермент-связывающему домену (остатки 222-223 и 257-261), подстройкой остатков каталитического центра (остатки 123 и 125) и подстройкой остатков, участвующих в междоменных взаимодействиях (остатки 39-48, 174-177, 184-185, 313, 316, 334-336, 369-378). Сближение доменов приводит к компактизации каталитического центра. Значительным отличием АгаФДГ от бактериальных ФДГ является отсутствие длинного С-концевого фрагмента, который структурируется при переходе к закрытой конформации: вместо этого С-концевые остатки 369-378 меняют свою конформацию со сдвигом Са атомов не более чем на 1.1-2.9 А. Кроме того, в случае АгаФДГ нет такого значительного изменения конформации петли 221-226 (максимальное смещение Са атомов составляет 1.3 А в сравнении с 2.3 А в МогФДГ) при связывании кофермента, что может быть связано с отличиями в организации аденин-связывающего сайта (Рис. 3).
4. Структура холо-формы МогФДГ с атомным разрешением
Значительным преимуществом атомного разрешения является большое количество дифракционных данных относительно количества уточняемых параметров, что позволяет уточнять температурные факторы неводородных атомов в анизотропном приближении. Путем увеличения времени кристаллизации удалось вырастить кристалл холо-МогФДГ (тройной комплекс МогФДГ-НАД+-азид), пригодный для сбора дифракционных данных с атомным разрешением.
Asp 308
Не 122
Агд284
н і
н-.
Г
<^С2-Н
н f
ADPR
н \
н-.
-се.
** н
ADPR
\ .н
Рис 11. Структура каталитического центра холо-МогФДГ с разрешением 1.1 А. Карта электронной плотности с коэффициентами 2|F0| - |FC| показана для НАД+ и азида с уровнем срезки 1.0 о.
Рис. 12. Переход никотинамидной группы НАД+ в биполярную форму.
Кристалл оказался изоморфным кристаллам, использованным для решения структуры холо-МогФДГ с разрешением 1.95 А. Эти структуры практически идентичны: RMSD Са атомов равно 0.30 А, при этом максимальное отклонение Са атомов составляет 1.1 А (остаток Ser18). Координаты атомов боковых цепей 18 остатков, локализованных на поверхности белковой глобулы, отличаются более чем на 1 А, причем максимальное отличие составляет 9 А (остаток Arg26).
Структура с атомным разрешением позволила гораздо более полно и достоверно определить структуру растворителя и более точно идентифицировать альтернативные конформации остатков. На основании анализа значений температурных факторов и пиков электронной плотности удалось различить большинство атомов азота, кислорода и углерода, что дало возможность однозначно установить поворотные изомеры боковых цепей остатков гистидина и большинства остатков аспарагина и глютамина. Данные структуры с атомным разрешением подтвердили, что в каталитическом центре МогФДГ карбоксамидная группа кофермента зафиксирована водородными связями с остатками каталитического центра в транс-конформации (Рис. 11, атом 07 направлен в сторону атома С4), которая, согласно квантово-механическим расчетам для газовой фазы, на 2 ккал/моль менее выгодна чем цис-конформация. Кроме того, подтверждено наличие водородной связи между ионом азида и остатком His332 в структуре холо-МогФДГ (расстояние равно 3.2 А).
Согласно литературным данным, тройной комплекс ФДГ-НАД+-азид является стабильным аналогом переходного состояния ферментативной реакции. Ранее на основании исследования кинетических изотопных эффектов, а также расчетными теоретическими методами, было показано, что в переходном состоянии катализируемой ФДГ реакции молекула кофермента, находящаяся в энергетически-возбужденной транс-конформации, может приобретать т.н. биполярную форму (Рис. 12). При этом должно наблюдаться возрастание отрицательного заряда на атоме 07 карбоксамидной группы, а также уменьшение длины связи СЗ-С7 и увеличение длины связи С7-07 по сравнению с молекулой кофермента в свободном состоянии. Данные изменения способствуют увеличению частичного положительного заряда на атоме С4 кофермента, повышая его электрофильность и тем самым благоприятствуя скорость-лимитирующему переносу гидрид-иона и протеканию ферментативной реакции.
В результате отдельного цикла уточнения программой REFMAC с ослабленными ограничениями на длины связей никотинамидной группы длина связи С7-07 составила 1.29 А , что на 0.06 А длиннее стандартного значения, а длина связи СЗ-С7 составила 1.43 А, что на 0.07 А короче стандартного значения. Эти различия всего в 1.3 раза больше, чем ошибка в определении длин связей, оцененная как сумма двух средневзвешенных ошибок координат атомов (таблица 3). Тем не менее, наши
экспериментальные данные отражают тенденцию к изменению длин ковалентных связей, соответствующую приобретению никотинамидной группой кофермента биполярной формы в переходном состоянии ферментативной реакции, постулированной ранее.
