Введение к работе
Актуальность проблеми.В настоящее гремя одной их важных проблем нейробиологин является выяснение механизмов действия экзогенных и эндогенных лигандов на неирорецепторы. В ряду многообразных и широкораспроетраненннх нейрорецепторов для различных медиаторов а гориоков особое место занимают ошатные рецепторы, через которые реализуются эффекты опиоидных пептидов и производных морфина (опиаты) (Belluzl et al., 1976; їїеі et al., 1977j Fujlraoto, Holmee, 1990).
Опиаты известны человечеству не одно тысячелетие, тогда как опиоидные пептиды была открыты в 1973 году. Интенсивное исследование свойств последних позволило получать важные сведения о строении, распределении, основных закономерностях взаимодействия опиовдов с опиатныда рецепторами мозга (Hughes, 1978} Snyder et al., 1979 Siron, Hiller,1989). Вместе с тем, в настоящее время появшшсь сведения и об опаатных рецепторах: их гетерогенности, распределении в нервной системе млекопитающих, гликопротевдной природа и взаимодействии этих рецепторов с радиолигандами (Zukin, Zukin, 1981; Майский и др., 1982; Варфоломеев и др., 1985). Показано такое, что эти рецепторы сопряжены с аденилатциклазой через С-белки и вносят вклад в работу К+- и Са2+-каиалов (Wong et al., 1989; Polaa-tron. et al., 1990; McFadzean, 1988).
Однако, до сих пор не выяснены вопросы о молекулярных основах гетерогенности оппатных рецепторов (Demoliou-Hason, Barnard, 1990). Представляет интерес и вопрос о субтипах опиатных рецепторов, их составе в механизмах функционирования. Несомненно, что эта информация будет полезна для поиска и создания новых лекарственных препаратов, воздействующих на центральную нервную систему через опиатныз рецепторы.
Известно, что длительное применение опиатов в качестве пекарственных веществ с аналгетяческада свойствами сопряжено с зозникковением зависимости. Для поиска новых аналгетических препаратов, не имещих этого вредного побочного эффекта, «обходимо изучение механизмов их действия на организм и, в частности, на мозг. Наиболее перспективный путем создания ювых лекарственных соединений является синтез веществ, родственных природным физиологически активным соединениям, а имен-то, пептидам (Тагов, I982j Fujlmoto, Holmes, 1990). Вместа о
- г -теи, изучение функция синтетических опиоидов в ЦНС, например, даларгина (Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг), только начинается (Сма-гин и др., 1983; Варфоломеев и др., 1985; Ярыгин, 1990). До сих пор не известны возможные мишени действия этих синтетических опиоидов в нервной системе.
В связи с вышесказанным целесообразно провести сравнительное исследование свойств тех компонентов синаптических мембран, с которыми взаимодействуют эндогенный (р-эндорфин) и синтетический (даларгин) опиоиды. Исследование действия нового опяойдного пептида на мозг млекопитающих мокет оказаться полезным для выяснения механизмов лекарственной зависимости, создания принципиально новых препаратов и позволит получить новые сведения о строении и функции опиатных рецепторов.
Работа выполнена в рамках программы Президиума Академии наук СССР "Сигнал" и рамках плановой темы лаборатории функциональной нейрохииаи "Нейрохимические характеристики состояния головного мозга при нарушениях его функций в условиях экстремальных воздействий" Номер гос.регистрации 01.86.0109063.
Целью работы является исследование свойств опватсвязываю-щйх белков, изолированных из синаптических мембран мозга крас с помощью специфических сорбентов, содержащих экзогенный и эндогенный опиоидные пептиды.
1. Разработать способ выделения опиатсвязывающих белков иг
синаптических мембран мозга крыс с помощь» новых аффин
ных сорбентов, содержащих ковалентно иммобилизованные
опиоидные пептида: в-зндорфин и даларгин.
-
Провести сравнительное исследование кинетических параметров связывания опиатсвязыввющих белков, очищенных с помощью э-зндорфии- и даларгин-ш-аминогексилсефарозы 4В, с Н-налоксонои а К-ДАДЛЕ, и некоторых физико-химических свойств этих белков.
-
Исследовать дефосфорилирущую активность ошатсвязы-вавдих белков, изолированных из синаптических мембран мозга крыс с применением разных сорбентов.
-
Исследовать изолированные опиатсвязывакщие белки с помощью поликлональкых антител к ним.
