Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на то, что сформулированы общие принципы взаимодействия глюкокортикоидов с тройными тканями, многие механизмы ответа клеток-мишеней на воздействие стероидного гормонального стимула остаются недостаточно изученными. Согласно общепринятым представлениям липофильные молекулы стероида проникают в клетку, где связываются с внутриклеточными рецепторами / Lan et аХ,1984/. Гормонрецепторные комплексы подвергаются сложной конформационной перестройке, в результате чего приобретают повышенное сродство к ядерным связывающим участкам. С точки зрения множественности акцепторных центров в клетках-мишенях такими"участками могут быть, кроме хроматина, ядерная оболочка /Smith and von Holt, 1981 / и ядерный матриксДігзсп et ai.1986 /, а также рибонуклеопротеидные частицы, содержащиеся как В ядре, так и В цитоплазме /Rossini,1984; Eoonomidis and Rousseau,1985 /. По-видимому, глюкокортикоидрецепторныв комплексы (ГРК) способны связываться с различными ядерными компонентами одновременно или последовательно, регулируя экспрессию генов на разных ее этапах.
Выяснению некоторых сторон процесса взаимодействия ГРК с субъядерными фракциями клеток Печени крыс и посвящена основная часть нашей работы. Кроме того, представлялось важным изучить особенности связывания ГРК с ядерными структурами при старении организма и воздействии на него такого повреждающего фактора как ионизирующее излучение. Выбор именно этих условий определялся прежде всего той важной ролью, которая отводится глюкокортико-идным гормонам в реализации процессов, протекающих при старении и пострадиационном восстановлении функций организма. В частности, имеющиеся в нашем распоряжении данные указывают на то, что механизмы действия кортикостероидов в. гормончувствительнях тканях претерпевают значительные изменения при старении /Г.Л.Лукша, Б.Ф.Ванюшин,1984; Konoplya et ai,i986 ; Г.Н.Фильченков и др., 1991/. Однако, следует заметить, что при этом рассматривались в основном начальные циторецепторные этапы взаимодействия гормонов с клетками-мишенями, либо общее связывание глюкокортикоид-ных рецепторов с ядрами или хроматином. В нашей работе предпринята попытка сравнительного анализа взаимодействия ГРК с раз-
личными субъядерными фракциями клеток печени крыс - одного из основных органов-мишеней для глюкокортикоидных гормонов.
G другой стороны, показана существенная роль гормонов коры надпочечников в протекании пострадиационных процессов в организме /Г.А.Докшина, 1984/. К сожалению в литературе практически отсутствуют данные об особенностях взаимодействия ГРК с ядерными структурами при действии ионизирующего излучения в относительно малых и сублетальных дозах. Тем не менее, в последнее время получает распространение так называемый рецептороло-гический подход к исследованию радиационных повреждений, при котором различным рецепторним системам клетки отводится ключевая роль в реализации как краткосрочных, так и отдаленных адаптивных изменений метаболизма органов и тканей с разной радиочувствительностью /А.С.Соболев, 1989/. В связи с этим становится очевидной значимость изучения функционирования глюкокортикоидных рецепторов в условиях лучевой болезни для понимания первичных механизмов радиационного воздействия на организм.
Цель и задали г следования. Целью настоящей работы явилось изучение характера и степени взаимодействия ГРК с различными ядерными структурами клеток печени крыс, а также влияние на эти процессы старения и однократного внешнего облучения организма. В ходе исследований предполагалось последовательна решать следующие задачи:
-
Охарактеризовать связывание ГРК с высокоактивной и потенциально активной фракциями хроматина печени крыс.
-
Провести анализ связывания частично очищенных и цитозоль-ных ГРК с нехроматиновыми компонентами ядер печени крыс, а именно, ядерным матриксом, ядерной оболочкой и рибонуклеопротеидными частицами.
-
Оценить влияние старения на процесс взаимбдействия ГРК со связывающими участками в исследуемых ядерных фракциях.
-
Изучить способность к связыванию ГРК хроматином, ядерным матрикоом, ядерной оболочкой клеток печени крыс в различные сроки после острого гамма-облучения организма.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований показано, что коровые структуры ядра или ядерный матрикс являются важным участком взаимодействия ГРК с клеткой-мишенью. Определены параметры этого взаимодействия, кроме того, обнаружены ре-
цепторы глюкокортикоидов с умеренным сродством, устойчивые к . обработке нуклеазами и экстракции солью. Впервые показана возможность высокоаффинного взаимодействия ГРК с гетерогенными по размерам рибонуклеопротеидными частицами, содержащимися в нук-леоплазме.
Новыми являются данные по возрастным особенностям взаимодействия ГРК с отдельными ядерными структурами клеток печени 'крыс. Установлено, что при старении снижается величина связывания активированных глюкокортикоидных рецепторов с ядерной оболочкой и ядерным матриксом, причем это снижение обусловлено взаимным влиянием факторов как цитозольного, так и ядерного происхождения.
Анализ связывания ГРК с ядерными компонентами клеток печени облученных крыс позволил придти к заключению, что в течение 1-3 суток после облучения снижается способность мембранных структур ядерной облочки удерживать трансформированные рецеп-торные комплексы. С другой стороны, к отдаленным последствиям острого гамма-облучения в нелетальных дозах можно отнести увеличение уровня связывания ГРК с потенциально активными доменами хроматина.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о клеточных механизмах действия стероидных гормонов. Результаты сравнительного анализа роли отдельных ядерных компонентов в акцепции ГРК позволяют характеризовать ядерную оболочку, ядерный матрикс и рибонуклеопротеид-(РНП)-содержащую фракцию как потенциальные участки контроля генной экспрессии у эукариот со стороны стероидных гормонов, данные по снижению степени взаимодействия трансформированных цитозольных глюкокортикоидных рецепторов с остаточными ядерными структурами при старении представляют практический интерес для понимания процесса возрастной эндокринной перестройки. Кроме того, в работе раскрываются особенности взаимодействия ГРК с ядерными структурам клеток-мишеней в различные сроки после острого внешнего гамма-облучения в относительно малых дозах, что весьма важно при оценке ранних и отдаленных последствий воздействия ионизирующего излучения на организм.
Положения выносимые на защиту.
I. Остаточные структуры ядра (ядерный матрикс и ядерная обо-
лочка), а также РНП-фракция наряду с хроматином являются важными участками взаимодействия ГРК с ядрами клеток печени.
-
Старение организма сопровождается снижением способности ядерного матрикса и ядерной оболочки удерживать цитозольные ГРК.
-
Острое тотальное гамма-облучение в нелетальных дозах вызывает снижение величины связывания ГРК с ядерной оболочкой в первые дни после радиационного воздействия.. Отдаленные эффекты облучения проявляются в увеличении степени взаимодействия глюкокор-тикоидных рецепторов с потенциально активной фракцией хроматина.
Публикации и апробация работы. Результаты исследований опубликованы в II научных работах, доложены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза" (Харьков,1987), 5-м Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси,1988), 1-м Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва,1989), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн,1990).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на v0 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 4 глав экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 5 таблицами,