Введение к работе
Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплен обширный материал по влиянию рибонуклеазы Bacillus intermedius на процессы жизнедеятельности клеток про- и эукариот. Показано, что рибонуклеаза B.intermedius способна вызывать различные биологические эффекты, как на уровне клетки, так и на уровне организма. Она обладает противовирусный, противоопухолевым и иммуностимулирующим действием - стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет, нсспецифичсскне факторы резистентности. Рибонуклеазы вызывают стимуляцию гемопоэза и стимуляцию пролиферация некоторых клеток высших эукариот [Курниенко, 1991). В зависимости от концентрации РНКазы могут стимулировать или иягибнровать размножение клеток микроорганизмов (Солдатова, Беляева, 1972; Добротина и др., 1992; Колпаков и др„ 1989]. Использование фотоокисяенноЙ и инактиаированной методом сайт-специфического мутагенеза рибонуклеазы B.intewiedius позволило установить, что ряд биологических эффектов рибонуклеазы каталитически обусловлен: с наличием ферментативной активности связаны противовирусное действие рибонуклеазы, токсическое н генотоксическое действие, цитотоксичноеть рибонуклеазы, ростстимули-рующес действие на микроорганизмы [Куринеико, 1991; Килснсхая, 1998; Ильинская, 1998].Нзвестна гипотеза, объясняющая механизм биологического действия ауклеаз комплексным проявлением каталитической функции РНКаз, аффинным и иеспецифн-гесхим взаимодействием с плазматической мембраной клетки [Куринеико, 1991], Очевидно, что степень выраженности биологических эффектов фермента иа клеточном /ровне зависит от его способности к контакту с клеткой, который определяется совокупностью свойств плазматической мембраны клетки и физико-химических свойств рермента. Это предполагает, что изменение лзобого элемента указанной еовокуп-jocth свойств, например, фнзнко-химнческнх свойств фермента, может существенным эбразом отразиться на эффективности его взаимодействия с клеткой, и, следователь-jo, на биологической активности фермента.
Одним из основных инструментов изменения физико-химических свойств белка івляется его химическая модификация. Данные, полученные при изучении зависимости биологической активности от структуры методами химической модификации ис-юльзуются для развития исследовании на основе сайт-специфического мутагенеза. Химическая модификация интересна и с практической точки зрения: применение химической модификации позволило создать пролонгированные ферментные препара-
4 ты, препараты с измсисинымн иимуногенными и аллергенными своистваии [Ларионова, Торчняин,І982; Чазов и др., 1985; Максимеико, 1988].
Вес вышеизложенное даст основание рассчитывать на плодотворность использования методов химической модификации для изменения физико-химических свойств РНКазы B.intermedlvs и, как следствие, изменения ее биологической активности.
Цель и задачи исследований. Целью исследования явилось изменение каталитически обусловленной биологической активности гуанияепецифичной РНКазы B.lmermedim методами химической модификации.
Дли достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Разработать условия модификации препаратов РНКазы B.intermedius глута-ровым альдегидом и диальдегиддекстраном, позволяющие получать препараты с высоким выходом по белку и высокой ферментативной активностью.
-
Исследовать эизиматические свойства, стабильность, гидрофобносаь и элек-трофоретическую подвижность препаратов РНКазы E.intermedius, модифицированных введением в молекулу фермента различных функционально-активных групп.
-
Изучить каталитически обусловленные цитотоксические свойства препаратов РНКазы В.Intermedins с измененными физико-химическими и эизиматическими свойствами.
Научная новизна работы. Впервые показана возможность направленного получении модифицированных ферментов с заданным числом связей ферыснт-поламерный носитель с использованием носителя с одной степенью активации. Получены гидро-фобнзврованные препараты РНКзз с высоким уровнем ферментативной активности.
Показано влияние изменения физико-химических свойств на каталитически обусловленную циготоксичность модифицированной РНКазы В.Intermedins. Показано, что циготоксичность РНКазы B.intermediiis возрастает при ее гидрофобизации - в большей степени при введении в молекулу фермента алкнльных, а ис ароматических радикалов. Увеличение цитотоксичности при гидрофобюации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента. Показано, что увеличение суммарного отрицательного заряда РНКазы В.intermedins сопровождается снижением цитотоксичности фермента, тогда как увеличение суммарного положительного заряда не оказывает влияния на цитотоксические свойства. Влияния изменения Касс модифицированного фермента с J'-ГМФ на каталитически обусловленную цитотоксичность фермента не выявлено,
Результаты работы подтверждены авторским свидетельством об изобретении.
Практическое значение. Разработан способ получения модифицированных форм рибонуклеази с разный числом связей фермент - полимерный носитель при использовании носителя с одной и гон же стеггенью активации. Разработан способ увеличения гидрофобности фермента с сохранением высокого уровня ферментативной акгивностн, Способы могут быть использованы для получения новых препаратов, применяемых в медицине и биотехнологии, в практике научных исследований. Полученный фотоокнеленныб нетоксичный препарат РНКазы B.Itttermedlvs может быть использован вместо нзтивмого фермента для стимуляции каталитически независимых биологических эффектов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были изложены яа XV конференции FEBS (Брюссель, 1983); Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984); I Всесоюзном симпозиуме по инженерной энэимологии (Кобулетн 1985); I международной конференции " Структура и химия рибонуклеаз" (Москва, 1989); на межреспубликанском совещании "Нуклсазы микроорганизмов и юс практическое использование" (Рига, 1989); Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига, 1990); Втором съезде биохимическогообщества Российской академии наук (Пущино, 1957); XI Всероснй-скон конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе получено авторское свидетельство об изобретении.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста; состоят из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 12 таблиц, 13 рисунков. Список литературы содержит 171 наименование литературных источников.