Основные положения, выносимые не защиту
П Белки, изолированные иэ синаптических мембран мозга
крыс с поиощы) специально синтезированного аффинного сорбента, содержащего иммобилизованный эндогенный пептид - р-эндорфин (ОСБІ и 0СБ2) и белки, изолированные с прииенениеы синтетического опиоидаого пептида - даларгина (ДСБ^аСІ^* спвЦИФ^60101 связывают лиганды опиатных рецепторов ( Н-налоксон и ЭН-ДАДЛЕ).
2. Кинетические параметры специфического связывания
белков ОСБІ, 0СБ2 и flCBtfaCj как с 3Н-налоксоноіл, так и
Н-ДАДЛЕ имеют близкие значения. Величины констант свидетельствуют о той, что эти белки имеют более высокое сродство к ДАДЛЕ, чем к налоксону. Исследование молекулярных масс, субь-единичного состава (29, 45, 66 кД) а изоэлектрических свойств (pi 5,3-5,4) сравниваемых белков свидетельствует о том, что эти белки имеют сходные физико-химические характеристики и являются компонентами опиатных рецепторов.
-
Элюированные раствором ДАГО мли налоксона ДСБ специфически связывают Н-налоксон и Н-ДДДЛЕ. Белки, элюированные ДАГО, имеют более высокое число мест связывания и более высо-кую аффинность к Н-налоксону, чей белки, элюированные налок-соном. Эта белки являются гликопротеидами с молекулярной массой субьединицы 42 кД и изоэлектрической. точкой 5,4, соответствуют компонентам икн и дельта-рецепторов.
-
Поликлоналыше антитела, полученные к ДСБМаСрИНГиби-руют связывание этих белков с Н-налоксоном. Иммуноблотинг подтвердил наличие в синаптических мембранах белков с молекулярной массой 45 и 66 кД, характерной для опиатевязывающих белков. Иимуноыорфологическое исследование срезов мозга крыс с помощью этих антител позволило выявить опиатсвязывающие белки в различных структурах мозга.
Научная новизна и теоретическое значение работы. Впервые из синаптических мембран мозга крыс были изолированы белковые компоненты - мишени действия нового лекарственного препарата - гексапептида даларгина, производного лей-энкефалина.
Проведено сравнительное исследование физико-химических свойств опиатсвязывающих белков, выделенных с помощью эндогенного (р-эндорфина) и синтетического (даларгина) опиоидных пептидов, которое показало сходство этих белков и позволило отнести их к компонентам опиатных рецепторов ию- и дельта-типа.
Выделены новые ранее не охарактеризованные опиатсвязываю-
-4.-
щие белки с молекулярной кассой 42 кД и показано, 'что они являются гликопротеидаии. Полученные результаты позволяют дополнить факты, касающиеся одного вз наиболее значимых классов модуляторных нейрорецепторов.
Било показано, что выделенные наші опивтсвязывающие белка обладают дефосфорнлирупцей активностью, которая может играть важную роль в механизмах трансдукции сигнала агонистов а антагонистов опиатных рецепторов.
С помощью поликлональных антител к ДС%аср изолированным из синаптическах мембран иозга крыс, впервые определена локализация in situ (на срезах нозга) мембранных компонентов -иишекий действия даларгина.
Научно-практическое значение полученных результатов.
Впервые показано, что даларгин, - язво- и ранозагивляющий препарат, способен эффективно воздействовать на ЩС ш имеет молекулярные шшени в ткани головного мозга.
Полученные сведения о способности даларгина непосредственно взаимодействовать с опиатныш рецепторами ЦНС йогу? оказаться полезными как для создания принципиально новых лекарственных препаратов пептидной природы, так и для выяснения механизмов лекарственной зависимости. .
Полихлональкые антитела в выделенным нвми опивтсвязыв8Г>-цаы белкам могут быть рекомендован» для использования в качестве маркеров при исследовании процессов формирования и деградации опиатных рецепторов в ЦНС в норме и при патологии.
Апробация, работы. Материалы диссертации были представлены на X Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы "Фундаментальные достигання нейрохимда - медицине" (Горький,I987)/ на Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов и медиаторов на вффекторные клетки" (Суздаль, 1989), на 12-Мевду-народаой конференции международного нейрохимического общества (Португалия,1989), на 5 «еадународном симпозиуме-школе молодых ученых "Организация и адаптация функций мозга" (Болгария, 1989). По материалам работы опубликовано 3 научных статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа содержит ИЗ страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1>, материалов и методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), обсуждения результатов (глава 4}, выводов и указателя