Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Аналитический обзор литературы 13
1.1.Теоретико-методологические основы использования липазы в системе технологического контроля и химико-экологического мониторинга 13
1.2. Физико-химические и антропогенные факторы, влияющие на активность липазы 18
1.3.Биотехнологические аспекты получения ферментных препаратов липазы 34
1.4. Химико-технологические особенности определения токсичных элементов в растительном сырье с высоким содержанием масла 36
Глава 2 Организация, объекты и методы исследования 43
2.1. Организация и схема экспериментальных исследований 43
2.2. Характеристика объектов исследования 44
2.3. Общие методы исследований 45
2.4. Специальные методы исследования 46
2.5. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований 55
Глава 3. Влияние регламентируемых физико-химических показателей на активность липазы семян подсолнечника «in situ» 56
3.1 Влияние регламентируемых физико-химических показателей на активность липазы семян подсолнечника 56
3.2 Влияние моноконтаминации разными концентрациями токсичных элементов на активность липазы семян подсолнечника in situ. 62
3.3 Динамика изменения активности липазы семян подсолнечника in situ при ди-, три- и тетраконтаминации токсичными элементами 68
Глава 4. Разработка и апробация экспресс-метода определения содержания токсичных элементов по изменению активности собственной липазы в семенах подсолнечника (АСЛ-метод) 75
4.1 Активность липазы, как показатель высокого качества и безопасности семян подсолнечника 75
4.2 Разработка и апробация АСЛ-метода определения токсичных элементов в семенах подсолнечника 80
4.3 Оценка значимости результатов АСЛ-метода и установление его аналитических характеристик 83
4.4 Разработка и апробация способа дробной минерализации растительного сырья с высоким содержанием масла для ААС-анализа 88
4.5 Верификация способа дробной минерализации методом добавок 92
Глава 5 Разработка технологии получения геммульного препарата липазы и экспресс-метода определения токсичных элементов в растительных маслах по изменению его активности (АГЛ-метод) 97
5.1.Технологическая схема получения препарата геммульной липазы из семян подсолнечника 97
5.2.Установление рН-оптимума и температурного оптимума активности ферментного препарата геммульной липазы 103
5.3.Разработка схемы получения ферментного препарата геммульной липазы из семян подсолнечника 105
5.4.Влияние содержания токсичных элементов в растительных маслах на активность ферментного препарата геммульной липазы 108
5.5.Зависимость активности геммульного препарата липазы от суммарного содержания токсичных элементов в растительном масле 112
5.6. Разработка и апробация тест-набора «Геммульная липаза на основе АГЛ-метода определения токсичных элементов в растительных маслах 117
Выводы и рекомендации 122
Библиографический список 124
Список сокращений 152
Приложения 154
- Физико-химические и антропогенные факторы, влияющие на активность липазы
- Влияние регламентируемых физико-химических показателей на активность липазы семян подсолнечника
- Оценка значимости результатов АСЛ-метода и установление его аналитических характеристик
- Разработка и апробация тест-набора «Геммульная липаза на основе АГЛ-метода определения токсичных элементов в растительных маслах
Введение к работе
Актуальность темы. Одним из приоритетных направлений и перспектив научно-технического развития Российской Федерации на ближайшие 10-15 лет, является переход к высокопродуктивному и экологически чистому агрохозяйству, а также создание безопасных и качественных продуктов питания (в соответствии с Указом Президента РФ от 01.12.2016 г № 642, раздел 20, п. «г»). Достижение поставленных целей требует разработки и внедрения комплекса инновационных аналитических и биотехнологических методов анализа, в том числе экспрессных, повышающих эффективность контроля экологической чистоты и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.
Исследования в области пищевой экологии показывают, что
приоритетными загрязнителями сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов являются тяжелые металлы, которые в течение длительного времени сохраняют свое токсическое влияние, как на растения, приводя к ингибированию активности ряда ферментов (Шеховцова Т.Н., 2015; Горюнова, С. В., 2014), так и на человека, накапливаясь в организме и вызывая серьёзные нарушения в функционировании органов и систем (Гильмундинов, В. М., 2013). При этом актуальным является не только обнаружение проб с превышением установленных нормативов по отдельным химическим элементам, но и их суммарного содержания, в связи с возможностью синергетического и аддитивного ингибирующего действия (Цикуниб А.Д., 2012; Сырков А.Г., 2015).
Для определения тяжелых металлов в пищевых продуктах широко
используются современные инструментальные аналитические методы, в том
числе инверсионно-вольтамперометрический, атомно-абсорбционный, атомно-
эмиссионный и другие, отличающиеся высокой чувствительностью, но
требующие специализированного дорогостоящего оборудования,
квалифицированного персонала и длительной пробоподготовки (Мугинова С.В., 2010; Голубятников, Н. И. 2013). В то же время, в последние годы, наряду с указанными методами, разрабатываются и внедряются энзиматические, основанные на ингибирующем действии токсичных элементов на активность ферментов (Яблоцкий, К.В. 2010; Lai C-Y (Kevin) 2017), преимуществами которых являются селективность и чувствительность, что обуславливает перспективу их использования для целей химико-экологического мониторинга и технологического контроля (Родионов П.В. Веселова И. А. и др. 2013). Так, в практике экологического мониторинга воды, воздуха и почв уже применяются пероксидазы для определения Hg (II), Cd (II), Bi (III), дегидрогеназы - Ag (I) и Hg (II), уреазы - Hg, Pb, Cd, Zn, Ag (Muginova S. V. 2013, Бездудная Е.Ф. 2009, Швакова Э. В. 2013; Шадьяров, Ш. Р. 2014), вместе с тем, практически не разработанными остаются ферментативные методы для оценки содержания
токсичных элементов в сельскохозяйственном сырье и пищевых продуктах, что связано, в первую очередь, с аналитическими сложностями в определении металлов в многокомпонентных матрицах, в особенности, жиросодержащих. В этой связи перспективным является внедрение в практику элементного анализа масличных семян и растительных масел ферментов липолитического действия (Шнайдер К.Л., 2014; Chepyshko H.,2012), в частности липазы, способной специфически взаимодействовать с ионами тяжелых металлов и формировать аналитический сигнал в ответ на действие токсикантов. Однако широкое практическое применение ферментов, в том числе липазы, в аналитических целях сдерживают с одной стороны, сложности извлечения, иммобилизации и хранения с сохранением их функциональной активности и аналитической чувствительности на необходимом уровне (Неверова О.А., Цандекова О.Л. 2013), с другой - высокая стоимость существующих на сегодняшний день на рынке препаратов липазы, в основном, зарубежного производства и преимущественно животного или бактериального происхождения. Указанные факторы делают актуальным разработку ферментативных методов исследования безопасности масличного сырья и готовой продукции.
Степень разработанности темы
Научная информация об использовании ферментативных методов для целей химико-экологического мониторинга содержания токсичных элементов в различных объектах окружающей среды представлена в работах Даденко Е.В.(2013), Минникова Т.В..(2017), Макевнина С.В. (2016), Тазетдинова, Д. И. (2013) – в почве; Неверовой О.А. (2010)., Есимбековой Е. Н., Римацкой Н. В.(2013), Жигальский, О. А. (2014) - в воздухе; Павлюченко А. С., Кукла А. Л., Голтвянский Ю. В. (2010), Пашкова Е.В. (2016) – в воде; Мугиновой С.В., Веселовой И.А., Паровой Л.М., Шеховцовой (2008), Чупахина Г. Н. (2011), Тринеева, О. В. (2015), Зыкова, Ю. Н. (2011) - растительных объектах. Несмотря на разработки отечественных и зарубежных ученых, биотехнологический потенциал использования ферментов, в том числе липазы, для технологического контроля содержания токсичных элементов в продовольственном сырье и пищевых продуктах, реализуется не в полной мере из-за недостаточного научного обоснования новых методических и технических решений.
Цели и задачи исследования. Цель диссертационного исследования -использование ингибирования активности липазы в качестве биоаналитического сигнала для определения уровня содержания токсичных элементов в семенах подсолнечника и растительных маслах.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
установить влияние разных концентраций токсичных элементов и их сочетаний на динамику активности липазы семян подсолнечника, провести
ранжирование элементов по интенсивности ингибирующего действия на фермент в условиях in situ и in vitro;
выявить зависимости между активностью липазы семян подсолнечника с
исходным низким уровнем контаминации токсичными металлами (менее 0,25
ПДК по каждому элементу) и регламентируемыми показателями качества и
безопасности (влажностью, кислотным числом, масличной примесью,
количеством плесеней) при хранении в агрегированных условиях;
обосновать применение понятия «референтной величины» к активности липазы семян подсолнечника, имеющих по комплексу физико-химических показателей и показателей безопасности статус «высококачественные» и «экологически чистые», и разработать экспресс-метод оценки уровня контаминации токсичными элементами заготовляемых и поставляемых семян подсолнечника по изменению активности липазы in situ в сравнении с «референтной величиной» (АСЛ-метод);
установить биотехнологический потенциал ядер семян подсолнечника,
разработать технологию получения геммульного препарата липазы с
определенными физико-химическими характеристиками и тест-набор на его основе для оценки уровня контаминации растительных масел токсичными элементами (АГЛ-метод);
разработать способ дробной минерализации высокомасличного
растительного сырья для атомно-абсорбционного анализа;
разработать методические рекомендации по определению токсичных
элементов в семенах масличных культур и растительных маслах
ферментативными методами и техническую документацию на производство тест-набора «Геммульная липаза», провести лабораторную апробацию и рассчитать экономическую эффективность предлагаемых технических решений.
Научная новизна
Получены новые научные данные об интенсивности ингибирующего действия токсичных элементов на липазу семян подсолнечника в условиях in situ и in vitro при моно-, ди-, три-, и тетраконтаминации солями нормируемых металлов. Экстраполяция понятия «референтной величины» из предметной области клинической биохимии применительно к активности липазы, позволяющая охарактеризовать семена с позиции экологической чистоты и высокого качества, легла в основу разработки АСЛ-метода определения уровня контаминации токсичными элементами семян подсолнечника.
На основании углубленного изучения физико-химических свойств и
морфофункциональных особенностей распределения липазы семян
подсолнечника разработана технологическая схема получения ферментного препарата из геммульной части ядер семян подсолнечника, обладающего
выраженной липолитической активностью, в сравнении с препаратом из семядолей.
Установлены качественные характеристики полученного геммульного препарата липазы оптимальные значения рН 5,0 и температуры 37 С.
Метрологические и аналитические характеристики ферментативных АСЛ- и АГЛ-методов позволяют использовать их для целей технохимического контроля и химико-экологического мониторинга содержания токсичных элементов в масличном сырье и растительных маслах. Разработанные методы расширяют методологическую базу биотехнологии как науки.
Дробная минерализация высокомасличного растительного сырья,
предполагающая разложение пробы на жировую и обезжиренную фракции, для определения токсичных элементов методом ААС с электротермической атомизацией позволяет существенно сократить время пробоподготовки, а также дает возможность улучшить метрологические характеристики метода.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные научные результаты и теоретические положения расширяют знания в области биотехнологического потенциала использования ферментных методов для целей технологического контроля и химико-экологического мониторинга содержания токсичных элементов в масличном сырье и растительных маслах.
Дополнены научные данные об ингибирующем действии металлов на активность растительной липазы. Установлена корреляционная зависимость между активностью липазы и физико-химическими показателями - влажностью, масличной примесью и кислотным числом семян подсолнечника не содержащих токсичных элементов.
Разработанный АСЛ-метод определения уровня токсичных элементов в семенах подсолнечника с применением понятия «референтная величина» к активности липазы in situ позволил проводить экспресс-анализ уровня загрязнения токсичными элементами сельскохозяйственной продукции в период массовой заготовки семян, без привлечения сложного, дорогостоящего оборудования. Адаптирована система математической оценки аналитических критериев лабораторного теста, используемая в клинико-лабораторной диагностике, применительно к разработанному ферментативному АСЛ-методу определения содержания токсичных элементов в масличном сырье.
«Геммульный препарат липазы» из семян подсолнечника расширяет ассортимент отечественных ферментных препаратов.
Разработан пакет документов, включающий технические условия «Препарат липазы из семян масличных культур «Геммульная липаза» и методические рекомендации «АСЛ-метод. Определение уровня контаминации токсичными
элементами семян подсолнечника по динамике активности собственной липазы» и «АГЛ-метод. Определение уровня токсичных элементов в растительных маслах на основе активности геммульного препарата липазы». Практическая значимость разработанных методов подтверждена результатами апробации и внедрения в практику производственных и исследовательских лабораторий ООО НПП «Форт» и ИЦ ФГБОУ ВО «Кубанский государственный технологический университет» г. Краснодар.
Применение в аналитических лабораториях усовершенствованного метода пробоподготовки семян подсолнечника, позволит сократить время минерализации и повысить метрологические характеристики атомно-абсорбционного метода определения тяжелых металлов. Научная новизна технического решения подтверждена патентом РФ (№ 2645995, от 28.02.2018).
Работа выполнена в рамках госбюджетной НИР лаборатории
нутрициологии и экологии НИИ Комплексных проблем АГУ по теме «Эколого-
гигиенические и химико-аналитические проблемы обеспечения
продовольственной безопасности» (2015-2017 гг.), программы Министерства
образования и науки РФ «Развитие инфраструктуры ботанических садов как
уникальных объектов высших учебных заведений» (2017-2018 гг), а также при
поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-
технической сфере по программе «УМНИК» по теме «Разработка
ферментативного скринингового тест-набора для оценки уровня содержания
токсичных элементов в растительных маслах» в рамках договора № 0039927от 8
февраля 2018 г».
Методология и методы диссертационного исследования
Основой диссертационного исследования послужило обобщение
информации и анализ накопленного опыта разработки и применения ферментных технологий в области биотехнологии, а также комплекс инструментальных и специальных методов. Исследования опирались на комплекс научных идей, фундаментальных положений и методологических подходов аналитической химии, биохимии растений, биотехнологии и клинической биохимии, основанных на: возможности использования ферментов, в определении тяжелых металлов в объектах окружающей среды (Гончарук А.С. 2012; С.В. Мугинова, И.А. Веселова, Т. Н. Шеховцова, 2008; Валова, Е. Э. 2012); денатурирующем действии тяжелых металлов на активность SH-содержащих ферментов, к которым относится липаза (Леонтьев В.Н., 2014); значении определения активности ферментов в клинико-лабораторной диагностике состояния живых организмов (Меньшиков, В.В.,2011; Недугов Г.В.,2009).
Погрешности измерений не превышали определенных значений в действующих государственных стандартах.
Научные положения, выносимые на защиту:
- закономерности влияния разных концентраций и сочетаний токсичных
элементов на активность липазы семян подсолнечника в условиях in situ и in vitro;
- «референтная величина» активности липазы как биотехнологический
показатель высокого качества и безопасности семян подсолнечника;
- технология получения и физико-химическая характеристика геммульного
препарата липазы из семян подсолнечника;
- ферментативные экспресс-методы определения токсичных элементов в
семенах подсолнечника и растительных маслах на основе липазы;
- способ дробной минерализации масличного сырья для атомно-
абсорбционного электротермического анализа.
Степень достоверности, апробация и публикация результатов
Достоверность результатов проведенных научных исследований основана на углубленном анализе литературных источников по тематике диссертационной работы; постановке экспериментальных работ на соответствующем методическом уровне, с использованием современных инструментальных методов; применении принципов математической статистики при обработке экспериментальных данных; апробации результатов в лабораторных условиях.
Ключевые результаты диссертационного исследования доложены и
обсуждены на международных, всероссийских, в том числе внутривузовских
конференциях в период с 2015 по 2018 гг.: на IV Международном конкурсе
научно-исследовательских работ «Перспективы науки - 2016»; International
Scientific Conference «Тechnical and natural sciences» Themed collection of papers
from international conferences by HNRI «National development» (2016г); VIII
Международной научно-практической конференции «Современные тенденции
развития науки и технологий» (2015 г); YOUNG ELPIT-2015. Международном
инновационном форуме молодых ученых в рамках V международного
экологического конгресса (VII международной научно-технической конференции)
"Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных
комплексов" (2015 г); II Всероссийской конференции по аналитической
спектроскопии с международным участием (2015 г); Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Экология: рациональное
природопользование и безопасность жизнедеятельности» (2017 г);
Межрегиональной молодежной научно-технической конференции «НАУКА И
МОЛОДЕЖЬ» в рамках форума «ИННОВАЦИОННАЯ КАЛМЫКИЯ»
финальный отбор программы «УМНИК-2017»; Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии и безопасность пищевых продуктов» (2018 г.).
Результаты докладов отмечены дипломами и сертификатами.
Соответствие диссертации паспорту специальности Диссертация соответствует пунктам 4, 14, 15 паспорта специальности 05.18.07 – «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».
Публикации результатов работы:
По материалам выполненных исследований опубликовано 16 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, патент РФ -1.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, основных выводов и результатов, списка литературы из 218 наименований, в том числе 40 на иностранных языках, объемом 189 страниц машинописного текста, содержит 30 рисунков и 27 таблиц.
Физико-химические и антропогенные факторы, влияющие на активность липазы
В современных условиях, в связи возрастающим уровнем загрязнения экотоксикантами биосферы (воздух, вода, почва), а также активным внедрением пищевой химии в технологический процесс — производство и потребление пищевых продуктов характеризуется двумя взаимно противоположными тенденциями: с одной стороны, происходит снижение качества и безопасности пищевых продуктов [1, 45, 68 129, 136, 143], с другой - растет спрос со стороны потребителей на натуральную, экологически чистую и безопасную пищу [68, 71, 99, 106, 114]. Однако, на сегодняшний день, нет стандартизованных показателей, комплексно и интегрально характеризующих сырье, как экологически чистое и высококачественное. В этой связи, становится актуальным поиск и разработка объективных физико-химических методов исследования, позволяющих оценить пищевые продукты и сырье с точки зрения экологичности и высокого качества [130].
Масличные культуры, в том числе подсолнечник, являются распространенными и возделываемыми в нашей стране, играющими важную роль, как в мировой, так и в национальной экономике [72, 132]. В Европе сосредоточено более 70% площадей, на которых возделывается подсолнечник, при этом на долю России приходится более 57% мирового производства семян и 69% подсолнечного масла. При этом основной тенденцией в международной торговле становится переход от продажи растительного масла к продаже семян, на которые значительно возрос спрос на мировом рынке [7, 10, 11, 15, 89, 94, 96, 155].
Особую роль в формировании и изменении качества масличных семян и извлекаемых из них масел играет ферментный комплекс [81]. Наиболее важными с точки зрения влияния на качество получаемой продукции являются гидролитические процессы, которые происходят под действием фермента липазы.
Липаза (классификационный номер КФ3.1.1.3) широко встречается у животных, растений и микроорганизмов [95, 96, 99, 139, 159]. Установлено, что большинство липолитических ферментов в своем активном центре содержат сериновую триаду Ser-Gis-Asp (рисунок 1).
Некоторые авторы (Canaan S. et al.,1999 и Gargouri Y. et al.,1989) отмечают участие сульфгидрильных групп в акте катализа, однако единого мнения о их расположении в молекуле нет: находятся SH-группы в составе активного центра или вблизи него, в участке ответственном за гидрофобное связывание фермента с поверхностью раздела [59]. В настоящее время определено, что нуклеофильная атака на карбонильный углерод эфирной связи осуществляется остатком серина, активизированным через сеть водородных связей с имидазольной группой гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислотами [160]. В работе Трофимовой О.Д. отмечено, что в активных центрах гидролитических ферментов -COOH группы могут служить местом прикрепления к субстрату или вызывая электронные смещения путем образования водородных связей, или осуществлять кислотно-основный катализ, оказывая влияние на полярность связей соседних с ними групп фермент-субстратного комплекса [4, 55, 156].
