Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Моноаминоксидазы и их значение в развитии постстрессорных поведенческих расстройств (обзор литературы) 13
1.1 Регуляция активности МАО 15
1.2 Трансформация каталитической активности МАО 26
1.3 Нарушения обмена биогенных аминов и изменения активности МАО при ПТСР 31
1.4 Определение, диагностические критерии, подходы к лечению и экспериментальное моделирование ПТСР 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1 Моделирование изучаемых состояний в эксперименте 46
2.2 Биохимические методы исследования 48
2.3 Изучение поведенческих реакций животных 65
2.4 Статистическая обработка результатов 68
Глава 3. Результаты исследования 69
3.1 Дезаминирование биогенных аминов в головном мозге в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства 69
3.2 Изменения содержания биогенных аминов в головном мозге в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства 74
3.3 Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в гомогенатах головного мозга в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства 76
3.4 Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в мембранах митохондрий головного мозга в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства 80
3.5 Изменение каталитических свойств МАО печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства 86
3.6 Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в гомогенатах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства з
3.7 Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в митохондриальных мембранах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства 94
3.8 Глюкокортикоид – зависимые изменения активности моноаминоксидаз головного мозга при анксиогенном стрессе 100
3.9 Изменения нейроэтологических показателей в динамике развития экспериментального посттравматического стрессового расстройства 104
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 109
Заключение 133
Выводы 137
Список сокращений и условных обозначений 139
Список литературы
- Нарушения обмена биогенных аминов и изменения активности МАО при ПТСР
- Изучение поведенческих реакций животных
- Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в мембранах митохондрий головного мозга в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства
- Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в митохондриальных мембранах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Известно, что молекула моноаминоксидазы-А (МАО-А) способна к проявлению атипичной активности в результате модификации фермента и участвует в обмене нейромедиаторов – серотонина, норадреналина и адреналина, регулируя тем самым психические и когнитивные процессы (Горкин, В.З. Аминоксидазы и их значение в медицине. Москва: Медицина,1981.336 с). МАО печени участвует в биотрансформации ксенобиотиков - биогенных аминов эндогенного происхождения или поступающих через воротную вену (Strolin Benedetti, M., Tipton K.F., Whomsley R. Amine oxidases and monooxygenases in the in vivo metabolism of xenobiotic amines in humans: has the involvement of amine oxidases been neglected? Fundamental & clinical pharmacology. 2007.Т.21.№.5.С.467-480).
Поскольку при модификации МАО-А изменяется как субстратная, так и
ингибиторная специфичность фермента, возможны изменения метаболизма,
приводящие к формированию нового патогенного фактора (Горкин В.З., Камышенская
Н.Я., Киркель А.З. Медико-биологические аспекты биохимии аминов и других
азотистых оснований. Вестник РАМН.1995№2.С.12-17). Так, ключевая роль повышения
атипичной каталитической активности МАО-А доказана в случае экспериментальной
аудиогенной эпилепсии крыс (Райгородская, Д.И. Изменения каталитических свойств
митохондриальных моноаминоксидаз при аудиогенной эпилепсии в эксперименте.
Вопр.мед.химии.1991.Т.37.№.2.С.46-48); хронической алкогольной интоксикации
(Овчинникова, Л.Н., Горкин В.З. Об особенностях перекисного окисления липидов при алкогольной интоксикации. Вопросы медицинской химии.1989.Т.35.№.5.С.86-90); карциноме Эрлиха, лучевых поражениях, интоксикации контактными гербицидами, туберкулзе лгких (Горкин, В. З. Аминоксидазы и их значение в медицине. Москва: Медицина, 1981.336 с).
Основной причиной трансформации МАО-А является усиление процессов свободнорадикального окисления в микроокружении – митохондриальных мембранах, где молекулы фермента связаны с фосфолипидным слоем мембраны (Medvedev A.E. et al. The role of lipid peroxidation in the possible involvement of membrane-Bound monoamine oxidases in gamma-aminobutyric acid and glucosamine deamination in rat brain.Molecular and chemical neuropathology.1992.Т.16.№.1-2.С.187-201).
Известно, что посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) – это состояние, сопровождающееся развитием окислительного стресса (Синицкий, А. И. Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях: дис...д-ра мед. наук. А.И. Синицкий. Челябинск.2013). К сожалению, имеется мало данных о состоянии липопероксидации и карбонилирования белков как в органах в целом, так и митохондриях при ПТСР, а данные по трансформации каталитических свойств МАО-А и вовсе отсутствуют. Между тем, разнообразные реакции на тяжелый стресс и нарушения адаптации, в том числе посттравматическое стрессовое расстройство – это распространенные состояния, которые отличаются устойчивостью к психофармакотерапии, длительным лечением и, как следствие, побочным действием лекарственных средств (Аведисова, A.С. Психофармакотерапия больных с посттравматическим стрессовым расстройством. Журн. неврол. психиатр. им.С.С. Корсакова. 2009.Т.109.№.12.С. 46-49).
