Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время биохимия белковых гор-ыонов является одной из актуальных областей современной эндокринологии и выделяется как самостоятельное направление.
Полипептидные гормоны являются важнейшими биорегуляторами обмена веществ в организме, выполняют множество биологических функций. В связи с этим выделение и очистка гормонов, изучение их свойств, специфики физиологической функции и структурно-функциональной организации белковой молекулы представляет весьма перспективное направление. Особый интерес в настоящее время вызыва ют различные природные модификации и варианты белково-пептидных гормонов, и поэтому выделение их, изучение является непременным условием выяснения регуляции различных процессов, обусловленных биологическими эффектами гормона, а также позволит открыть новое звено в сложной системе гормональной регуляции.
Полипептидные гормоны уникальные биорегуляторы всех видов обмена в организме и отличаются широкой полифункциональностью. Один vi3 аспектов полифункциональности касается природной гетерогенности белково-пептидных белков, одна из причин которой является различные посттрансляционные модификации, приводящие к образованию измененных белков,.появлению форм гормона отличных от до -минирующей молекулы. Модификации затрагивают не только химическую структуру белка, но и отражаются на биологических, иммунологических и физико-химических свойствах гормона.' , ' Одним из. важнейших полипептидных' гормонов временной эндокринной железы беременности является плацентарный лактоген: человека |ГШЧ). Синтез его синцитиотрофобластом происходит на протяжении всего срока беременности, 8095 гормона поступает в кровь беремен-
- 2 -ной женщины, и 10% в амниотичеокую жидкость и к плоду. Концентрация ПЛЧ увеличивается на протяжении всего срока беременности пря-ьо пропорционально нарастанию массы плаценты и плода. Гормон является одним из основных регуляторов метаболических процессов в организме матери, направленных на обеспечение роста и развития плода. Такие его эффекты как стимуляция лактации, усиления синтеза белка, участие в эритропоэзе, влияние на метаболические процессы в организме плода и другие эффекты играют определяющую роль в процессе вынашивания беременности. Клиническая значимость определения гормона на протяжении всего срока беременности обусловлена тем, что снижение его уровня свидетельствует о нарушении функции плаценты и является прогностическим признаком угрозы для состояния плода.
Б связи с этим выделение, очистка и изучение свойств и различий природных модифицированных вариантов гормона представляет весьма перспективное направление, позволяющее открыть новое звено в системе гормональной регуляции обеспечивающей сложную взаимосвязь организма матери и плода.
В литературе имеются данные о наличии высокомолекулярной формы гормона в плаценте человека. Диивр ГДО является физиологической формой гормона, а не продуктом экстракции или артефактом, регуляция механизма образования дисульфидных димеров и их биологическая значимость еще не ясны.
Представленная в настоящей работе новая расщепленная форма плацентарного лактогена человека, ранее не описанная в литературе, позволяет более глубже подойти к выяснению физиологической роли гормона в организме, и может быть основой для детального
изучения природных вариантов ПЛЧ в различные сроки беременности и состояния, а также способствовать поиску метода количественного определения данной формы гормона в циркуляции.
Цель и задачи.исследования. Настоящая работа является частіші исследований, проводимых в ИЭЭ и ХГ АМН СССР по выделению и изучению белково-пептидных гормонов. Целью настоящей работы являлось выделение и очистка, сравнительный анализ физико-химических, иммунологических и биологических свойств мономера ПЛЧ и новой расцепленной формы гормона. Сформулированная цель исследования предполагала следующие конкретные задачи:
1. Выделение и очистка ШІЧ из плаценты человека.
2. Решение первой задачи повлекло за собой разработку и
последующее применение оригинального способа получения гормона.
-
Разработка первого способа позволила модификацию метода и подбор условий для другого сорбента.
-
Изучение физико-химических, иммунологических и биологических свойств гормона, полученных на двух сорбентах и сравнение их путем электрофореза в ПААГ, аминокислотного состава и Я-кон-цэвых аминокислот.
-
Решение задачи выделения ПЛЧ повлекло обнаружение расщеп* ленной формы ПЛЧ в экстракте плаценты.
-
Исследование и сравнительный анализ физико-химических, їй» мунологических и биологических свойств нативного гормона и расщепленной формы гормона.
Научная новизна работы. В работе представлено два принципиально новых разработанных подходов по выделению и очистке ГОІЧ. Предложенные'Ме^ода-йЙзВйДйет. быстро и воспроизводимо получить
высокоочищенный гормон, в достаточно ыягких условиях во избежания денатурации и аггрегации материала. Разрешение проблемы получения и очистки ШЧ натолкнуло нас на новую форму гормона, ранее не описаннуо в литературе. Это новая расщепленная форма плацентарного лактогена человека. Проведено сравнительное исследование физико-химических свойств, аминокислотного состава, электрофоре-тической подвижности с восстановлением дисульфидных связей. Проведено определение иммунологической активности, биологической в сравнении с мономером гормона и биологическими стандартами. Установлено место расщепление в молекуле ПЛЧ, что является результатами, имесщими приоритетный характер, и позволит пересмотреть устоявшееся представления о молекулярной биологии.данного белка.
Несмотря на то, что форма дисульфидиого димера плацентарного лактогена человека описана в литературе, данные о существовании расщепленной формы ШІЧ и ее характеристики получены впервые.
Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные в работе данные свидетельствуют о том, что плацентарный лак-тоген человека присутствует в плаценте не только в виде мономера, дисульфидного димера, а также существует и расщепленная форма гормона. Присутствие гормона в организме в различных структурных вариантах и молекулярных форы, образованных вследствии природных посттрансляционных модификаций, способны изменять его функциональные свойства. Повышенная биологическая активность и сниженная иммунологическая расщепленной формы ШІЧ, в сравнении с мономером гормона, свидетельствуют о недостаточной информативности методов иммунологического анализа, используемых для оценки содержания в
крови беременных женщин.
Существование плацентарного лактогена человека в виде расцепленной формы служит еще одним доказательством и подтверждением обшего происховдения гормонов семейства СТГ, включающее в себя гормон роста, пролактин и ШЇЇ.
Относительная доступность и высокий конечный выход расщепленной формы ПЛЧ несомненно будут способствовать разработки специфического метода количественного определения гормона на протяжении всего срока беременности, а также позволит исследовать физиологическую роль формы, ее взаимосвязь мевду сроком беременности, концентрацией в крови и состоянием плода. Это позволит четко выявить функциональную специализацию расщепленной формы ПЛЧ, что в дальнейшем позволит проведение анализа взаимосвязи клинической сиштоматики в система мать-плод.
Представленные в работе данные по методу выделения и очистки' ПЛЧ двумя схемами, будут использованы для получения и наработки гормона в достаточных количествах, с целью разработки и внедрения имиуноферментннх тест-систем для количественного'определения гормона в циркуляции. Полученные результаты будут способствовагь улуч пению работы и повышению качества диагностики в акушерстве и гинекологии, что позволит выявлению патологии на ранних сроках беременности, а'такие снижению перинатальной смертности.
Апробация.работы. Материалы диссертации представлены в виде доклада и обсувдены на совместном заседании лабораторий Института экспериментальной эндокринологии и хиши гормонов АВД СССР (1989г.?
Публикации. По теме диссертации опубликовано . печатные работы.
.-6-
Объем и структура диссертации» Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит таблиц и рисунков. Состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, насчитывающего отечественных и иностранных источников.