Установлено, что липаза может активироваться ионами Ca2+, входящими в состав Ca2+- связывающего домена, поддерживающего каталитически активную конформацию фермента [6, 48, 96]. Также влияние на функциональные свойства липазы могут оказывать ионы таких металлов как: Mg2+, Na+, K+, Sr2+ [18, 139], что может быть связано как с конформационными изменениями, возникающими в молекуле энзима при соединении металлов, так и с образования солей жирных кислот, которые таким образом предотвращают ингибирование, продуктами реакции, удаляя продукты гидролиза из реакционной среды [6]. В ряде работ [83, 84, 161, 144] отмечается, что низкие концентрации Co2+, Ni2+, Sn2+, Fe2+, Fe3+, Ag+ могут выступать в качестве активаторов липазы.
Характерной особенностью гидролитических ферментов, в том числе липаз, можно назвать уникальные физико-химические условия катализируемых ими реакций [17, 66, 65, 145]. Процесс катализа происходит на поверхности раздела фаз, фермент катализирует расщепление эфиров ненасыщенных и насыщенных алифатических кислот, с не менее чем 12 атомами углерода в цепи и способен катализировать не только гидролиз, но и обратные реакции трансэтерификации, этерификации, ацидолиза и алкоголиза [158, 170] (рисунок 2). Установлено [4, 6, 17], что чем выше степень деспергирования субстрата, тем быстрее идет липолиз. Вероятно, это связано с явлением сорбции фермента на поверхности субстрата. Считается, что именно этот процесс является первым актом ферментативного липолиза, который описывается следующим образом:
По мнению ряда авторов [56, 59, 95], активный центр липаз можно разделить на три участка, имеющих функциональные различия: первый — контактный, ответственный за идентификацию поверхности субстратной фазы; второй – гидрофобный связывающий участок, осуществляющий извлечение одной молекулы субстрата из субстратной фазы в глобулу фермента; третий – образованный группами, инициирующий каталитический акт гидролиза сложноэфирной связи [61, 133] (рисунок 3).
Липаза также, способна гидролизовать как природные, так и синтетические субстраты с различной структурой [6, 122, 158]. Некоторые авторы [48, 59, 159] в качестве особенностей липазы выделяют ее поверхностную активацию, т.е. резкое увеличение активации при концентрации субстрата, превышающей предел ее растворимости.
Сам термин «липолитическая активность» семян масличных культур в научной литературе трактуется по-разному. Большинство авторов [174] под этим термином понимают активность триацилглицероллипазы (ТАГ-липазы) -фермента, относящегося к группе эстераз, подвергающего гидролизу эфиры глицерина и жирных кислот. В то же время, другие авторы термином «липолитическая активность» обозначают общую липолтическую активность, т.е. действие ТАГ-липазы и фосфолипазы [154]. ТАГ-липаза нерастворима в воде и по своей природе является липопротеином с гидрофильно–гидрофобными группами, которые способны действовать на границе раздела фаз вода–липиды, то есть фермент взаимодействует как с полярными, так и неполярными молекулами. Взаимодействие с последними может вызвать конформационные изменения в структуре фермента, повышая его каталитическую активность. Активация липазы происходит только на поверхности гидрофобного метасубстрата [61, 95]. Конформация фермента изменяется в процессе связывания с этим субстратом, и полипептидный участок, сдвигаясь в сторону, открывает доступ молекулам субстрата к активному центру [61, 96]. От гомогенности субстрата напрямую зависит скорость липолиза, что многие авторы связывают с явлением абсорбции фермента на поверхности субстрата [81]. Полный гидролиз осуществляется тремя липазами (рисунок 4).
Влияние регламентируемых физико-химических показателей на активность липазы семян подсолнечника
Основными стандартизованными показателями, определяющими качество масличного сырья, являются - влажность, масличная примесь кислотное число. Нормативными документами предусмотрены следующие влажностные состояния семян: средней сухости – 7,1-8,0%, влажные 8,1-9,0% и сырые – 9,1% и более [28]. Базисным нормативом при хранении является – 7,0 % и менее такие семена относят к сухим, их можно закладывать на длительное хранение в зернохранилища без активного вентилирования при условии засоренности не более 2,0. Нормативными документами регламентируется также наличие сорной и масличной примесей, которые напрямую влияют на качество и сроки хранения семян за счет присутствия микроорганизмов, которые могут попасть еще на поле, при обрушивании и при хранении в неблагоприятных условиях, способствующих развитию микрофлоры. Так, при засорённости до 3,0% с влажностью более 9,0%, даже в условиях активного вентилирования масличное сырье может храниться не более месяца [122].
По данным [122, 123] масличная примесь более опасна, чем сорная, поскольку может служить благоприятной питательной средой для развития микрофлоры. Несмотря на многочисленные данные о влиянии влажности, масличной примеси и кислотного числа на качество семян, корреляционные зависимости между этими показателями и активностью липазы, в условиях отсутствия загрязняющих химических агентов (менее 0,25 ПДК каждого элемента), изучены недостаточно.
В семенах подсолнечника, содержащих токсичные элементы в количестве, не превышающем значений 0,25 ПДК, но имеющих различные уровни влажности и масличной примеси, согласно методике, описанной в главе 2, исследовали активность липазы при щелочном и кислом рН среды. Полученные результаты представлены в приложении А таблица .
