Введение к работе
Актуальность проблемы
Транскетолаза (ТК) катализирует расщепление С-С связи субстрата донора (кетозы) и перенос образовавшегося двууглеродного фрагмента, остатка гликольальдегида, на субстрат-акцептор, функцию которого выполняют различного рода альдегиды. Фермент обладает широкой специфичностью, как по отношению к субстрату-донору, так и по отношению к субстрату-акцептору. Наряду с двусубстратной, трансферазной реакцией, ТК способна катализировать и односубстратную реакцию, с использованием только субстрата-донора, в отсутствие субстрата-акцептора. Продуктом реакции в этом случае является эритрулоза, которая образуется в результате конденсации двух остатков гликольальдегида, образовавшихся в результате расщепления двух молекул субстрата-донора.
Транскетолазная реакция необратима только в том случае, когда в качестве субстрата-донора используется гидроксипируват.
Кофакторами ТК являются ТДФ и ионы двухвалентных металлов. В нативном холоферменте обнаружен только Са2+ в количестве 2 г атом на моль белка. Другие двухвалентные катионы с успехом способны его заменить, причем на общей активности фермента это, по существу, не сказывается. В то же время, сравнительные исследования, проведенные с использованием в качестве кофактора Ca2+ и Mg2+, показали, что природа катиона существенно влияет на конформационные характеристики ТК.
Транскетолаза является простейшим представителем тиаминдифосфат-зависимых ферментов, состоит из двух идентичных субъединиц, имеет два активных центра. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae была первым тиаминдифосфат-зависимым ферментом, для которого был сделан РСА, определена пространственная структура апо- и холофермента, идентифицированы функциональные группы кофермента и апобелка, подтверждены данные о наличии в ферменте ионов кальция, по одному на активный центр.
Цель исследования
Целью настоящей диссертационной работы было исследование взаимодействия холотранскетолазы с физиологическими субстратами, ксилулозо-5-фосфатом и рибозо-5-фосфатом, и их каталитических превращений в отсутствие и в присутствии извне добавленных катионов – Ca2+ и Mg2+.
Задачи исследования
-
Выявить влияние ионов двухвалентных металлов на кинетические характеристики фермента.
-
Определить неэквивалентность активных центров для транскетолазы.
-
Исследовать влияние ингибитора феррицианида на активные центры транскетолазы.
Научная новизна работы
Впервые показано, что для проявления каталитической активности холотранскетолазы достаточно наличия только структурированных в её составе ионов кальция.
Установлено, что извне добавленный Ca2+ повышает общую активность холотранскетолазы, в равной степени выраженную по отношению к каждому из двух активных центров.
На основе данных проведен количественный анализ процесса взаимодействия с транскетолазой как субстрата-донора (ксилулозо-5-фосфата), так и субстрата-акцептора (рибозо-5-фосфата). Определены соответствующие значения Кm и Vmax.
Показано, что исходно, в отсутствие свободных двухвалентных катионов, активные центры холотранскетолазы эквивалентны как по отношению их сродства к обоим субстратам, так и по их каталитической активности. В присутствии свободного, извне добавленного Са2+, выявляется их неэквивалентность – индуцируется отрицательная кооперативность при связывании обоих субстратов и положительная кооперативность – при их каталитическом превращении. В присутствии же Mg2+, вместо ионов кальция, неэквивалентность активных центров не проявляется.
Выявлена неэквивалентность активных центров холотранскетолазы по их восприимчивости к ингибирующему действию искусственных акцепторов электронов.
Теоретическое и практическое значение работы
Теоретическое значение работы состоит в формировании новых фундаментальных представлений о механизме функционирования и регуляции транскетолазы. Под механизмом функционирования, в данном случае, следует понимать процессы взаимодействия фермента с кофакторами, связывания субстратов и их каталитические превращения, характеристики индивидуальных стадий этих процессов, что открывает новые возможности в исследовании тиаминдифосфат-зависимых ферментов.
Практическое значение работы: предлагаемые методы получения транскетолазы с одним функционирующим активным центром могут служить основой при разработке аналогичных методов, применительно к другим ферментам.
Результаты работы, касающиеся влияния двухвалентных катионов на кинетические характеристики транскетолазы, могут быть использованы при изучении других тиаминдифосфат-зависимых ферментов.
Представленные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии и биохимии, а также в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.
Научные положения, выносимые на защиту
-
Наличие двух структурированных в составе молекулы холоТК атомов кальция оказывается достаточным для проявления каталитической активности фермента.
-
Ионы двухвалентных металлов влияют на общую активность холотранскетолазы.
-
Неэквивалентность активных центров транскетолазы определяется только в присутствии свободного, извне добавленного Са2+, в отличие от ионов магния, которые не способны индуцировать неэквивалентность.
-
Восприимчивость активных центров транскетолазы, сформированных при участии разных таутомерных форм тиаминдифосфата, неодинакова к воздействию феррицианида.
Апробация результатов исследований
Результаты исследований были неоднократно представлены и обсуждены на семинарах отдела биохимии животной клетки НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского и на совместном заседании отдела биохимии животной клетки и факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М. В. Ломоносова, а также на конференциях молодых ученых “Ломоносов 2006” (Москва, 2006) и “Ломоносов 2008” (Москва, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению результатов и их обсуждений, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и содержит 4 таблицы. Библиографический указатель включает в себя 84 источника: 22
отечественных и 62 иностранных авторов.
