Введение к работе
Актїальндсть_проОлемн. Na.K-АТФаза (КФ 3.6.1.37) является мембранной ферментной системой, осуществляющей активный транспорт ионов Na+ и к+ за счет энергии гидролиза АТФ. В процессе ферментативного цикла молекула иа,К-АТФазы последовательно существует в конформациях Ej и Eg, различия между которыми показаны в ряде исследований (Jorgeneen, 1975; KarliBh, 1973, 1980; Караков, Steinberg, 1982, 1986). Гидролиз АТФ ЭТИМ ферментом осуществляется через стадию образования промежуточного фосфорилированного интермедиата (ЕР), который возникает за счет переноса 7-Фосфзта АТФ на Asp 369 е активном центре фермента.
Характерной особенностью яа.К-АТФазы является не гиперболическая зависимость активности от концентрации субстрата (Keufeid, Levy, 1969; коьіпвоп, Уіавіїпег, 1979; Болдырев,1981). Общепринятой схемой, описывающей частные реакции Na.K-АТФазы и транспортные процессы, осуществляемые этой системой, является схема Поста-Альберса (Albers et al, 1968; Poet et al, 1969):
Na+ K+
АТФ+Ej > Ej~P > Eg-P > E2+P.
Однако она не объясняет сложной роли АТФ в процессе функционирования Na.K-АТФазы. Нагишрболическая кинетика гидролиза АТФ удовлетворительно описывается схемой Кантли (Cantley, 1983). Эта модель предполагает наличие одного центра связывания АТФ, который имеет разное сродство к субстрату в зависимости от конформационного состояния фермента. При взаимодействии с участком высокого сродства (Е1-конформвция) происходит гидролиз субстрата, в то время как
связывание АТФ с центром низкого сродства (Ео-конформация) ускоря-L/M9
ет-завершение гидролитического цикла, а именно Е?—>Ej перехода.
В настоящее время в литературе появились данные, противореча
щие втим представлениям. Кроме того, схема Кантли не предполагает
функционирование фермента в видвуолигомера, тогда как многие факты
свидетельствуют о том, что Na.K-АТФаза является олигомерной сис
темой. Таким образом, вопрос о механизме работы Na.K-АТФазы
окончательно не решен. ,
Известно, что скорость Eg—>Ej перехода сравнима со скоростью суммарной реакции, тогда как другие, стадии цикла протекают значительно быстрее. Таким образом, Е2—>Ej переход является лимитирующей стадией ферментативного процесса и сопряжен с изменением сродства не только к переносимым катионам, но и к АТФ. По этой причине исследование факторов, елиявдих на этот переход, представляет особый интерес, так как может пролить свет на регуляцию реак-кции, осуществляемой Na.K-АТФазой.
Шль_работы. Целью наших исследований явилось изучение конформационного перехода Ео—>Ет, осуществляемого Na.K-АТФазой под действием различных лигандов.
Зв5ани_иоследованяя заключались в следующем:
I). С использованием флуоресцентной метки 5-иодацетамид-
флуорэсцеина, ковалентно связывающейся с Na.K-АТФазой, исследовать
влияние температуры и рН на Е,—>Еу переход.
2). Изучить влияние различных концентраций Na+, к+ и
нуклеотидов на Е2—>Щ переход.
3). Исследовать концентрационную зависимость связывания АТФ
и других лигандов с Na.K-АТФазой в разных условиях .(рН, t).
Наїчная_швизна_работа. Обнаружено, что в отсутствие добавленных лигандов равновесие между Е, и Ет конформациями фермента при температурах Ю-40С сдвинуто в сторону Е~ и зависит от температуры: при ее снижении возрастает доля конформвции Е~.
С использованием двух независимых методов (регистрация изменения флуоресценции меченого фермента или включение радиоак-тивной метки при связывании [7- РШФ) впервые изучено связывание АТФ и его аналогов с Na.K-АТФазой в широком диапазоне концентраций (0,5 мкМ - 15 мМ). Установлено, что в присутствии К+ кривая связывания нуклеотида имеет такой же вид, как и зависимость активности фермента от концентрации АТФ. Полученные данные прямо показывают, что кроме центров высокого , сродства к нуклеотиду Wa.K-АТФаза имеет центр низкого сродства, причем наличие двух типов АТФ-связывающих центров обнаружено как в среде с к+ (концентрация 100 - 150 мкМ),. так и в среде с Na+ (концентрация 150 мМ). Эти данные свидетельствуют о том, что фермент не может функционировать в соответствии со схемой, предложенной Кантли, так как . согласно этой схеме Е, и Ет конформации фермента имеют только один тип АТФ-связывающих центров.
Показано, что в связывании субстрата с центрами высокого и низкого сродства принимают участие различные области молекулы АТФ.
Результаты исследования углубляют представления о механизме действия Na.K-АТФазы, а также ставят новые задачи дальнейшего изучения Na.K-АТФазной системы. Полученные данные используются в цикле лекций спецкурса "Биохимия мембран" для студентов кафедры биохимии Биологического факультета МГУ. Сочетание различных методических подходов, использованных в данной работе, может найти
применение при исследовании других мембранных ферментов.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на X
Объединенном симпозиума биохимических обществ СССР и ГДР "Механизм регуляции клеточной активности" (Ташкент, 1989) и на Мэвдународном симпозиуме "Moleoular organisation of biologioal Btruoturee" (Москва, 1989).
Пібликащи. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Стукту^а_и_дбъем_Лссе^тации. диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, раздела "Результаты и обсувдение", Заключения, Выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит s/&~ стр. машинописного текста, О таблиц и ^/д рисунков. Список литературы включает JjSf источника.