Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитокинины являются гормонами растений, участвующими в регуляции таких важнейших процессов, как деление клеток, дифференцировка побегов, задержка старения листьев, устьичные движения, ответ растения на стресс и многое другое (Skoog and Miller, 1957; Кулаева, 1973,1982,1995; Matsubara, 1990).
В связи с этим очевидна теоретическая и практическая значимость исследований механизма их действия. Центральной задачей этой проблемы является исследование рецепторов цитокининов, с помощью которых растительные клетки воспринимают и передают гормональный сигнал, индуцируя цепь событий, определяющих ответ клеток на данный фитогормон (Кулаева, 1995).
Поскольку цитокинины, как и все другие гормоны растений, полифункциональны, то до сих пор не известно, регулируются ли цитокининами разные физиологические программы с помощью разных рецепторов или во всех случаях гормональный сигнал воспринимается одним рецептором, а затем передается на различные системы, что и определяет многообразие возможных ответов клетки на гормон.
В настоящее время известно большое число цитокинин-связывающих белков (ЦСБ) (Кулаева, 1982, 1995; Romanov et al., 1990; Brinegar, 1994). Однако функциональная активность гормон-рецепторных комплексов для большинства ЦСБ не установлена, что затрудняет их оценку в качестве рецепторных белков. Исключение в этом отношении составляет выделенный в последнее время из цитозоля листьев ячменя зеатин-связывающий белок с молекулярной массой 67кД (ЦСБ-67) (Каравайко и др., 1995; Kulaeva et al., 1995), который, подобно рецепторам стероидных гормонов животных, принимает участие в гормон-зависимой регуляции транскрипции.
Упомянутый выше функционально активный рецептор цитокинина был выделен из закончивших рост листьев ячменя, у которых цитокннин задерживает старение, не вызывая деления клеток, их роста или каких-либо процессов дифференцировки (Каравайко и др., 1995). Мы поставили своей задачей проверить, присутствует ли подобный рецепторный белок в совершенно иной биоло-
гической системе - побегах пятидневных этиолированных проростках кукурузы, состоящих из колеоптиля и заключенного в него первого листа (рнс.1). В такой системе происходит активное деление и рост клеток. Поэтому функция цитоки-нина в этиолированных проростках должна отличаться от функции этого гормона в закончивших рост листьях. Заранее трудно было предсказать, обнаружим ли мы в этиолированных проростках кукурузы рецептор цитокинина близкий по свойствам к рецептору из зрелых листьев ячменя. Этот вопрос нуждался в экспериментальной проверке.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в том, чтобы изучить, присутствует ли рецептор цитокинина в цитозоле клеток этиолированных проростков кукурузы. В связи с этим в задачу работы входило: разработать метод выделения ЦСБ из этиолированных проростков кукурузы, охарактеризовать цитокинин-связывающие свойства выделенного белка и выяснить, участвует ли он в регуляции цитокинин-завйсимой транскрипции.
Научная новизна. Впервые из этиолированных проростков кукурузы выделен ЦСБ молекулярной массой 70 кД (ЦСБ-70). Разработано две схемы выделения этого белка. Обе схемы имеют препаративный характер и включают в себя оригинальные методы отделения белков от вторичных метаболитов растительной клетки. Выделение белка в чистом виде проводилось с использованием аффинной хроматографии на иммобилизованном зеатинрибозиде. Показано, что ЦСБ-70 специфически и обратимо связывает активные цитокинины. Белок узнается антиидиотипическими антителами, полученными на антитела к зеати-ну и взаимодействующими с зеатин-связывающим белком из ячменя. Изучено влияние ЦСБ-70 на цитокининзависимую РНК полимеразную реакцию в системе, содержащей хроматин из листьев ячменя. Показано, что ЦСБ-70 активирует синтез РНК в этой системе в присутствии зеатина в физиологически активной концентрации. Кроме того, выяснено, что ЦСБ-70 из этиолированных проростков кукурузы по всем изученным параметрам аналогичен ЦСБ-67 из ячменя и эти два белка являются представителями семейства рецепторов цитокинина в злаках.
Практическая значимость. Данные, полученные в результате проведенных исследований, имеют, прежде всего, ценность для фундаментальной науки, поскольку позволяют сделать вывод о существовании семейства рецепторов ци-токинина, участвующих в гормон-зависимой активащш транскрипции. Это открывает перспективу детального изучения молекулярных механизмов гормон-рецепторных взаимодействий в растительной клетке.
С использованием предложенных в этой работе схем очистки ЦСБ-70 проводится выделение белка для структурных и иммунохимических- исследований. Разработанные методы разделения белков и вторичных метаболитов в растительном экстракте могут применяться в процессе выделения любых водорастворимых растительных белков как в аналитическом, так и в препаративном масштабе.
Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации были представлены на международной конференции по рецепции и трансдукции гормональных сигналов у растений (Москва, 1994 г.) и на рабочем совещании INTAS (Москва, 16 марта 1996 г.).
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы.