Введение к работе
Актуальность проблемы Ионы железа являются жизненно необходимыми элементами, поскольку вовлечены в разнообразные метаболические процессы, а именно: связывание и перенос кислорода, транспорт электронов, окислительно-восстановительные реакции, синтез ДНК и др. (Watts et al., 2003). В свободной форме ионы железа чрезвычайно токсичны в связи с тем, что способны служить катализаторами в реакциях Фентона и Хабера-Вайса, приводящих к образованию свободных радикалов (Gutteridge and Halliwell, 2000). Поэтому обмен железа в организме реализуется при участии специфических белков, связывающих эти ионы. Ключевыми белками, вовлеченными в обмен железа, являются: трансферрин-гликопротеин плазмы крови, осуществляющий доставку ионов железа клеткам различных тканей; рецептор трансферрина - интегральный мембранный белок, обеспечивающий поглощение комплекса трансферрин-железо и ферритин - внутриклеточный железодепонирующий белок. Функциональные нарушения со стороны этих белков приводят к дисбалансу обмена железа, индуцируют развитие окислительного стресса -процесса, имеющего крайне негативные последствия для жизнедеятельности клеток, вплоть до их гибели (Castagne et а]., 1999; Torti and Torti, 2002).
Поддержание сбалансированного обмена железа особенно важно в сетчатке глаза, поскольку для этой ткани характерен ряд особенностей, за счет которых она становится крайне уязвимой к воздействию окислительного стресса; при этом наиболее уязвимы фоторецепторные клетки. К числу этих особенностей относятся: уникальный жирнокислотный состав фоторецепторных мембран с максимальным содержанием полиненасыщенных жирных кислот (Wetzel et al., 1991); высокий уровень окислительного метаболизма (Berman, 1991); повышенное образование активных форм кислорода, высвобождающихся при фотовозбуждении зрительного пигмента родопсина (Shvedova et al., 1983) и в процессе фагоцитоза наружных сегментов палочек сетчатки клетками пигментного эпителия (Dorey et al., 1989); световая иррадиация. В связи с этим, поддержание строгого баланса при реализации процессов доставки, поглощения и депонирования ионов железа в этой ткани имеет принципиальное значение. ' Тем не менее, система ключевых белков, вовлеченных в обмен железа в сетчатке глаза млекопитающих не охарактеризована; имеются лишь единичные указания о наличии некоторых компонентов этой системы (Hunt and Davis, 1992; Davis and Hunt, 1994); отсутствуют данные о распределении ионов железа. Поскольку гематоретинальный барьер препятствует прямому доступу железа, связанного с трансферрином плазмы крови, можно ожидать определенных
особенностей в реализации процесса достаї кроЦРнЗ%йЩ)63&Н/№т этом
БИБЛИОТЕКА і
С. Петербург L | 09 300ja«T<X>7 {
' IIMilllgMH*
важнейшее значение имеет вопрос о природе компонента, осуществляющего непосредственную доставку этих ионов клеткам сетчатки. Известно, что для других тканей организма, отделенных тематическими барьерами (мозг, семенники), таким компонентом может быть трансферрин, локально синтезированный в пределах этих тканей (Huebers and Finch, 1987).
В связи с тем, что нарушения обмена железа сопутствуют течению большинства нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, рассеянный склероз и др., Thompson et al., 2001), значительный интерес представляет также вопрос об обмене этих ионов при нейродегенеративных состояниях сетчатки глаза (пигментный ретинит человека). Как известно, такие состояния сопровождаются развитием окислительного стресса, в ответ на который реализуется комплекс разнообразных изменений не только в сетчатке глаза, но и на уровне всего организма. Эти изменения направлены на повышение эффективности антиокислительных механизмов; наиболее изученными к настоящему времени являются изменения метаболизма докозагексаеновой кислоты (Anderson et al., 1999). В связи с чем можно ожидать подобных изменений со стороны компонентов, вовлеченных в обмен железа. При этом нельзя исключить вероятность возникновения негативных последствий для других тканей, как это показано в случае докозагексаеновой кислоты (Connor et al., 1997) при пигментном ретините человека.