Несмотря на достаточно большое количество исследований, посвященных нарушениям обмена нейромедиаторов в развитии реакции на тяжелый стресс и
нарушения адаптации, конкретные патохимические механизмы их формирования, связанные с изменениями каталитических свойств моноаминоксидаз остаются неизвестными. Поскольку клиника посттравматического стрессового расстройства проявляется спустя латентный период после воздействия стрессора, а его развитие характеризуется стадийностью, представляется важным исследование обозначенных параметров не только в период сформировавшихся расстройств, но и в динамике их возникновения.
Цель исследования
Установить изменения каталитических свойств моноаминоксидаз головного мозга и печени, их взаимосвязи с интенсивностью свободнорадикального окисления, уровнями биогенных аминов-субстратов МАО и поведенческой активностью в динамике экспериментального моделирования ПТСР.
Задачи исследования
-
Выявить изменения окислительного дезаминирования серотонина, бензиламина, гамма-аминомасляной кислоты, глюкозамина в головном мозге в динамике развития экспериментального посттравматического стрессового расстройства.
-
Изучить изменения содержания моноаминов - нейромедиаторов (адреналин, норадреналин, 3,4-диоксифенилаланин, дофамин, гамма-аминомасляная кислота, серотонин) в головном мозге в зависимости от изменений каталитических свойств МАО в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства.
-
Изучить интенсивность липопероксидации и окислительной модификации белков в головном мозге в зависимости от изменений каталитических свойств МАО в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства.
-
Установить изменения окислительного дезаминирования серотонина, бензиламина и глюкозамина в печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства.
-
Изучить интенсивность липопероксидации и окислительной модификации белков в зависимости от изменений каталитических свойств МАО в печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства.
-
Изучить изменения нейроэтологических показателей в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства в зависимости от изменений каталитических свойств МАО.
Методология и методы исследования
Исследование выполнено на 75 лабораторных крысах. Для изучения динамики развития постстрессорных расстройств было сформировано четыре опытных группы, которые подвергались воздействию десятисуточного стрессора с дальнейшим периодом покоя продолжительностью от 3 до 14 суток. После этого животные подвергались нейроэтологическому тестированию и умерщвлению для взятия биоматериала на третьи (первая группа), седьмые (вторая группа), десятые (третья группа) и четырнадцатые (четвертая группа) сутки после окончания воздействия стрессора. Сравнение проводилось с контрольной группой животных, не подвергавшихся воздействию стрессора. Для изучения глюкокортикоид – зависимых изменений активности МАО была проведена отдельная серия экспериментов с использованием режима
редкочередующихся иммобилизаций (РЧИМ), а также РЧИМ с предварительным введением глюкокортикоидного антагониста RU38486 (Mifepristone, Sigma).
В работе использованы биохимические (получение суспензий мембран митохондрий головного мозга и печени, определение активности МАО, определение содержания продуктов перекисного окисления липидов, спонтанной и металл -катализируемой окислительной модификации белков, определение содержания кортикостерона, определение содержания белка, определение содержания адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА, серотонина, ГАМК), нейроэтологические (тесты «приподнятый крестообразный лабиринт», «открытое поле») и статистические методы исследования.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов и обоснованность выводов определяются
достаточным объемом наблюдений, использованием современных лабораторных методов исследования, применением адекватных задачам методов анализа. Результаты получены на сертифицированном оборудовании. Теория построена на известных, проверяемых фактах, согласуется с опубликованными в литературе данными других исследователей. Полученные результаты не противоречат данным, представленным в независимых источниках по данной тематике. В работе использованы современные методики сбора и обработки исходной информации с использованием пакета прикладных компьютерных программ.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II Всероссийской
научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего
тысячелетия», (ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-
Петербург, 2012 г.); на международной научно-практической конференции
«Медицинская помощь при тяжлой термической травме» (ГБОУ ВПО Южно
Уральский государственный медицинский университет Минздрава России, Челябинск,
2014 г.); на Международной научно-практической конференции «Актуальные
проблемы экологии и природопользования» (РУДН, Москва, 2014 г.); на Российской
научно-практической конференции «Медицинская биохимия: достижения и
перспективы» (ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет Минздрава России, Казань, 2015 г); на 2nd Central European Biomedical Congress «From emerging biochemical strategies to personalized medicine» (Krakow, Poland, 2016); на Международной научно - практической конференции «Глобализация научных процессов» (Киров, 2016 г).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования, дизайн исследования, постановка цели и задач проводились совместно научным руководителем. Выбор экспериментального подхода и моделирование ПТСР производился совместно с д.б.н., профессором В.Э. Цейликманом, д.м.н. О.Б. Цейликман, к.м.н. Д.А. Козочкиным и М.С. Лапшиным. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично автором. Экспериментальные исследования и анализ полученных данных производились совместно с Л.И. Колесниковой, А.С. Поповой, Л.И. Крупицкой, Ю.М. Шатровой, И.Г. Галиуллиной, Н.С. Молчановой, А.К. Юнусовой, И.Б. Телешевой, Э.Ф. Аглетдиновым, Н.В. Нургалеевым, И.А. Зворыгиным, Г.А. Байбуриной.
