Введение к работе
Актуальность проблемы. Производные олигонуклеотидов и экспрессирующие генетические конструкции являются перспективным новым классом потенциальных химиотерапевтических препаратов. Создание уникальных терапевтических препаратов на основе олигонуклеотидов, способных высокоселективно ингибировать экспрессию генов за счет комплементарных взаимодействий, становится все более реальным в связи с разработкой и синтезом новых производных, обладающих повышенной устойчивостью к действию нуклеаз и способных проникать через гидрофобные мембраны. Способность генноинженерных конструкций экспрессировать в клетках организма чужеродные белки, вероятно, позволит создавать генноинженерные вакцины для защиты организма от инфекционных заболеваний.
Необходимым этапом на пути терапевтического использования
олигонуклеотидов является разработка методов доставки олигонуклеотидов в
организм. Неповреждающие способы доставки терапевтических препаратов в
настоящее время рассматриваются как наиболее перспективные. Было
показано, что перокулярный и пероральный способы введения
олигонуклеотидов обеспечивают эффективную системную доставку
олигонуклеотидов в организм. Исследование фармакокинетики олигонуклеотидов в организме показало, что олигонуклеотиды и продукты их деградации распределяются через кровоток. В экспериментах in vitro продемонстрировано, что олигонуклеотиды образуют комплексы с некоторыми белками сыворотки крови и поверхностными белками клеток. Получены данные о возможном участии белков в транспорте олигонуклеотидов в клетки и органы. Исследование стабильности олигонуклеотидов и их взаимодействий с биополимерами крови и барьерных жидкостей является актуальным, поскольку позволит разработать подходы к использованию естественных механизмов транспорта нуклеиновых кислот для более эффективной доставки препаратов и предотвращению нежелательных побочных эффектов.
Проведенные в последнее время исследования обнаружили некоторые биологические эффекты, вызываемые олигонуклеотидами, которые не могут быть объяснены комплементарным взаимодействием с мишенью. Обнаружено, что при введении в организм фосфоротиоатные аналоги олигонуклеотидов вызывают изменение сердечного ритма и артериального давления, увеличение веса печени, почек, сердца и модуляцию гемопоэза у обезьян. Обнаружена способность бактериальной ДНК и некоторых олигонуклеотидов активировать клетки иммунной системы. Выявлены факты взаимодействия олигонуклеотидов с белками лимфоидных клеток, которые могут опосредовать неспецифические эффекты нуклеиновых кислот. В связи с этим представляется
актуальным исследовать белки лимфоцитов, взаимодействующие с ДНК, олигонуклеотидами и их аналогами, а также механизмы иммуномодулирующего действия нуклеиновых кислот. Изучение механизмов олигонуклеотид-белковых взаимодействий и их влияния на клеточные функции обеспечит базу для конструирования терапевтических препаратов на основе олигонуклеотидов и их аналогов, не обладающих побочными эффектами. Цель работы. Целью представляемой работы было, во-первых, исследовать стабильность олигонуклеотидов в барьерных жидкостях, выявить белки барьерных жидкостей, взаимодействующие с олигонуклеотидами, оценить сродство олигонуклеотидов и их производных к белкам, что необходимо для понимания процессов транспорта олигонуклеотидов и разработки подходов к оптимизации процесса доставки нуклеиновых кислот. Второй задачей настоящей работы было исследование сохранности олигонуклеотидов и их аналогов в крови in vivo, а также взаимодействий олигонуклеотидов и продуктов их деградации с белковыми и клеточными компонентами крови in vivo. Третьей задачей настоящей работы было исследование стимулирующих свойств плазмидной ДНК и олигонуклеотидов в модели пролиферации первичной культуры лимфоцитов селезенки, исследование механизмов иммуностимулирующего действия нуклеиновых кислот, выявление белков спленоцитов, принимающих участие в связывании нуклеиновых кислот. Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей 'диссертационной работе впервые показано, что фосфодиэфирные олигонуклеотиды в течение длительного времени сохраняются недеградированными в слюнной и слезной жидкостях. Установлено, что олигонуклеотиды взаимодействуют с белками барьерных жидкостей: лизоцимом, лактоферрином и иммуноглобулинами классов А и G. Данные о высокой сохранности олигонуклеотидов в барьерных жидкостях имеют практическую значимость, так как демонстрируют возможность высокоэффективного использования олигонуклеотидов для борьбы с вирусными инфекциями ротовой полости и глазного мешка.
Впервые проведен сравнительный анализ стабильности и взаимодействий в крови фосфодиэфирных олигонуклеотидов и олигонуклеотидов с двумя фосфоротиоатными группами на 3'-конце молекулы. Было впервые показано, что короткие фрагменты олигонуклеотидов и мононуклеотиды практически необратимо накапливаются в эритроцитарной фракции. Обнаружено, что альбумин и иммуноглобулины крови связывают олигонуклеотиды in vivo, причем олигонуклеотид-белковые комплексы длительно рециркулируют в организме и частично защищают олигонуклеотиды от действия нуклеаз.
Обнаружено, что плазмвдная ДНК и олигонуклеотид d(pGAAGGGAGGA) активируют пролиферацию первичной культуры лимфоцитов селезенки. Исследование комитогенной стимуляции лимфоцитов известными митогенами и ДНК, а также конкурентного ингибирования стимулирующего эффекта ДНК Fab фрагментами анти-Ig антител показало, что иммуноглобулиновые рецепторы участвуют в ДНК-индуцируемой активации пролиферации спленоцитов. Среди мембранно-цитозольных белков лимфоцитов, специфично взаимодействующих с олигонуклеотидами, выявлены полипептиды с молекулярной массой 72, 67 и 25 кДа, соответствующие по молекулярной массе полипептидным цепям IgM и IgD.
Продемонстрировано, что обработка полиэтиленимином нуклеиновых кислот, обладающих иммуностимулирующими свойствами, ингибирует способность олигонуклеотидов и ДНК активировать пролиферацию спленоцитов, что важно не только для подтверждения рецептор-опосредованного механизма активации под действием нуклеиновых кислот, но имеет практическое значение для ген-направленной терапии. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Материалы диссертации были доложены на двух международных конференциях.
Структура и обьём работы. Диссертация изложена на 146 страницах, включающих 22 рисунка, 3 таблицы. Список литературы включает 198 работ. Диссертационная работа состоит из следующих разделов : введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы.