К 18 дню экспозиции семян отмечались отдельные проявления начала процесса плесневения, в пробах с Вл2Мп3 по Вл4Мп4, а к 30 дню семена имели существенные видимые признаки порчи, кроме того наблюдалось значительное увеличение активности липазы, в сравнении с 20 днем, что может свидетельствовать об активизации процесса гидролиза под влиянием грибной микрофлоры. В связи с этим, пробы были сняты с экспозиции, а значения активности липазы на 30 день эксперимента не учитывали в дальнейшем, при установлении корреляционных зависимостей, как не отражающие активность собственной липазы семян.
Графический анализ полученных данных наглядно демонстрирует динамику изменения активности липазы при рН=8,0 в зависимости от влажности и масличной примеси (рисунок 7)
В течение первых двух дней хранения активность липазы в щелочной среде в пробах семян практически не изменилась, за исключением образцов с высокой влажностью (Вл3Мп3, Вл4Мп1, Вл4Мп2, Вл4Мп3). К 10 дню экспозиции наблюдалось увеличение активности в пробах семян с высоким процентом масличной примеси 5,0-7,5% и влажности 8,5-9,5%. К 20 дню увеличение липолитической активности в этих же пробах в сравнении с контрольными образцами составило в среднем от 9,2 до 24,5% и достигло максимальных значений от 18,4 до 48,0% на 30 день экспозиции. Такие изменения в опытных образцах могут быть связаны, с изменением физиологического состояния семян, так (по данным Гаманченко А.И., 1995 г) при старении семян подсолнечника увеличивается накопление в клетках щелочных соединений и аммиака, и как следствие растет рН, что приводит к усилению активности липазы [138]. Это подтверждает и тот факт, что в контрольных и сухих семенах (6,5%) семенах, также отмечался небольшой прирост активности фермента в течение всего срока хранения.
Динамика активности липазы при рН=4,7 среде существенно отличалась от щелочной (рисунок 8). В течение месяца хранения в семенах в пробах влажных и сырых семян (Вл3Мп3, Вл4Мп1, Вл4Мп2, Вл4Мп3) существенно изменялась активность липазы в кислой среде, в частности, чем выше процент масличной примеси, тем выше активность липазы. В образцах с влажностью 6,5% и масличной примесью от 2,5 до 7,5 % достоверного изменения в активности не произошло. Это может быть связано с тем, что в семенах с нарушенной оболочкой быстрее происходит проникновение воды и активация собственной липазы, а не с ростом микрофлоры, поскольку микологический пейзаж семян ко вторым суткам хранения практически не изменился (рисунок 9), т.е. споры плесневых грибов не успевают в течение двух дней прорасти и образовать гидролитически активный мицелий [3, 124].
На десятый день экспозиции, в сухих семенах с масличной примесью 7,5% отмечалось снижение активности липазы в кислой среде в среднем на 9,5%. Наибольшее снижение активности фермента в сравнении с контролем наблюдается во влажных и сырых образцах от 10,0 до 35,2%, чем выше процент масличной примеси, тем интенсивнее снижение активности фермента. На двадцатый день в семенах средней сухости и сухих, которые являются чистыми и средней чистоты по содержанию масличной примеси изменение активности липазы варьирует в пределах 10%. В пробах влажных и сырых семян Вл3Мп1, Вл3Мп2, Вл3Мп3, Вл4Мп1, Вл4Мп2, Вл4Мп3 произошло снижение активности липазы при рН=4,7 от 14,2 до 44,5%, что, по-видимому, связанно с высокими значениями кислотного числа, обусловленными увеличением количества свободных жирных кислот - продуктов реакции, подавляющих по принципу обратной связи активность липазы с одной стороны, с другой – снижением количества субстрата – нейтрального жира. В то же время, существенное снижение активности липазы в кислой среде, особенно во влажных условиях, происходит в процессе старения [79, 88]
Как отмечалось ранее, вместе со снижением активности липазы наблюдалось увеличение кислотного числа. На 10 день экспозиции наиболее высокие показатели КЧ - 2,7-3,5 мг КОН отмечены в пробах Вл2Мп3, Вл3Мп1, Вл3Мп2, Вл3Мп3, Вл4Мп1, Вл4Мп2, Вл4Мп3. Рост продолжался в последующие дни, и к 20 дню эксперимента КЧ возросло в 3,8-4,5 раза при влажности 8,5 и 9,5% соответственно.
Корреляционный анализ, представленный в таблице 5, подтверждает тесную взаимосвязь между кислотным числом, влажностью, масличной примесью и активностью липазы при рН=4,7.
Оценка значимости результатов АСЛ-метода и установление его аналитических характеристик
Возможность использования того или иного метода в качестве скринингового подтверждается его соответствием критериям достоверности. Наиболее разработаны эти критерии в системе клинико-лабораторной диагностике различных биохимических показателей, однако, эти же принципы в полной мере могут быть использованы и в других областях исследований. В связи с этим, мы попробовали экстраполировать ряд диагностических критериев достоверности скриннинговых методов клинико-лабораторной диагностики [78. 79] на биотехнологические методы оценки содержания токсичных элементов в растительных маслах и масличном сырье.
Основная идея статистического оценивания достоверности скрининговых тестов заключается в идентификации аналитического сигнала, отличающегося от нормы (оптимума). Все результаты проведенных анализов распределяли на положительные (Р+) и отрицательные (Р-), в свою очередь их делили еще на 2 варианта: ложноположительные (ЛПР), истинно положительные (ИПР), ложноотрицательные (ЛОР) и истинно отрицательные (ИОР). В нашем случае, для оценки достоверности скринингового АСЛ-метода определения уровня содержания токсичных элементов в семенах масличных культур результаты трактовали следующим образом:
ИПР – это результаты анализа пробы, в которых тест показал положительную активность фермента на уровне максимальных значений референтной величины, при этом по результатам ААС анализа токсичные элементы в них отсутствуют или содержатся в концентрации менее 0,5 ПДК.
ЛПР – результаты анализа пробы, в которых активность фермента оказалась на высоком уровне, близком к значению референтной величины активности, однако по результатам ААС анализа содержание токсичных элементов оказалось более 0,5 ПДК.
ИОР – пробы, в которых произошло снижение активности фермента от 30% и более, в сравнении с референтной величиной, при этом определенное ААС методом содержание токсичных элементов более 0,5 ПДК.
ЛОР – пробы, в которых произошло снижение активности фермента от 30%, и более в сравнении с референтной величиной, при этом ААС анализ показал отсутствие или содержание токсичных элементов менее 0,5 ПДК.
Далее, в качестве характеристик аналитической значимости АСЛ-метода определения содержания тяжелых металлов в семенах подсолнечника использовали следующие критерии:
Аналитическая чувствительность - доля (%) положительных результатов анализа в пробах, т.е. не загрязненных или содержащих токсичные элементы в концентрациях менее 0,5 ПДК (АЧ);
Аналитическая специфичность - доля (%) отрицательных результатов анализа в пробах, т.е. содержащих более 0,5 ПДК токсичных элементов (АС);
Предсказательная ценность отрицательного результата теста (ПЦ-) 85 вероятность того, что в пробе токсичные элементы содержатся в концентрациях более 0,5 ПДК, но активность фермента ниже референтной, т.е. отрицательный результат теста;
Предсказательная ценность положительного результата (ПЦ+) - вероятность того, что в пробе отсутствует токсичный элемент или содержится на уровне менее 0,5 ПДК и активность фермента соответствует референтному значению, т.е. положительный результат теста.
Для количественного определения значений перечисленных аналитических критериев использовали формулы, предложенные В.В. Меньшиковым [78].
Тесты с высокой аналитической специфичностью и предсказательной ценностью положительного результата могут быть использованы для осуществления количественного определения исследуемых показателей, а с высокой аналитической чувствительностью и предсказательной ценностью отрицательного результата — для скрининговых исследований. При этом аналитические характеристики считаются доверительными, когда аналитическая чувствительность и аналитическая специфичность теста не менее 80% [37, 93].
Для установления аналитических характеристик АСЛ-метода определения уровня содержания токсичных элементов в семенах подсолнечника оценку доли положительных и отрицательных результатов проводили в сравнении с референтной величиной активности липазы. Статистической оценке были подвергнуты значения активности липазы 73 проб семян подсолнечника, полученные ранее, результаты представлены в таблице 15.
При исследовании семян подсолнечника, контаминированных токсичными элементами, ИПР и ЛОР не выявлено, а в результатах, полученных на чистых семенах, отсутствуют ИОР и ЛПР. Используя полученные данные, рассчитана аналитическая значимость (чувствительность, специфичность, информативность и предсказательная ценность положительных и отрицательных результатов) определения уровня содержания токсичных элементов в семенах подсолнечника по АСЛ-методу.
Вероятность того, что в пробах, с содержанием токсичного элемента менее 0,5 ПДК, будет получен положительный результат теста (активность фермента на высоком уровне) свидетельствует аналитическая чувствительность, которая в нашем случае составила 86,2%. Найденное значение АЧ показывает, что положительный результат исследования, выявленный в 80,8% проб, свидетельствующий об отсутствии токсичных элементов, можно считать значимым, так как предсказательная ценность отрицательного результата теста -89,5%.
Аналитическая специфичность, характеризующая вероятность того, что в пробах, загрязненных токсичными элементами на уровне более 0,5 ПДК, будет получен отрицательный результат теста (снижение активности фермента) составила 77,3%, при этом предсказательная ценность положительного результата теста составляет 71,4%, т.е. семена, исследуемые на содержание токсичных элементов с высокой долей вероятности, не содержат их, или содержат в концентрации менее 0,5 ПДК. Однако полученных значений АС и ПЦ+ недостаточно для того, чтобы АСЛ-метод возможно было использовать для количественного определения элементов в пробе.
Сравнительный анализ результатов наглядно показывает, что АЧ и ПЦ-показывают более высокие значения в сравнении с АС и ПЦ+ (рисунок 19).