Обобщение полученных результатов проведены совместно с научным руководителем. Статистическая обработка первичных данных, подготовка и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись соискателем лично.
Положения, выносимые на защиту
-
В динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства в головном мозге и печени крыс выявлены изменения активности МАО-А, МАО-Б, изменение скорости дезаминирования атипичных субстратов МАО - А: глюкозамина и ГАМК.
-
Трансформация каталитических свойств МАО-А в головном мозге и печени при экспериментальном моделировании ПТСР определяется уровнем липопероксидации и сопряжена с металл - катализируемым окислением белков митохондрий.
-
Отсроченные поведенческие расстройства анксиогенного характера при экспериментальном моделировании ПТСР возникают на фоне ограничения катаболизма серотонина, модификации каталитических свойств фермента и развития окислительного стресса в митохондриях.
Научная новизна
Впервые показано, что на третьи сутки экспериментального моделирования ПТСР происходит снижение активности церебральной МАО-Б и устойчивости МАО-А к окислению, что сопровождается усилением липопероксидации в мембранах митохондрий. Показано, что на третьи сутки экспериментального моделирования ПТСР в печени наблюдается повышение атипичной каталитической активности МАО-А с одновременным повышением интенсивности липопероксидации и металл -катализируемого окисления (МКО) белков митохондрий. Впервые показано, что на третьи сутки экспериментального моделирования ПТСР в головном мозге повышается содержание адреналина и ДОФА.
Впервые показано, что на седьмые сутки экспериментального моделирования ПТСР в головном мозге повышается активность МАО-А, нормализуется уровень ее атипичной активности. Впервые показано, что на седьмые сутки экспериментального моделирования ПТСР в печени сохраняется высокий уровень атипичной каталитической активности МАО-А, повышение активности МАО-Б на фоне высокой интенсивности МКО белков. Показано, что на седьмые сутки экспериментального моделирования ПТСР в крови снижается концентрация кортикостерона, что ассоциировано с повышением интенсивности МКО белков митохондрий головного мозга и повышением активности МАО-Б в печени. Впервые показано, что на десятые сутки экспериментального моделирования ПТСР в головном мозге сохраняется высокая активность МАО-А, повышается устойчивость фермента к окислению. Показано, что на десятые сутки формирования экспериментального ПТСР в головном мозге повышается содержание норадреналина, ДОФА, дофамина, снижается концентрация ГАМК.
Впервые показано, что к моменту формирования отсроченных
нейроэтологических признаков тревоги при экспериментальном моделировании ПТСР в
головном мозге снижается до контрольного уровня активность МАО-А и устойчивость
МАО-А к дополнительным окислительным стимулам. В головном мозге и печени
повышается уровень атипичной каталитической активности МАО-А, что
сопровождается усилением МКО белков и ограничением липопероксидации в митохондриальных мембранах.
Теоретическая и практическая значимость работы
Впервые проведена одновременная оценка динамики изменения
липопероксидации и окислительной модификации белков в гомогенатах и суспензиях митохондриальных мембран головного мозга и печени при экспериментальном моделировании ПТСР у крыс, выявлены их взаимосвязи с изменениями активностей МАО исследуемых органов. Продемонстрировано влияние изменений концентрации биогенных аминов-субстратов МАО на состояние свободнорадикального окисления в головном мозге и печени в динамике экспериментального моделирования ПТСР. Продемонстрированы взаимосвязи развития поведенческих расстройств с изменением исследуемых биохимических параметров.
Полученные в работе данные расширяют представления о роли МАО и трансформации каталитической активности фермента в развитии стрессовых расстройств. Продемонстрированы новые взаимосвязи между изменениями обмена нейромедиаторов, состоянием ПОЛ, ОМБ и трансформацией каталитических свойств МАО при экспериментальном моделировании ПТСР. Полученные в работе данные могут стать основой для разработки новых методов лечения и профилактики состояний, сопровождающихся сохранением высокого уровня тревожности на протяжении длительного времени после психологической травмы.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России на кафедрах биологической химии (биохимии) имени Р.И. Лифшица и кафедре фармации и химии фармацевтического факультета; в учебном процессе ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России на кафедре биохимии.
Публикации
Соискатель имеет 18 опубликованных работ, из них по теме диссертации - 10 научных работ общим объмом 1,7 печатных листа, в том числе 5 статей в научных журналах и изданиях, включенных в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. 5 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов; имеется 2 публикации в электронных научных изданиях.
Объем и структура диссертации
Нарушения обмена биогенных аминов и изменения активности МАО при ПТСР
В настоящее время МАО (моноаминоксидазы) являются одними из наиболее изученных ферментов. Известно, что изоформы МАО кодируются различными генами, локализованными на Х-хромосоме, хоть и образованными из одного гена-предшественника. Расшифрована нуклеотидная последовательность генов фермента и аминокислотная последовательность пептидной цепи [210]. Известна пространственная структура ферментов. Исследовано функционирование ферментов при самых различных патологических состояниях, в большинстве тканей и органов, включая не только различные органы человека, крыс и мышей, но и других животных. Тем не менее, интерес к МАО не ослабевает: с развитием фармакологии, психиатрии и наркологии, неврологии, и многих других медицинских дисциплин открываются вс новые особенности участия МАО в патогенезе различных заболеваний.
Во многом это обусловлено важными функциями, которые выполняют МАО. Основная функция МАО – поддержание физиологических концентраций эндогенных моноаминов в тканях. Наибольшую активность МАО проявляют в печени, желудке и кишечнике, почках, а также в нервной системе.
В нервной системе МАО являются ключевым ферментов метаболизма моноаминов - нейротрансмиттеров, и во многом обеспечивают нейрохимический контроль поведения. В желудочно-кишечном тракте МАО ограничивают избыточное поступление моноаминов с пищей [13]. В печени и почках МАО активно участвуют в окислительном метаболизме эндо- и экзогенных моноаминов, что дает основания относить их к ферментам первой фазы биотрансформации ксенобиотиков [66]. При этом, в последние десятилетия внимание большинства исследователей МАО сосредоточенно их участии в обмене нейромедиаторов и, следовательно, в патогенезе многих неврологических и психиатрических заболеваний [195].
Одним из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний такого рода является посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР), тяжлое психическое состояние, которое сопровождается сохранением высокого уровня тревожности на протяжении длительного времени после психологической травмы. Посттравматические стрессовые расстройства является серьзной проблемой, состоянием, которое не только постепенно и необратимо разрушает жизнь отдельного человека, но и является, неблагоприятным социальным явлением. Так, хорошо известно, что из приблизительно 2,6 млн американских солдат и офицеров, принимавших участие во вьетнамской войне, со стороны США погибло около 50 000 солдат и около 300 000 получили ранения [45]. В результате развития у ветеранов ПТСР, после возвращения с войны, закончили жизнь самоубийством 55 000 [45], пытались закончить жизнь самоубийством 500 000 человек. Считается, что среди ветеранов афганской войны – 30%, среди участников ликвидации аварии в Чернобыле – 15 % страдают ПТСР [23]. По разным данным, учитывая отдаленные последствия боевого стресса, от 15 до 77,8% людей, участвовавших в локальных войнах последних десятилетий, впоследствии страдают ПТСР [44].
Постстрессовые расстройства возникают не только в условиях военного времени. Существует мнение, что «важным признаком современного общества, является обостренное ощущение неуверенности человека в его положении, в правах и доступности средств существования, все большей физической незащищенности» [48]. Показано, что частота жизнеугрожающих событий, имеющих место хотя бы один раз за жизнь для мужчин составляет около 61%, а среди женщин - около 51% [90].
К настоящему моменту является бесспорным факт наличия при ПТСР нарушений функционирования гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАС). Причем, в подавляющем большинстве случаев сообщается о стойкой гипокортизолемии у данной категории лиц [207]. Эти расстройства сопровождаются изменениями обмена и биогенных аминов и активности церебральных МАО, а также чрезвычайно высокой частотой сопутствующих заболеваний, среди которых весьма распространена патология печени [148, 207].
Учитывая особенности функционирования МАО, можно предположить, что изменения их каталитической активности в печени при ПТСР могут привести к развитию окислительного стресса в печени, а также существенным изменениям биотрансформации некоторых ксенобиотиков - моноаминов, метаболизируемых при участии МАО. К ним относят лекарственные препараты – производные фенилэтиламина (ибопамин, докарпамин); некоторые агонисты и антагонисты -адренорецепторов (фенилэфрин, пропранолол, метопролол, и др.); агонисты серотониновых рецепторов (суматриптан, золмитриптан и др.). При активном участии моноаминоксидаз метаболизируются и некоторые ингибиторы МАО (алмоксатон, лазабемид) [66], которые в настоящее время широко применяются в терапии ПТСР.
Несмотря на достаточно большое количество исследований, посвященных участию моноаминоксидаз в развитии стрессовых расстройств, конкретные патохимические механизмы его формирования, связанные с трансформацией каталитических свойств фермента остаются неизвестными. Поскольку клиника ПТСР проявляется спустя латентный период после воздействия стрессора [48], а его развитие характеризуется известной стадийностью [40], представляется важным исследование обозначенных параметров не только в период сформировавшихся расстройств, но и в динамике их формирования, начиная с момента воздействия стрессора.
Изучение поведенческих реакций животных
Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) моделировали путм помещения крыс в клетку с опилками, пропитанными мочой кошки [90, 56]. Количество опилок, объм кошачьей мочи, площадь клеток и количество крыс клетке были стандартизированы. Контрольную группу составили интактные животные, не подвергавшиеся воздействию кошачьей мочи, содержащиеся отдельно, в клетках с чистыми опилками (n=16).
Для оценки формирования поведенческих и биохимических изменений в динамике развития ПТСР, было сформировано четыре опытных группы (32 животных). Продолжительность воздействия для всех опытных групп составляла 10 суток. Затем следовал период покоя, в течение которого крысы не подвергались каким-либо воздействиям.
Крысы, составившие опытные группы, выводились из эксперимента на 3 сутки (первая группа, n=8), 7 сутки (вторая группа, n=8), 10 сутки (третья группа, n=8) и 14 сутки (четвертая группа, n=8), после завершения воздействий, исследовалась в актографе «открытое поле» и актографе «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), после чего умерщвлялись под эфирным наркозом для регистрации изменений биохимических параметров. Параллельно с крысами опытных групп проводилось исследование поведения и биохимических параметров крыс каждой из контрольных групп. В течение всего времени исследования воспроизводился суточный цикл смены дня и ночи, был обеспечен свободный доступ к воде и корму. За 24 часа до умерщвления животные лишались корма при сохранении свободного доступа к воде.
Данная модель ПТСР основывается на естественном и потенциально смертельном характере стрессора, при этом в течение некоторого времени реакция «борьбы или бегства» не эффективна, поскольку крысы не могут покинуть клетку [74, 55]. Кратковременность воздействия так же имитирует естественный характер стрессора [73, 89].
Редкочередующиеся иммобилизации (РЧИМ). Режим иммобилизационного стресса воспроизводился четырехкратными одночасовыми иммобилизациями с интервалом в 72 часа между отдельными стрессорными эпизодами. Для данного режима характерно доминирование резистентной стратегии адаптации [9, 10, 11], наличие поведенческих расстройств тревожно - депрессивного характера, снижение чувствительности к глюкокортикоидам и высокая активность церебральной МАО [52]. Данный режим воздействий использован как модель анксиогенного стресса со сниженной чувствительностью к ГКГ для изучения ГКГ – зависимых изменений активности МАО.
Для оценки ГКГ – зависимых изменений активности МАО применялся глюкокортикоидный антагонист RU38486 (Mifepristone, Sigma). В отдельной серии экспериментов было сформировано три группы животных: контрольная группа (n=9); редкочередующиеся (одночасовые, с интервалом 72 часа) четырехкратные иммобилизации (РЧИМ, n=9); четырехкратные иммобилизации + RU38486 (n=9). Животные получали антагонист в дозе 10 мг/кг интрагастрально перед каждым эпизодом иммобилизационного стресса [205]. Режим введения выбран исходя из особенностей фармакокинетики RU38486 [193]. Животные первой и второй групп параллельно получали эквиобъемное количество NaCl 0,9%. Через 24 часа после завершения четвертого эпизода воздействий животные подвергались нейроэтологическому тестированию («открытое поле»), и умерщвлялись под эфирным наркозом для регистрации изменений биохимических параметров. 2.2 Биохимические методы исследования 2.2.1 Определение активности МАО Активность МАО определяли в суспензиях мембран митохондрий, выделенных из образцов ткани головного мозга и печени. Для выполнения поставленных задач требовалось определение каталитических свойств мембранно-связанных молекул МАО. Предварительную солюбилизацию и очистку фермента не производили, поскольку при очистке молекул МАО неизбежно происходит изменение свойств фермента [13]. Определение активности МАО выполняли в несколько этапов: выделение митохондрий и получение суспензий митохондриальных мембран; инкубация суспензий мембран с субстратами; определение скорости ферментативной реакции по образованию копродуктов (аммиак, бензальдегид).
Выделение мембран митохондрий [34] позволяет сконцентрировать мембраны митохондрий и находящиеся на них молекулы фермента в небольшом объме.
