Введение к работе
Актуальность темы. Сигнали, поступающие к клетке извне, пе-цаются внутриклеточным биохимическим системам при помощи вто-чных мессенджеров. Кальций служит одним из этих вторичных мес-нджеров. Однако, для того, чтобы кальций эффективно управлял еточными процессами, его функционирование, в свою очередь, лжно подвергаться регуляции. Поэтому в клетке в ходе эволюции зникла сложная система белков, которые взаимодействуют с иона-кальция, тем самым управляя передачей и приемом внутриклеточ-х сообщений. Кальмодулин, являющийся одним из этих Са -связы-ющих белков, связываясь с кальцием, в свою очередь взаимодей-вует с другими белками, тем самым регулируя множественные кле->чные функпии. На сегодняшний день известны более 30 Са -КМ -стивируемнх ферментов в различных тканях и количество таких фер-штов непрерывно растет.
Очевидно поэтому те биологически активные вещества, кото-іе влияют на Са -КМ зависимые ферменты и физиологические про-5ссы, полезны не только для фундаментальных биологических ис-юдований, направленных на познание молекулярных основ жизнен-ix. процессов, но и приобретают все возрастающее значение для ірмакологии, в том числе и для создания новых лекарств. За пос-эдние десятилетия создано большое количество синтетических эедств, являющихся антагонистами Са2+ и кальмодулина, которые эочно вошли в медицинскую практику. Однако, несмотря на значи-зльные успехи в деле изыскания лекарственных веществ подобного зйствия, дальнейшая работа в этом направлении продолжает оста-агься весьма актуальной
Наряду с этим особый интерес представляют и эндогенные, бис— огически активные вещества, влияющие на Са -КМ-зависимые фер-енты и физиологические процессы. Ранее сообщалось о существова-ии веществ пептидной природы, которые обладают кардиотропным ействием. Били обнаружены как коронарорасширяющие, так и коро-аросуживающие факторы и установлено, что эти нейропептиды явля-тся уникальными регуляторами уровня вторичных посредников клет-и - циклических нуклеотидов и ионов кальция (Галоян А.А., 1986). і дальнейшем Ралояном А.А. были обнаружены пептидн, которые дей-твуют на Са -КМ зависимые ферменты без участия ионов Са и КМ, . также пептида, которые активируют некоторые Са -КМ ферменты
_ 4 -без участия ионов кальпия, что свидетельствует о наличии дополнительных систем регуляции активности этих ферментов (Галоян А.А., 1990).
Исходя из вышеизложенного и принимая во внимание весьма важное значение поиска новых эндогенннх физиологически активные веществ, нами были исследованы также новые гомогенные вещества, выделенные из гипоталамуса.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явился поиск новых биологически активных веществ синтетического происхождения среди арилгетериламинов тетрагидропиранового и пиперидинового ряда, и из веществ эндогенного происхождения, выделенных из гипоталамуса,действующих на Са -КМ зависимые ферменты и про пессы. Нашей целью было также изучение фармакологического действия этих веществ на сердечно-сосудистую систему и на рост злокачественных новообразований. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
I. Провести первичный отбор, изучая действие новых веществ на сократимость гладких мышц, вызываемых разными агонистами.
П. Изучить влияние выявленных активных веществ на Са2+-КМ зависимые ферменты и процессы, такие как фосфорилирование легких цепей миозина, активность фосфодиэстеразы цАМ> и пролифера-іхрия клеток яичника китайского хомячка.
Ш. Выявить наиболее активные вещества и изучить их свойства в качестве средств направленного фармакологического действия на следующих экспериментальных моделях:
а) влияние на коронарный кровоток,
б) влияние на разные модели аритмии, вызванные CaCIg, адре
налином, строфантином и перевязкой левой нисходящей артерии
сердца,
в) влияние на агрегационную способность тромбоцитов, выз
ванную разными индукторами агрегации: Ада, адреналином и колла
геном,
г) влияние на пролиферацию клеток,
'д) влияние на рост злокачественных новообразований,
6), определение острой токсичности.
Научная новизна работы. Среди большой группы новых оригинальных соединений - арилгетериламинов тетрагидропиранового и пиперидинового ряда обнаружены, соединения, являющиеся блокатора ми входа ионов Са^ в клетку и антагонистами кальмодулина. На
сновании проведенных биохимических и фармакологических лсследо-аний отобрано наиболее активное вещество - дигидрохлорид N-[-,2,5-триметил-4-фенилішперидин-4ил)зтил ] -N-цианометил-Ы-3,4-диметоксибензил)амина.
Было обнаружено также новое гомогенное вещество непептид-ой природы, выделенное из гипоталамуса, влияющее на некоторые а -КМ зависимые ферменты и физиологические процессы.
Изучено фармакологическое действие этих веществ на сердеч-э-сосудистую систему, а также на пролиферацию интактных клеток на рост злокачественных новообразований.
Практическая ценность. Выявленные новые биологически активне вещества имеют потенциальную возможность стать лекарственны-и средствами для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Ведется работа по подготовке экспериментального материала яя представления в Фармакологический Комитет Министерства здра-оохранения СССР.
Апробация работы. Материалы и положения диссертации доложе-а и обсуждены на заседаниях ученого совета Института биохимии И Армении и Института тонкой органической химии АН Армении Ереван, 1990, І99Г).
По материалам диссертации опубликовано в работ*
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 стра-вдах машинописного текста, содержит 21 рисунок и I таблицу, на состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной асти, изложения результатов, обсуждения, выводов и списка ци-ируемой литературы, насчитывающего 197 наименований.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы
Для разработки и решения поставленных задач был подобран вд биохимических и фармакологических методов:
Эксперименты на изолированных гладких мышцах. Исследование іияния веществ на сократительную способность гладких мышц про-эдили на изолированном препарате рога матки и портальной вене эысы, а также на изолированных аортах крыс и кроликов по мето-Ч Гренджера и др. ( Granger et al., 1985). Было изучено влия-яе исследуемых веществ на сокращения этих гладких мышц при дей-рвии разных агонистов (норадреналина, гистамина и окситоцина)
в растворе Кребса, а также вызванные постепенно возрастающими концентрациями Са2+ (от Ю-5 до Ю-2 М) в К^-деполяризущем раї воре. Механическую активность гладких мышц изучали в изометрическом режиме с помощью двуханодного диодного механатрона типа 6МХХ2Б. Раствор в камере при температуре 37±0,5С, рН-7,4 аэрировали смесью 95$ -02» 5% - СС^.
Исследование действия веществ на ФосФорилирование легких пепей миозина. Фосфорилирование ЛЦ^ проводили инкубацией очище: ного миозина, выделенного методом Б.Ф.Поглазова с некоторыми модификациями (Левицкий и др., 1982), содержащего полностью де фосфорилированные Лц^,,с "грубым" экстрактом киназы легких цепе миозина, полученным из скелетных мышц кролика по методу Морган (Morgan at al., 1976). В контрольных образцах использовали та кое соотношение фермента и миозина, при котором происходит фос форилирование на 100$. В опытные образцы добавляли и испытуемы вещества. Степень фосфорилирования ЛЦ^, регистрировали по увели чению электрофоретической подвижности ЛЦд при электрофорезе в ПААГ в присутствии 8 М мочевины.
Метод исследования действия веществ на активность Оа -КМ зависимой ФосФодиэстеразы. Препарат ФДЭ получали по методу, предложенному ранее (Бобрускин и Шайхин, 1985). Кальмодулин вы деляли из мозга крупного рогатого скота по методу Гопалакришнь И Андерсона С некоторыми модификациями ( Gopalakrlstma and An dereon, 1982). Дальнейшую его очистку проводили с помощью ВЭЖ) на колонке tsk ДЭАЭ.
Полученная нами ФДЭ в присутствии 200 нМ кальмодулина и I 10 М CaCIp активировалась приблизительно 10-15 раз. В ис пытуемые пробы добавляли исследуемые вещества. Активность ФДЭ определяли ПО методу Томпсона И Аг.племача v Thompson end Арр-leman,' 1971) с использованием двухстадийной реакции гвдролиза [^Е] цАМР и 1] 5 AMP с участием ФДЭ и 5-нуклеотидазы змеиноз яда соответственно. [/В.] аденозин, образовавшийся в результаті этой двухстадийной реакции, отделяли от негидролизованных субі ратов анионообменной хроматографией на смоле Дауэкс AC І-Х2 и определяли уровень радиоактивности во фракции, содержащей аде нозин. Результаты представлены в относительных единицах актив ' ности (ОЕА), рассчитанных по проценту гидролизованного субстр та в минуту с учетом остаточной радиоактивности проб в отсутствие фермента и уровня неслецифической сорбции аденозина на
_ 7 -онообменнике при полном гидролизе субстрата в присутствии из-ытка фермента.
Исследование действия веществ на поолиферативную активность леток яичника китайского хомячка Kj(CHO-K-r). Для исследования ;ействия веществ на клеточную пролиферацию в культуре была ис-шьзована линия клеток яичника китайского хомячка КЛСНО-Кт). нтенсивность синтеза ДНК в клетках определяли по включению Н-Тимидина ( Hidaka et al., 1981 ).
Метод исследования агрегаиионных функций тромбоцитов. Изу-ение воздействия веществ на агрегационную способность тромбоци-'ов проводилось на крови человека. Агрегацию тромбоцитов индуци-ювали АДФ, коллагеном и норадреналином в концентрациях 5 мкМ,
мкг/мл, 2 мкг/мл, соответственно. Критерием агрегационной сложности кровяных пластинок служил процент снижения оптической. иотности богатой тромбоцитами плазмы, величину которого опреде-шли по методу Борна (Born, 1962) с использованием двухка-іального агрегометра "Payton". Уменьшение оптической плотно-;ти БТП при образовании агрегатов оценивали в процентах. Учиты-іали также время начала агрегации, наличие и отсутствие дезагре-<ации, степень выраженности последней.
Метод определения величины коронарного кровотока
Измерение объемной скорости коронарного кровотока произво-дали на наркотизированных уретаном с хлоралозой кошках по мето-СУ (Morawltz, 1914) в модификации Н.В.Кавериной (1958). [змерялся объем крови, оттекающей из коронарного синуса за еди-іииу времени до и после применения испытуемого соединения.
Методы изучения антиаоитмического действия соединений
Желудочковую аритмию, возникающую вследствие нарушения сровоснабления миокарда, воспроизводили в опытах на наркотизи-юванных этаминалом натрия кошках по методу Столярчук и др. [1985), вставляя лигатуру на нисходящей ветви левой коронарной іртерии, на уровне нижнего края ушка предсердия. Вследствие этого у части животных возникали ранние ишемические нарушения сердечного ритма в виде'желудочковой экстрасистолии.
Модель хлоркальпиевой аритмии воспроизводили на наркотизированных уретаном (I мг/кг) крысах по методу Малинова и др. : Kalinov et al., 1955). Вещества вводили в бедренную вену. 3 процессе опыта на ЭКГ регистрировали частоту возникновения іритмии, частоту восстановления синусового ритма и выживаемость
- 8 -животных в каждой группе, по сравнению с животными, получившим только хлорид кальция.
Стрсфантиновую аритмию у наркотизированных нембуталом (40 мг/кг) морских свинок получали внутривенным введением строфантина в дозе 0,5 мг/кг. Аритмия развивалась сразу и продолжалась 10-15 мин, заканчиваясь смертью животного. Активность соединений оценивали по способности предупреждать развитие строфантино-вой аритмии и удлинять время выживания животных.
Адреналиновую аритмию получали на наркотизированных уретаном (I мг/кг) крысах внутривенным введением адреналина в дозе 0,03 мг/кг. Аритмия развивалась сраз;у (брадакардия, экстрасистс— лия) и продолжалась в среднем 56,5+18 с. ЭКГ регистрировали непрерывно ІЇ стандартным отведением.
Изучение противоопухолевой активности
Изучение противоопухолевой активности соединений проводили известными методами (Софьиной и др., 1976) на мышах с саркомой 180, асиитной карциномой Эрлиха, раком-легкого Люиса и гемоцито-бластозом La. Лечение животных проводили внутрибрюшинным введением веществ в дозах, составляющих 1/6 от их ДДзд. Терапевтический эффект на животных с раком легкого Люиса оценивали по проценту торможения роста опухоли, а при саркоме 180, асцитной карциноме Эрлиха и гемоцигобластозв La по увеличению средней продолжительности жизни животных.
Метод определения острой токсичности.
Острую токсичность соединений определяли на белых мышах-самцах массой 18-21 г при внутривенном введении. Каждую дозу соединений испытывали на 7 животных. Результаты опытов учитывали через 24 часа в альтернативной форме по числу погибших животных.