"Векторные визуализирующие системы для МРТ диагностики патологических процессов нервной системы" Абакумова Татьяна Олеговна

Введение к работе

Актуальность исследования

В настоящее время особую сложность в плане диагностики с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) представляют заболевания центральной нервной системы (Giesel et al. 2010). Для улучшения визуализации патологических очагов используются контрастные агенты - вещества, влияющие на скорость релаксации протонов воды в окружающих тканях и, тем самым, увеличивающих контраст между тканями на изображении. Одними из наиболее хорошо изученных и эффективных контрастных агентов для МРТ диагностики являются препараты на основе хелатных комплексов гадолиния (III) (Burtea et al. 2008). Образование хелатных комплексов позволяет многократно снизить токсичность Gd³⁺ и использовать такие комплексы в качестве контрастного агента. Начиная с 1980-х годов применение хелатов Gd³⁺ привело к значительному улучшению диагностики заболеваний ЦНС. Введение препаратов пациентам с онкологическими заболеваниями позволило выявить метастазирование опухоли в головной мозг, незамеченное другими методами исследования (Claussen et al. 1985). Также с помощью контраст-усиленной МРТ была впервые показана множественность поражения головного мозга у пациентов с рассеянным склерозом (Rocca

et al. 2013). Однако, несмотря на достигнутые результаты, высокие дозы вводимых
препаратов и неспецифическое их распределение в организме оставляет открытым вопрос
разработки более эффективных контрастных агентов. На сегодняшний день существуют
различные подходы к улучшению свойств контрастирующих веществ: от конъюгации
хелатов гадолиния с макромолекулами и наночастицами до использования
мультифункциональных систем для комбинированной визуализации различными
методами (ПЭТ/МРТ (Kjaer et al. 2013), МРТ/флюоресцентная визуализация (Huang et al.
2013) и др.). Повышение чувствительности метода и улучшение физико-химических
свойств препаратов позволяет снизить вводимые дозы (Mitsumori et al. 2014), однако,
остается актуальной проблема направленной доставки контрастных агентов и
селективности визуализации патологического очага. Неспецифическое распределение в
организме применяемых в клинике препаратов приводит к низкому уровню накопления и
недостаточной концентрации контрастных агентов в зоне патологического очага.
Создание систем направленной визуализации поражений ЦНС, способных селективно
связываться с нейроспецифичными антигенами клеток-мишеней, позволит увеличить
диагностическую и прогностическую ценность магнитно-резонансной томографии (Singh
& Lillard 2009). Векторизация контрастных агентов может быть выполнена за счет
конъюгации с низкомолекулярными лигандами (фолиевая кислота, RGD пептид,
аптамеры) или более крупными молекулами (например, моноклональные антитела). В
качестве перспективных мишеней для диагностики патологических процессов ЦНС
особый интерес представляют белки, экспрессия которых повышена при повреждении
нервной ткани в ходе развития заболевания. Так, диагностика опухолевых заболеваний
головного мозга может быть значительно улучшена за счет селективного связывания
контрастного агента с коннексином 43 (Сх43) – основным белком коннексонов,
структурной единицы щелевых контактов, высокоэкспрессированного на периферии
глиомы. В качестве белка-мишени для диагностики поражений ЦНС, в том числе
нейродегенеративных изменений ткани, большой интерес представляет

глиофибриллярный кислый белок (GFAP). GFAP был впервые выделен у пациента с рассеянным склерозом в 1959 году и является белком промежуточных филаментов в цитоскелете дифференцированных астроцитов, основным маркером реактивного астроглиоза. Высокая селективность моноклональных антител к GFAP позволяет рассматривать их в качестве перспективного вектора для конъюгации с контрастными агентами для специфичной визуализации патологических очагов ЦНС (демиелинизации, воспаления и др.). Таким образом, для улучшения диагностики опухолевых и демиелинизирующих заболеваний головного мозга необходимо создание контрастных

агентов, способных селективно связываться с белками-мишенями,

высокоэкспрессированными при заболеваниях ЦНС, и обладающих улучшенными физико-химическими свойствами по сравнению с существующими аналогами. Данный подход позволит улучшить не только первичную диагностику социально значимых заболеваний ЦНС, но и оценить их течение и эффективность терапии (Poloni et al 2011, Zhou & Lu 2012).

