Введение к работе
1.1. Актуальность темы:
Одной из основных проблем современной генетики в плане решения прикладных задач селекции, является выяснение закономерностей работы генов, возникновения их устойчивых ассоциаций, обуславливающих формирование генотипов с желаемым комплексом признаков. В установлении закономерностей формирования таких устойчивых ассоциаций, а также функционирования генных комплексов ведущую роль должны сыграть генетические модели, раскрывающие функциональные свяэи на макро-, микро- и молекулярном уровне.
Изучение структуры генов связанных с полезными признаками сельскохозяйственных животных представляет несомненный интерес как в теоретическом плане, так и для практического применения. Особо в этом отношении привлекают внимание исследователей белки молока, как потенциальные генетические маркеры. Наиболее надежные результаты были получены при оценке полиморфизма белков молока-казеинов (Сп).бета-лактоглоСулинов (Lg), альфа-лактоальбуминов (Lab) оказывающих определенное влияние на качество продукта, его выход.
Белок бета-лактоглобулин проявляет полиморфные свойства, имея генетические варианты А, В. По данным ряда учен ых указанные генотипы обнаруживают связь с молочными качествами' животных. Установлено, что селективная ценность коров по типам бета-лактог-лобулина, альфа - и каппа-казеина определяется отбором по удою и количеству молочного жира , преимущество имеют коровы с типами бета-LgBB, альфа -СпАА, каппа-СпАА / Маринчук Г. Е. 1979/.
В то же Время некоторые авторы /Маринчук Г. Е. , 1992; Graml R. ,et al. , 1986; Hines H. С. et al. , 1981/ высказали предположение о нетесном сцеплении между казеиновым комплексом и локусом бета- лактоглобулина.
Достижения молекулярной генетики, позволившие конструировать и клонировать рекомбинауные ДНК, вводить эту генетическую информацию в геном, открыли принципиально новые возможности
- 4 -направленного изменения наследственности. При этом особый интерес представляют приемы создания и интегрирования в геном животных различных генных конструкций, в первую очередь анологичных имеющимся в их наследственной информации, т.е. гены той же специализации, но других видов животных и человека с разными регуляторними последовательностями.
При целенаправленном переносе генов, к примеру, под молоч-но-специфическим промотором, их экспрессия будет происходить в молочной железе трансгенных животных, и вместе с молоком будут выделяться необходимые белки. При этом выделенные из молока реком-бинантные белки, как это уже отмечено, обладают специфической активностью, что указывают на способность ферментных систем клеток молочной железы к посттрансляционной модификации .
Исходя из этих предпосылок изучение структуры генов и их представительства в геномной ДНК данной популяции, контролирующей синтез лактопротеинов, ученые считают важной задачей современной генетики. С другой точки зрения актуальны работы по созданию и клонированию молекулярных зондов, позволяющих идентифицировать изучаемые последовательности, а также исследовать полиморфность рестриктных фрагментов изучаемых генов.
В нашей работе была предпринята попытка получения представительных кДНК- библиотек из ткани лактирующей молочной железы овцы, и выделения клона комплементарного к ыРНК бета-лактоглобулина, изучения его структурных последовательностей' методом рестриктного анализа, блот-гибридизации и секвенирования.
Дедь и задачи исследований
Целью нашей-работы являлось выделение и изучение структуры кДНК гена бета-лактоглобулина овцы. Для достижения этой цели предполагалось решить следующие вадачи:
-
Выделение поли (А)+ РНК молочной железы овцы и характеристика транскрипции гена бета-Lg с помощью "ноэерн" блот-гибри-дизации.
-
Синтез и клонирование полноразмерной кДНК молочных белков овец в фаговом векторе лямбда-gtlO.
-
Проведение скрининга для выделения из кДНК-Оиблиотеки фрагментов гомологичных последовательностям кДНК бета-лактоглобулина.
- Б -
-
Структурная характеристика выделеных фрагментов кДНК бета- лактоглобулина с помощью рестрикции, блот-гибридизации и сек-венирования.
-
Использование кДНК фрагментов в качестве молекулярных зондов для ..изучения ІЩРФ ( полиморфизма длины рестрикциониых фрагментов) гена бета-лактоглобулина разных пород овец.
Научная новизна и практическая ценность работы
В фаговом векторе лямбда-gtlO былдсоздана кДНК библиотека из молочной железы овцы. Выделен один клон, имеющий последовательность, гомологичную кДНК бета-лактоглобулина овец. Были охарактеризованы последовательности ДНК этого клона методом рестрикцион-ного анализа и на этой основе построена рестрикционная карта Рестрикционная. карта соответствует данным, которые приведены в работе Gaye et al. ( 1986 ). Были частично секвенированы последовательности ДНК этого клона. Впервые изучен полиморфизм гена бета- лактоглобулина овцы' в межпородном и внутрипородном аспекте.
ДНК породы эдильбаевских. каракульских и романовских овец после расщепления рестриктазами EcoRI и PvuII гибридизовались с кДНК бета-лактоглобулина. У романовской породы овец был выявлен полиморфизм длин рестриктных фрагментов при использовали рест-риктазы EcoRI (фрагменты 2800 пар нуклеотидов и, 4600 п. н.) и при использовании PvuII- 3000 п. н. и 1900 п. н.. У эдильбаевских овец, после расщепления ДНК рестриктазой EcoRI. также установлены два фрагмента - 2800 п. н. и 4600 п. н.. При использовании эндонук-леазы PvuII найден'только один фрагмент с длиной 1900 п.н. А у каракульских овец при рестрикции EcoRI найден один фрагмент -2800 п. н. и прі рестрикции PvuII - 1900 п. н..
Апробация работы
Основные результаты работы докладывались на 44-й научно-методической конференции аспирантсг, и на семинаре отдела биотехнологии БИЖа. Полученный экспериментальный материал, представлялся на Всесоюзном научно-техническим совещании по проблеме развития биотехнологии в животноводстве ( Дубровицы 1990 г.), Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов ( Алма-Ата-1991 т>.
Публикация
По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 8І страницах машинописного текста и состоит из введения, -литературного обзора, материалов и методов, результатов работы и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 41 рисунками и содержит 2 таблицы. Список литературы содержит 111 источников зарубежных и отечественных авторов.