Данные, накопленные за последние годы, свидетельствуют о том, что роль трансферрина и ферритина может быть более многогранной, чем обеспечение транспорта и депонирования железа. Известно, что ферритин обладает рядом ферментативных активностей (Torti and Torti, 2002; Метелица, Арапова, 1996); трансферрину отводят особую роль как фактору, необходимому для роста и пролиферации различных типов клеток (Zakin, 1992), стимулятору фагоцитоза в клетках иммунной системы (Sakamoto et al., 1997); кроме этого обсуждают нейромодуляторные свойства этого белка в связи с его способностью индуцировать изменения биоэлектрической активности клеток (Hyndman et al., 1991). Выяснение вопросов о том, в какой мере дополнительные функции транферрина и ферритина могут быть реализованы в сетчатке и других тканях, имеется ли при этом взаимосвязь со статусом железа и значима ли функциональная нагрузка - все это может иметь значение для понимания роли данных белков в нормальной физиологии клеток.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась характеристика системы ключевых компонентов, вовлеченных в обмен железа в сетчатке глаза млекопитающих в норме и при патологических состояниях. Соответственно были определены задачи работы. 1). Исследовать распределение ионов железа, провести иммунохимическую идентификацию трансферрина, рецептора трансферрина и ферритина в
сетчатке глаза крысы; изучить синтез и распределение этих белков Установить, в какой мере такое распределение характерно для сетчатки глаза млекопитающих.
2). Для выяснения способа преодоления гематоретинального барьера в наружной сетчатке крысы и выявления природы компонента, осуществляющего доставку железа фоторецепторным клеткам, провести идентификацию клеточной структуры, ответственной за синтез интраокулярного трансферрина. На основании полученных данных сделать заключение о способе доставки железа фоторецепторным клеткам сетчатки. 3). Провести соответствующее доказательство на экспериментальной модели крыс линии RCS, страдающих наследственной дегенерацией сетчатки, для которых характерно нарушение взаимодействия фоторецепторов и клеток пигментного эпителия глаза, формирующих наружную часть гематоретинального барьера.
4). В случае обнаружения нарушений обмена железа в сетчатке глаза крыс линии RCS, решить вопрос о наличии изменений, направленных на снижение пула железа. Установить, характерны ли подобные изменения для людей с различными формами пигментного ретинита.
5). Оценить статус железа в сетчатке глаза при различных состояниях этой ткани (свет-темнота). При обнаружении изменений, попытаться понять их функциональную значимость, для чего изучить возможность взаимодействия трансферрина и ферритина с ключевым ферментом трансдукции фотосигнала - фоторецепторной фосфодиэстеразой циклических нуклеотидов (ФДЭ ЦН). Выяснить вопрос о специфичности такого взаимодействия на примере других представителей семейства ФДЭ нейронального и экстраневрального происхождения.
Научная новизна. В результате проведенного комплексного исследования, охарактеризована система ключевых компонентов, вовлеченных в обмен железа в сетчатке глаза различных представителей млекопитающих. Показано, что во всех случаях преимущественным местом локализации всех компонентов этой системы являются фоторецепторные клетки сетчатки и пигментный эпителий глаза. Установлен способ преодоления наружной части гематоретинального барьера и выявлена природа компонента, осуществляющего доставку железа фоторецепторным клеткам сетчатки.
Впервые показано на модели крыс линии RCS с наследственной дистрофией сетчатки, что развитие нейродегенеративного процесса в сетчатке сопровождается резким дисбалансом обмена железа. Сопутствующий окислительный стресс вызывает комплекс изменений не только в сетчатке глаза, но и на уровне организма. Эти изменения затрагивают статус ионов железа и направлены на снижение пула этих
ионов в организме. Наличие сходных изменений характерно для больных людей, страдающих различными формами пигментного ретинита.
Показано, что перестройки статуса железа в организме крыс линии RCS, происходящие в период, критический для формирования пула железа в головном мозге, вызывают негативные последствия в этой ткани.
Впервые установлено, что комплекс биохимических изменений, реализующийся в сетчатке глаза в ответ на световое воздействие, затрагивает статус ионов железа, которые аккумулируются в ферритине. Возможная функциональная роль этих изменений может определяться тем, что в зависимости от степени насыщенности железом проявляется способность ферритина и трансферрина взаимодействовать с фоторецепторной ФДЭ. Способность к взаимодействию с белками, вовлеченными в обмен ионов железа, не являются уникальной особенностью фоторецепторной ФДЭ ЦН, а присуща и другим представителям этого семейства, различающимся по происхождению, молекулярной организации и способам регуляции.
Возможность вовлечения трансферрина и ферритина в процессы регуляции уровня ЦН позволяет сделать заключение о многогранной роли этих белков в разнообразных аспектах жизнедеятельности клеток.
Научно-практическая значимость работы. Результаты работы, свидетельствующие об общности распределения ключевых компонентов, вовлеченных в обмен железа в сетчатке глаза млекопитающих, имеют общебиологическое значение и вносят вклад в расшифровку механизмов, лежащих в основе обеспечения обмена железа в этой ткани.
Данные по выявлению способа преодоления наружной части гематоретинального барьера и природы компонента, осуществляющего доставку ионов железа фоторецепторным клеткам сетчатки, являются существенным вкладом в фундаментальные положения биологии, которые цитируются в зарубежных изданиях и могут быть использованы при чтении курса лекций в ВУЗах страны.
Данные, указывающие на возможность участия белков, вовлеченных в обмен железа, в процессах регуляции уровня ЦН, представляются чрезвычайно перспективными для расшифровки механизмов, посредством которых реализуется влияние этих белков на течение метаболических процессов и реализацию физиологических функций в клетках различных тканей.
Результаты работы, свидетельствующие о резком нарушении обмена железа при наследственной дегенерации сетчатки глаза, расширяют современные представления о патогенезе этого заболевания и могут быть полезны в офтальмологической практике. Разработка подходов, способствующих нормализации интраокулярного обмена железа, может
явиться многообещающей терапевтической стратегией, направленной на замедление развития пигментного ретинита человека.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1). Обмен железа в сетчатке глаза млекопитающих реализуется при участии системы ключевых компонентов, вовлеченных в обмен этих ионов: трансферрина, рецептора трансферрина и ферритина. Преимущественным местом локализации этих компонентов являются фоторецепторные клетки и пигментный эпителий глаза.
2). Механизм преодоления наружной части гематоретинального барьера реализуется за счет синтеза интраокулярного трансферрина. Структурой, ответственной за синтез этого белка, являются клетки пигментного эпителия глаза. В комплексе с локально синтезированным трансферрином может осуществляться доставка железа фоторецепторным клеткам сетчатки. 3). Целостность структурно - функциональных взаимоотношений сопряженной пары сетчатка-пигментный эпителий является необходимым условием для реализации процессса доставки ионов железа клеткам наружной ретины. Разобщение сетчатки и пигментного эпителия у крыс линии RCS блокирует этот процесс и индуцирует резкие нарушения интраокулярного обмена железа.
4). Комплекс изменений, направленных на снижение пула железа, реализуется на уровне организма у крыс линии RCS и выявляется при всех формах пигментного ретинита человека.
5). За счет возможности взаимодействия с ФДЭ ЦН, белки, вовлеченные в обмен железа (трансферрин и ферритин) могут участвовать в процессах регуляции уровня ЦН в клетках различных тканей.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты и положения работы доложены на Всероссийской Конференции "Свободнорадикальные механизмы церебральных патологий: теоретические и практические аспекты проблемы" (Москва, 1993); VI Международном съезде офтальмологов (Москва, 1994); 10 и 11 Симпозиуме Европейского нейрохимического общества (ESN) (Иерусалим, Израиль, 1994; Гронинген, Голландия, 1996); VI Международном симпозиуме по наследственным дегенерациям сетчатки (Иерусалим, Израиль, 1994); I Конференции молодых физиологов и биохимиков России «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций» (Санкт-Петербург, 1995); 19 Европейской Конференции по зрительному восприятию (Страсбург, Франция, 1996); II Съезде биохимического общества Российской Академии наук (Москва, 1997); VII Международном Симпозиуме «Железо в биологии и медицине» (Сен-Мало, Франция, 1997); Конгрессе ассоциации «Retina France»: «Vision
et recherche» (Париж, Франция, 1998); 13 Международном Конгрессе «Eye Research (ICER)» (Париж, Франция, 1998); 14 Международном Конгрессе «Eye Research» (Санта-Фе, США, 2000); 15 Международном Конгрессе «Eye Research» (Женева, Швейцария, 2002); 6 Международной Конференции по технологии микрозондов (Южная Африка, Спайр-Эстейт, Стелленбох, 1998); 7 Международной Конференции по технологии микрозондов (Бордо, Франция, 2000); Международном Европейском Конгрессе по пигментному эпителию сетчатки (Лиссабон, Португалия, 2000); ежегодных Международных Конгрессах ARVO (Association for research in vision and ophthalmology) (США, 1998-2003).
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы (из них статей - 21, тезисов докладов - 22).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация изложена на,? /" страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего J"i отечественных иЗ%иностранных источников. Работа иллюстрирована -/V таблицами и Iff рисунками.