Принцип метода: состоит в центрифугировании гомогената на среде выделения, что позволяет отделить митохондрии от остальной части гомогената. При этом обязательным условием выполнения метода является постоянное поддержание биоматериала на холоде (2-4С). Реактивы и оборудование: 1) натрий-фосфатный буфер 0,02М, рН=7,4, холодный; 2) физиологический раствор, холодный; 3) среда выделения (холодная) содержит: -натрий-фосфатный буфер 0,02М, рН=7,4 -ЭДТА(0,005М) -сахарозу (0,025М) 4) центрифуга рефрижераторная; 5) гомогенизатор Поттера. Ход определения. Головной мозг или печень измельчали ножницами, предварительно отмыв в охлажденном физиологическом растворе. Далее в биоматериал добавляли среду выделения для получения 10% гомогената. Гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера. Полученный раствор центрифугировали при 800g и 3С в течение 10 минут. Затем полученный надосадок повторно центрифугировали при 12000g 3С в течение 20 минут [145]. Полученный осадок, содержащий митохондрии, гомогенизировали и ресуспендировали в натрий-фосфатном буфере 0,02М, рН=7,4 в том же объме, что и среда выделения. Повторно центрифугировали при 12000g, 3С в течение 20 минут. В полученный осадок добавляли натрий-фосфатный буфер 0,02М, рН=7,4 в соотношении 1 мг исходной ткани к 1,93 мл буфера. Полученные суспензии мембран митохондрий содержат около 0,3 мг белка [34].
Субстраты. Хотя считается, что существует перекрытие субстратной специфичности для МАО-А и МАО-Б, в частности, серотонин, как и дофамин, норадреналин, адреналин могут дезаминироваться обеими изоформами МАО, однако на практике приходится учитывать то обстоятельство, что значения константы Михаэлиса МАО-А и МАО-Б имеет существенные отличия для одного и того же субстрата, отсюда и скорость дезаминирования будет значительно отличаться (таблица 2.1).
Что касается определения активности МАО in viro, то относительно низкие концентрации серотонина будут окисляться почти исключительно МАО-А, в то время как при высоких концентрациях серотонина вклад МАО-Б будет доходить до 10% от общей активности [192]. Исходя из протоколов Типтона (2006), бензиламин и серотонин относятся к селективным субстратам МАО-Б и МАО-А соответственно в случае головного мозга крысы [192].
Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в мембранах митохондрий головного мозга в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства
На третьи сутки после завершения воздействия наблюдается усиление процессов липопероксидации, что проявилось повышением концентрации вторичных гептан-растворимых, первичных и вторичных изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ (таблица 3.6). При этом обнаружено снижение антиоксидантной защиты липидов и истощение пула ненасыщенных двойных связей: выявлено снижение концентрации первичных изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ, полученных при индукции Fe2+ / аскорбат. При этом снижение концентрации гептан-растворимых первичных продуктов липопероксидации может быть обусловлено их переходом во вторичные гептан-растворимые продукты, ввиду относительного дефицита антиоксидантной защиты липидов.
Параллельно, на третьи сутки после завершения воздействий, происходит значительное усиление ОМБ (таблица 3.7). При свободнорадикальном окислении белков образуются соединения [151], которые, как и вторичные продукты липопероксидации, содержат карбонильные и альдегидные группы. Таким образом, на третьи сутки определяется развитие карбонильного стресса в печени. В настоящее время карбонильный стресс считается наиболее тяжелым проявлением оксидативного стресса, приводящим к инициации воспаления, аутоиммунных повреждений, гибели клетки (апоптоз или некроз). Продукты карбонильного стресса способны модифицировать аминокислотные остатки белков и азотистые основания нуклеиновых кислот, меняя свойства этих важнейших биомолекул [92].
На седьмые сутки после завершения воздействий наблюдается ограничение как процессов липопероксидации, так и ОМБ: концентрации продуктов ПОЛ и ОМБ снизились до контрольных значений (таблица 3.6). Таблица 3.6 - Изменения содержания продуктов липопероксидации в гомогенатах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства (M±m)
Показатель Контроль (n=16) 3 суток послезавершениявоздействия(n=8) 7 суток послезавершениявоздействия(n=8) 10 суток послезавершениявоздействия(n=8) 14 суток послезавершениявоздействия(n=8) Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 0,979±0,008 0,839±0,033 0,974±0,006 0,971±0,006 1,015±0,005 Кетодиены и сопряжнные триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,211±0,018 0,361±0,044 0,214±0,020 0,243±0,037 0,207±0,022 Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,020±0,002 0,011±0,001 0,020±0,001 0,025±0,002 0,028±0,002 Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,386±0,027 0,476±0,009 0,373±0,018 0,305±0,156 0,257±0,013 Кетодиены и сопряжнные триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,176±0,012 0,233±0,008 0,165±0,012 0,153±0,019 0,160±0,007 Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,029±0,027 0±0 0,052±0 0,001±0 0±0 Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), индукция Fe2+/аскорбат, %, 2,822±0,220 2,031±0,049 2,768±0,136 3,197±0,246 4,135±0,245 Кетодиены и сопряжнные триены (изопропанольная фаза), индукция Fe2+/аскорбат, % 4,293±0,174 4,269±0,265 5,579±0,295 4,656±0,111 5,575±0,374 - статистически значимые отличия от контрольной группы; p 0,05U Таблица 3.7 - Изменения содержания продуктов карбонилирования белков в гомогенатах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства (M±m) Показатель Контроль (n=16) 3 суток послезавершениявоздействия(n=8) 7 суток послезавершениявоздействия(n=8) 10 суток послезавершениявоздействия(n=8) 14 суток послезавершениявоздействия(n=8) Альдегиддинитрофенилгидразоны , мкмоль/мг белка 0,008±0,001 0,025±0,006 0,010±0,003 0,007±0,001 0,040±0,030 Нейтральныекетодинитрофенилгидразоны, мкмоль/мг белка 0,008±0,001 0,023±0,006 0,011±0,002 0,007±0,000 0,005±0,001 Основныекетодинитрофенилгидразоны, мкмоль/мг белка 0,003±0,000 0,007±0,001 0,003±0,001 0,002±0,000 0,002±0,000 Альдегиддинитрофенилгидразоны (индукция Fe2+/H2O2), мкмоль / мг белка 0,057±0,002 0,055±0,005 0,058±0,005 0,048±0,002 0,057±0,004 Нейтральныекетодинитрофенилгидразоны, (индукция Fe2+/H2O2), мкмоль/мг белка 0,031±0,001 0,027±0,002 0,031±0,003 0,027±0,001 0,033±0,001 Основныекетодинитрофенилгидразоны, (индукция Fe2+/H2O2), мкмоль/мг белка 0,012±0,000 0,012±0,001 0,013±0,001 0,011±0,001 0,013±0,001 - статистически значимые отличия от контрольной группы; p 0,05U При этом также наблюдается усиление липофильной антиоксидантной защиты, т.к. повышается уровень изопропанол-растворимых вторичных продуктов ПОЛ, полученных при индукции Fe2+ / аскорбат.
На десятые сутки имеет место снижение концентрации продуктов металл-катализируемой ОМБ (таблица 3.7). Это говорит о повышении устойчивости белков к окислительным стимулам. Так же происходит снижение до контрольного значения уровня вторичных изопропанол-растворимых продуктов, полученных при индукции, и повышенных на седьмые сутки, что в свою очередь говорит о восстановлении на десятые сутки до контрольного уровня степени липофильной антиоксидантной защиты. Поскольку одновременно наблюдается снижение концентрации первичных изопропанол-растворимых продуктов, т.е. снижение интенсивности диеновой конъюгации [54], можно предположить снижение содержания ненасыщенных двойных связей в жирнокислотных остатках фосфолипидов.
На четырнадцатые сутки после завершения воздействий выявлены разнонаправленное изменение содержания продуктов свободнорадикального окисления: повышение уровня первичных и конечных гептан-растворимых продуктов ПОЛ при снижении концентрации первичных изопропанол-растворимых продуктов липопероксидации (таблица 3.6). Параллельно имеет место повышение уровня липофильной антиоксидантной защиты, поскольку происходит повышение концентрации первичных и вторичных изопропанол-растворимых продуктов ПОЛ, полученных при индукции (Fe2+ / аскорбат) (таблица 3.6). Существенных изменений уровня ОМБ на четырнадцатые сутки после окончания воздействий не выявлено.
Таким образом, усиление процессов ОМБ наблюдается на третьи сутки, на седьмых происходит восстановление прежнего уровня карбонилирования белков, на десятых – усиление антиоксидантной защиты белков, на четырнадцатых – восстановление прежнего уровня устойчивости белков к окислительному воздействию. В динамике липопероксидации отмечены аналогичные изменения.Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в митохондриальных мембранах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства
Изменение интенсивности липопероксидации и окислительной модификации белков в митохондриальных мембранах печени в динамике экспериментального моделирования посттравматического стрессового расстройства
Известно, что кортикостерон может изменять уровень липопероксидации за счт регуляции уровня субстрата – ненасыщенных двойных связей жирнокислотных остатков липидов для свободно-радикальной атаки, в частности, кортикостерон ингибирует фосфолипазу А2, регулирует активность десатуразы жирных кислот и компонентов пальмитоил-синтазного комплекса [42]. Обнаружен ряд корреляционных связей между содержанием кортикостерона и уровнем продуктов свободнорадикального окисления митохондриальных мембран головного мозга и печени. В митохондриальных мембранах головного мозга на седьмые сутки обнаруженные обратные корреляционные связи с уровнем МКО нейтральных КДФГ (Rs=-0,82; P=0,02), основных КДФГ (Rs=-0,82; P=0,02). Данные корреляционные связи демонстрируют, что снижающийся уровень кортикостерона способствует усилению интенсивности МКО белков и препятствует образованию карбонильных производных на седьмые сутки наблюдения. На десятые сутки наблюдения обнаружена обратная корреляционная связь с содержанием первичных изопропанол-растворимых продуктов липопероксидации митохондриальных мембран головного мозга (индукция Fe2+/аскорбат) (Rs=-0,76; P=0,03), которые отражают уровень полиненасыщенных жирных кислот липидов. Очевидно, кортикостерон способствует повышению содержания полиненасыщенных жирных кислот митохондриальных мембран головного мозга. Вероятно, данный механизм реализуется за счт снятия ингибиторного контроля снижающегося уровня кортикостерона на активность фосфолипазы А2. Как было показано ранее, МКО белков оказывает антиоксидантное влияние на липопероксидацию суспензий митохондриальных мембран головного мозга.
На четырнадцатые сутки наблюдения обнаружена обратная корреляционная связь с содержанием гептан-растворимых оснований Шиффа (Rs=-0,85; P=0,03). Ранее было показано, что уровень гептан-растворимых оснований Шиффа отражает усиление МКО белков и, вероятно, повышение скорости образования аддуктов белков и липидов. На десятые сутки наблюдения обнаружена обратная корреляционная связь с содержанием изопропанол-растворимых первичных продуктов ПОЛ митохондриальных мембран печени (Rs=-0,9; P=0,04). Как показано ранее, уровень изопропанол-растворимых продуктов способствует усилению МКО белков.
Следовательно, снижающийся в ходе всего периода наблюдения уровень кортикостерона, опосредованно через содержание продуктов ПОЛ, может способствовать усилению МКО белков митохондрий печени. Кроме того, концентрация кортикостерона обратно коррелирует с содержанием нейтральных КДФГ (Rs=-0,71; P=0,05), основных КДФГ (Rs=-0,76; P=0,03). В то же время, уровень карбонилирования белков имеет прямую корреляционную связь с интенсивностью МКО белков (Rs=0,95; P=0,0003) митохондриальных мембран печени, что соотносится с предположением об образовании аддуктов белков и липидов, поскольку данный процесс неизменно сопровождается образованием карбонильных производных белков [81].
На четырнадцатые сутки наблюдения уровень кортикостерона коррелирует с содержанием гептан-растворимых оснований Шиффа (Rs=0,73; P=0,04) митохондриальных мембран печени. Ранее было показано, что уровень гептан-растворимых оснований Шиффа отражает усиление МКО белков и, вероятно, повышение скорости образования аддуктов белков и липидов.
Влияние кортикостерона на активность моноаминооксидаз головного мозга и печени Известно, что кортикостерон активируют процессы транскрипции ноывх молекул и-РНК [11,163]. Сниженный уровень кортикостерона на седьмые сутки, вероятно, является фактором снижения уровня активности МАО-Б в печени на седьмые сутки наблюдения. Это подтверждается корреляционной связью между скоростью дезаминирования бензиламина и уровнем кортикостерона крови (Rs=0,96; Р=0,001) .
Одной из причин повышенной активности МАО-А головного мозга на седьмые сутки может быть снятие ограничительного контроля кортикостерона, поскольку его концентрация в крови крыс на седьмые сутки после прекращения стрессовых воздействий снижается, а, как известно, повышение концентрации кортикостерона приводит к снижению активности существующих молекул МАО [11, 163]. Однако корреляционный анализ не показал наличия статистически значимых связей между скоростью дезаминирования серотонина головного мозга и концентрацией кортикостерона в крови.
Обнаружены корреляционные связи между содержанием кортикостерона крови крыс и скоростью дезаминирования глюкозамина, (индукция Fe2+/аскорбат) в головном мозге на десятые сутки (Rs=-0,74; P=0,04), а так же уровнем активности МАО-А, (индукция Fe2+/аскорбат) (Rs=0,83; P=0,04) на момент развития ПТСР. Поскольку эти данные отражают способность усиления атипичной каталитической активности МАО-А при добавлении индуктора СРО и, наоборот, устойчивость МАО-А к дополнительным окислительным стимулам, то данные корреляции демонстрируют, что снижающийся уровень кортикостерона способствует трансформации каталитических свойств МАО-А на десятые и четырнадцатые сутки после воздействия в головном мозге крыс.
Таким образом, уровень кортикостерона имеет множество корреляционных связей как с уровнями продуктов липопероксидации, так и ОМБ. Снижаясь, уровень кортикостерона способствует прооксидантному влиянию продуктов ПОЛ на интенсивность карбонилирования белков и способствует усилению МКО белков на седьмые, десятые и четырнадцатые сутки в митохондриальных мембранах головного мозга и печени. Вероятно, такое влияние обусловлено активацией фосфолипазы А2, в результате активности которой происходит отщепление переокисленных жирнокислотных остатков, которые, вероятно, участвуют в образовании аддуктов белков и липидов, параллельно снижая уровень липопероксидации за счт ограничения количества субстрата.
Таким образом, обнаружено влияние снижающегося уровня кортикостерона крови на усиление трансформации каталитических свойств МАО-А на десятые и четырнадцатые сутки после воздействия в головном мозге крыс.