Введение к работе
Актуальность темы. Актин - один из наиболее распространенных белков в природе. Образуемые им филаменты (F-актин) являются одним из главных компонентов питоскелета эукариотических клеток, где содержание актина очень высоко, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения. Различные неблагоприятные условия (такие, как тепловой шок) могут приводить к денатурации актина и его последующей агрегации. Накопление агрегированного белка представляет серьезную угрозу для клетки и это особенно опасно в случае белков, представленных в большом количестве, - таких как актин. Для предотвращения формирования нерастворимых белковых агрегатов в клетке существуют различные механизмы, одним из которых является экспрессия малых белков теплового шока (sHSP).
sHSP - большая и гетерогенная группа белков с молекулярными массами от 12 до 43 кДа, характерной особенностью которых является наличие консервативного участка (а-кристаллинового домена) в С-концевой части. Многие sHSP образуют большие олигомерные комплексы, которые могут различаться по структуре и количеству мономеров. Было показано, что in vitro они могут функционировать как молекулярные шапероны и предотвращать агрегацию частично или полностью денатурированных белков, причем эта их способность зависит от четвертичной структуры sHSP. В клетках многие sHSP подвергаются фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что сопровождается изменением их олигомерного состояния и шаперонной активности.
К настоящему времени в литературе накоплен огромный материал о защитном действии sHSP на агрегацию различных белков-мишеней в процессе их денатурации. При этом, однако, конкретный молекулярный механизм такого шаперонного действия sHSP оставался зачастую совершенно неясным. Так, например, не было однозначного ответа на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP: влияют ли они на денатурацию белка-мишени, приводящую к его агрегации, или же лишь препятствуют агрегации частично или полностью денатурированного белка. Многие авторы, наблюдая in vitro лишь подавление агрегации различных белков-мишеней малыми белками теплового шока, делали вывод о том, что sHSP препятствуют денатурации исследуемого белка, не имея на то достаточных оснований.
В ответ на различные неблагоприятные воздействия, такие как тепловой шок, экспрессия некоторых sHSP (аВ-кристаллин, Hsp27) значительно увеличивается, и их наибольшее количество обнаруживается именно в мышечных тканях, где содержание актина также очень велико. Можно предположить, что одна из функций таких sHSP заключается во взаимодействии с актином. В ряде исследований были сделаны попытки проанализировать взаимодействие некоторых sHSP (аВ-кристаллин, Hsp27, Hsp20) с нативными актиновыми филаментами. Результаты этих исследований, однако, весьма противоречивы и не подтверждают того, что sHSP могут связываться с нативным F-
актином. Было показано, что в ответ на стресс sHSP могут перемещаться из цитозоля и локализоваться в области цитоскелета, причем такое перемещение может приводить к стабилизации актиновых филаментов. Исходя из этих данных, более вероятным кажется предположение, что sHSP взаимодействуют с актином только при неблагоприятных условиях, таких как тепловой шок, но конкретный молекулярный механизм этого взаимодействия оставался до недавнего времени совершенно неясным. В частности, оставалось неясным, способны ли sHSP взаимодействовать с нативными актиновыми филаментами и оказывать влияние на их денатурацию. Все еще оставалось неизвестным, какую роль в защите актина от агрегации может играть фосфорилирование sHSP и их олигомерное состояние. Выяснение этих вопросов и составило главную цель данной диссертационной работы.
Цель и задачи работы. Итак, целью работы было детальное изучение защитного действия малых белков теплового шока на агрегацию актиновых филаментов, вызываемую их тепловой денатурацией. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние sHSP на тепловую денатурацию F-актина.
Проанализировать процесс агрегации F-актина при его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии sHSP.
Сравнить шаперонные свойства нефосфорилированного малого белка теплового шока и его мутантной формы, имитирующей фосфорилирование.
Основные положения, выносимые на защиту.
Малые белки теплового шока эффективно защищают актиновые филаменты от агрегации, вызываемой тепловой денатурацией, но при этом они не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не оказывают влияния на сам процесс тепловой денатурации F-актина.
Защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов малых белков теплового шока с денатурированным актином.
Исходное олигомерное состояние малых белков теплового шока, определяемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP предотвращать агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации и образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином.
Научная новизна. Разработан новый подход на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для исследования взаимодействия sHSP с F-актином в процессе его тепловой денатурации. Впервые удалось
получить ответ на один из ключевых вопросов, связанных с молекулярным механизмом действия sHSP, - а именно выяснить, что они предотвращают тепловую агрегацию белка-мишени, но не препятствуют его тепловой денатурации, предшествующей агрегации. Установлено, что защита F-актина от агрегации осуществляется путем образования небольших, стабильных и хорошо растворимых комплексов sHSP с денатурированным актином. При совместном использовании методов ДСК, динамического светорассеяния, седиментационного и флуоресцентного анализа проведены исследования свойств таких комплексов. Показано, что изменение исходного олигомерного состояния sHSP, вызываемое, в частности, фосфорилированием этих белков или его имитацией, не оказывает существенного влияния на способность sHSP образовывать небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином. Получены данные, впервые позволяющие описать механизм защиты актинового питоскелета от аморфной агрегации, приводящей к гибели клеток при различных неблагоприятных воздействиях.
Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области механизма, лежащего в основе шаперонной активности sHSP, и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии. Разработанный нами экспериментальный подход - параллельное исследование тепловой денатурации и агрегации F-актина, проводимое в одинаковых условиях и при одной и той же скорости прогрева в отсутствие и в присутствии sHSP, может использоваться (и уже успешно используется) для изучения взаимодействия sHSP с другими белками-мишенями.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино-на-Оке Московской области, 2004; 2006; 2008), на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2005» (г. Москва, 2005), на 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (о. Эльба, Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005; г. Гейдельберг, Германия, 2006), на 30-м Международном конгрессе FEBS (г. Будапешт, Венгрия, 2005), на 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (г. Будапешт, Венгрия, 2007) и на конкурсе лучших научных работ, выполненных в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2005 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (4 статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (145 источников). Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 35 рисунков и 1 таблицу.