Цель работы:

Изучение перспектив применения конъюгатов на основе моноклональных антител
(mAb anti-GFAP и mAb anti-Cx43) и хелатных комплексов гадолиния для МРТ

диагностики экспериментальных опухолей и демиелинизирующих заболеваний ЦНС.

Задачи:

1. Охарактеризовать и валидировать модели рассеянного склероза на мышах линии С67BL/6 и мультиформной глиобластомы на крысах линии Wistar.

2. Разработать метод синтеза высокоселективных контрастных препаратов на основе моноклональных антител (mAb anti-GFAP и mAb anti-Cx43) и хелатных комплексов гадолиния.

3. Охарактеризовать полученный векторный контрастирующий препарат по следующим параметрам: 1) иммунохимическая активность конъюгата антител с гадолинием; 2) релаксивность; 3) количество гадолиния на молекулу контрастного агента; 4) цитотоксичность; 5) стабильность.

4. Оценить специфичность и эффективность связывания с антигеном антител, конъюгированных с контрастным агентом, на культуре опухолевых клеток глиомы и астроцитов человека in vitro.

5. Оценить селективность накопления синтезированных векторных контрастных препаратов в опухолевой ткани крыс с экспериментальной ортотопической С6 глиомой при системном введении.

6. Оценить эффективность визуализации патологических очагов с помощью полученных контрастных препаратов на мышах с купризон-индуцированной демиелинизацией.

Научная новизна:

Продемонстрировано, что конъюгация моноклональных моноклональных антител ;анти-GFAP и анти-Cx-43) с контрастным агентом на основе модифицированных полилизином хелатных комплексов гадолиния позволяет получить векторный контрастирующий препарат, селективно накапливающийся в экспериментальной глиоме С6 и очагах демиелинизации, а также достоверно улучшающих их МРТ визуализацию.

Практическая значимость:

Разработанный метод синтеза высокоселективных контрастирующих конъюгатов на основе моноклональных анти-GFAP, анти-Cx-43 антител и хелатных комплексов гадолиния позволяет получать эффективные визуализирующие препараты для МРТ диагностики опухолей и демиелинизирующих заболеваний ЦНС.

Апробация, внедрение, публикации:

Апробация работы. Основные положения работы представлены и обсуждены на 25
российских и международных конференциях, в том числе: на VI-IX Международных
Пироговских научных медицинских конференциях студентов и молодых ученых (Москва,
2011-2014), на 2-ой Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых
системах. Безопасность и наномедицина» (Москва, 2011), на международном конгрессе
«Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2012), ХIХ-XXI
международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных
«Ломоносов» (Москва, 2012-2014), VII-VIII Всероссийских конференциях с

международным участием молодых ученых по химии «Менделеев» (Санкт-Петербург, 2013 г. и 2014 г.), 10-ом Международном симпозиуме «Полимерные терапевтические препараты: из лаборатории в клиническую практику» (Валенсия, Испания, 2014), на 12-ой международной конференции «Наноструктурированные материалы NANO 2014» (Москва, 2014) и 6-ой конференции «Наноматериалы: исследование и применение» (Брно, Чехия, 2014), научной конференции имени Гордона «Наноматериалы в онкологии»(Вест Довер, Вермонт, США, 2015).

Апробация работы была проведена на заседании Проблемного совета отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ФМИЦПН имени В.П. Сербского» Минздрава РФ.

Внедрение:

Результаты исследования внедрены в лекционные курсы МГУ им.М.В.Ломоносова и научную-практическую работу НИТУ «МИСиС».

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 работ, из них 5 статей в ведущих российских рецензируемых журналах, 2 статьи в зарубежном журнале, 19 тезисов в материалах российских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура диссертации: