Введение к работе
Актуальность работы. NADH:y6HXinioH оксидоредуктаза (Комплекс I, NADH-дегидрогеназа, КФ 1.6.5.3) - чрезвычайно сложно устроенный компонент дыхательной цепи митохондрий. Фермент катализирует перенос электронов от NADH на убихинон, сопряженный с векторным транспортом 4 протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. Фермент построен не менее чем из 41 субъединиц (общая молекулярная масса - порядка 1 000 000 Да) и содержит FMN, железосерные кластеры и связанный убихинон.
Структура нуклеотид-связывающего активного центра(ов) Комплекса I и параметры связывания ігуклеотидов-субстратов - не изучены. Долгое время считалось, что в составе фермента имеется единственный центр для связывания NADH (NADPH) и NAD+ (NADP+) на 51 кДа субъединице гидрофильной части фермента [Walker, 1992]. Однако ряд данных указывает на существование не менее двух центров связывания нуклеотидов в составе NADH:y6irxHHOH оксидоредуктазы. Среди них: (1) различное восстановление железосерных центров при окислении NADH и NADPH [Albracht et al, 1997], (2) существенно различное сродство к одному и тому же нуклеотиду в реакциях прямого и обратного переносов электронов, различное действие ингибитора (ADP-рибоза) на обе реакции [Vinogradov et al, 1993, 1998], и ряд других.
В данной работе в качестве инструмента исследования свойств активного центра(ов) Комплекса I использована NADH—>APAD+ (DD) трансгидрогеназная реакция, катализируемая ферментом. Кинетическое исследование этой бисубстратной реакции может служить, хотя и косвенным, но достаточно надежным подходом для установления количества нуклеотид-связывающих центров фермента. Актуальность такой работы определяется необходимостью изучения функционирования и регуляции энергопреобразующих систем аэробной клетки.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ: APAD(H) - 3-ацетилпиридин аденин
динуклеотид, аналог NAD(H); DD - перенос гидрид иона от NADH (или
его аналогов) на NAD+ (или его аналоги), DPNH-^DP^T обмен; СМЧ -
субмитохондриальные частицы; FP — флавопротеин,
трехсубъединичный фрагмент митохондриального Комплекса I, получаемый при обработке изолированного фермента хаотропными агентами.
Цель работы состояла: (1) в изучении кинетического механизма NADH-»APAD+ трансгидрогеназной реакции, катализируемой Комплексом I, с целью установления количества субстрат-связывающих мест,, и исследовании упорядоченности взаимодействия субстратов с ферментом в ходе реакции; (2) в изучении влияния ингибиторов, действие которых направлено на нуклеотид-связывающие центры, по отношению к обоим субстратам.
Научная новизна работы. Показано, что Комплекс I катализирует две NADH—>APAD+ трансгидрогеназные реакции, различающиеся по скорости и по сродству к нуклеотидам. Реакция 1 протекает по упорядоченному механизму с образованием тройного комплекса, т.е. с участием двух центров связывания нуклеотидов (NADH - первый субстрат). Трехсубъединичный фрагмент Комплекса I (FP), являющийся наименьшей каталитически активной единицей фермента, катализирует реакцию 1, что свидетельствует о присутствии в его составе двух субстрат связывающих центров. Реакция 2 протекает по механизму двойного замещения ("пинг-понг") с участием нуклеотид-связывающего центра(ов), отличного от центров, участвующих в реакции 1. Энергизация мембран ингибирует реакцию 1. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о существовании не менее трех нуклеотид-связывающих центров, функционирующих в составе митохондриального Комплекса I.
Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные представления о функционировании ферментов дыхательной цепи. Материалы диссертационной работы используются при проведении большого практикума по разделу "Биоэнергетика". Выявленное в работе действие мембранного потенциала на трансгидрогеназную реакцию Комплекса I открывает перспективы исследования участия гидрофильной части фермента в транслокации протонов. Подходы, использованные для исследования кинетики трансгидрогеназной реакции, могут быть применены в случае других реакций Комплекса I, характеризующихся сложной кинетикой.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и на Международной Конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (2000, Пущино, Россия).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения
результатов работы, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа
изложена на стр. машинописного текста, включает табл. и
рис.
Препараты СМЧ [Kotlyar, Vinogradov, 1990], Комплекса I и FP [Galante Y., Hatefi, 1978] получали стандартными методами. Измерение NADH-оксидазной реакции и обратного переноса электронов, сопряжение СМЧ олигомицином, активацию сукцинат-дегидрогеназы [Kotlyar, Vinogradov, 1990], обработку СМЧ трипсином [Ragan, 1976], получение APADH [Minakami et al, 1963] и измерение концентрации APAD+ и NAD+ [Siegel, Montgomery, 1959] проводили согласно опубликованным методикам.
Трансгидрогеназную активность измеряли при 26 С. Реакцию регистрировали по изменению поглощения при 375 им (Ем15 ~ 5.1) сопровождающему одновременное окисление NADH и восстановление APAD+ [Stein, 1959]. Среда для измерения активности СМЧ содержала 0.25 М сахарозу, 20 мМ трис НС1,0.2 мМ ЭДТА (рН 8.0) и 4 мкМ ротенон. При измерении активности Комплекса I, среда содержала 20 мМ трис'НСІ, 0.2 мМ ЭДТА (рН 8.0), 0.5 мг/мл БСА, 0.15 мг/мл азолектина (смесь фосфолипидов из соевых бобов) и 4 мкМ рогенон. Перед использованием, Комплекс 1 (0.5 мг/мл) преинкубировали в среде измерения без ротенона, в присутствии азолектина (1 мг/мл), в течение часа, при комнатной температуре. Для измерения активности FP использовали среду, содержащую 20 мМ Hepes, 0.2 мМ ЭДТА (рН 8.0). При измерении активностей в пробы вносили: СМЧ - 10-30 мкг/мл, Комплекс 1-1-3 мкг/мл, FP — 0.5 мкг/мл. Препараты Комплекса I и FP во время опыта хранили на льду.
Для генерации ДДц+ использовали АТР-азную и сукцинат-оксидазную реакции. В первом случае, в реакционную среду (не содержащую ротенон) добавляли 3 мМ АТР, 3 мМ MgCb, 1-5 мМ фосфоенолпируват и 2.5 ед./мл пируваткиназы (свободной от лактат-дегидрогеназы). В пробы вносили сопряженные олигомицином (0.15 мкг/мг белка) СМЧ, миксотиазол (10 мкг/мг белка) и субстраты. Во втором случае, в реакционную среду (содержащую ротенон) добавляли 1 мг/мл БСА и 10 мМ сукцинат. В пробы вносили СМЧ (сопряженные олигомицином) и субстраты.
Для регистрации Арн+ при протекании NADH->APAD+ реакции, в присутствии оксанола VI, использовали среду, содержащую 0.25 М сахарозу, 20 мМ трисНСІ (рН 8.0) и 0.2 мМ ЭДТА. Увеличение поглощения оксанола регистрировали в двуволновом режиме, Абгз-воз- Для этого в 1 мл реакционной среды вносили 1.2 мг сопряженных СМЧ (60 мкл суспензии 20 мг/мл), миксотиазол (10 мкг/мг белка) и 1.5 мкМ оксанол. При внесении NADH (15 мкМ), регистрировали кратковременное увеличение поглощения (А62з-боз)- После выхода поглощения на
стационарный уровень (около 1.5 мин), реакцию начинали добавкой 2-20 мкМ APAD+ или NAD+.