Разработка и апробация тест-набора «Геммульная липаза на основе АГЛ-метода определения токсичных элементов в растительных маслах
Проблемы контроля содержания токсичных элементов в растительных маслах, в первую очередь, заключаются в трудоемкости, дороговизне и длительности проведения инструментальных методов исследования [19]. На основании ранее полученных данных, был разработан и апробирован тест-набор «Геммульная липаза», включающий в себя полученный нами ферментный препарат из семян подсолнечника, с использованием АГЛ-метода, основанного на изменении активности геммульного препарата липазы. Схема проведения анализа включала в себя: установление оптимальной активности фермента на исследуемом типе масла, не содержащем нормируемые элементы в концентрациях более 0,25 ПДК по каждому; определение активности липазы в опытных образцах; сравнительный анализ полученных результатов с оптимальным значением. Оценку содержания токсичных элементов в пробе проводили следующим образом
Апробацию АГЛ-метода проводили на подсолнечном масле с исходно низким уровнем содержания тяжелых металлов (ртуть и мышьяк менее чувствительности ААС метода, кадмий, свинец и медь не более 0,25 ПДК каждого), активность фермента составила 38,5±2,8 10"3 мкмоль/мг мин. Из контрольного образа масла были приготовлены модельные образцы (п=39), которые были искусственно контаминированы солями свинца, ртути, меди, мышьяка и кадмия в пределах от 0,5 ПДК, но не более 1,0 ПДК, а также сочетаниями элементов Pb/Cd, Hg/Cd, As/Cd, Hg/Pb, As/Pb, Hg/As, Cu/Cd, Cu/Pb, Cu/As, Cu/Hg в количестве, соответствующем 0,5 ПДК каждого элемента.
Верификацию АГЛ-метода проводили сравнением с результатами, полученными методом ААС на атомно-абсорбционном спектрометре КВАНТ-Z.ЭТА с зеемановской коррекцией фона путем исследования указанных модельных образцов (п=39) и нативных проб подсолнечного масла (n=16). Анализ показал, что при содержании указанных элементов в концентрациях более 0,5 ПДК наблюдается достоверное (р0,05) снижение активности препарата геммульной липазы (таблица 25).
Как видно из таблицы, при моноконтаминации образцов интенсивность ингибирования фермента составила в среднем от 31,7% (при действии кадмия) до 65,2% (при действии ртути), т.е. содержание металлов от 0,5 ПДК до 1,0 ПДК. Липаза также чувствительно реагирует на присутствие в субстрате сочетаний токсичных элементов, с наибольшим ингибирующим эффектом действия для сочетаний Hg/Pb на уровне 77,1% и Hg/As - 92,7%, что в соответствии с разработанным методом оценки результатов анализа свидетельствует о наличии токсичных элементов в количестве близком 1,0 ПДК и более.
При исследовании нативных образцов активность ферментного препарата липазы колебалась в пределах от 34,0 10-3 мкмоль/мг мин до 39,5 10-3 мкмоль/мг мин со средним уровнем активности 36,3±1,1 10-3 мкмоль/мг мин, т.е. степень ингибирования фермента оказалась ниже 30%, что свидетельствует о низком уровне содержания токсичных элементов (менее 0,5 ПДК).
Сравнительный анализ АГЛ-метода и ААС основывался на методологии оценки диагностической значимости результатов аналитических лабораторных исследований, принятых в клинической биохимии: результаты делили на истинно положительные, истинно отрицательные, ложно положительные и ложно отрицательные. За положительные принимали пробы, в которых происходило снижение активности фермента, отрицательные – проявляли высокий уровень активности. За положительные принимали пробы, в которых происходило снижение активности фермента, отрицательные – проявляли высокий уровень активности (таблица 26).
Анализ результатов показал, что 89,1% проб, исследованных ферментативным методом, были подтверждены результатами ААC определения, т.е. в исследуемых образцах масла произошло существенное снижение активности фермента, при содержании токсичных элементов в концентрации более 0,5 ПДК. В пробах, в которых активность фермента оказалась на высоком уровне, содержание токсичных элементов оказалось менее 0,5 ПДК [32]. АГЛ-метод обеспечивает получение результатов анализа с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в таблице 27 [118].
Таким образом, в результате проведения анализа содержания токсичных элементов в растительных маслах АГЛ-методом, в 89,1% проб было установлено истинное содержание токсичных элементов, что подтверждают результаты ААС анализа.
Еще одной качественной характеристикой предлагаемого метода, является простота методологического и аппаратного обеспечения, а также временные затраты. Общее время проведения анализа в среднем составляет от 2 часов до 2 часов 20 минут. Проведение ААС определения пяти металлов, включая процесс пробоподготовки, могут занимать от 8 часов до нескольких суток, в зависимости от способа минерализации проб. Полученные результаты позволяют рекомендовать АГЛ-метод в качестве экспресс-метода анализа уровня токсикантов в растительных маслах.
Возможность использования геммульного препарата липазы, полученного из ядер семян подсолнечника для определения уровня контаминации растительных масел токсичными элементами на уровне более 0,5 ПДК, что подтверждают метрологические характеристики метода, а именно – относительная погрешность сходимости dотн – 13,2 %, а также воспроизводимости Dотн – 16,1 %. Данный метод можно использовать для проведения «входного» и «промежуточного» контроля масличного растительного сырья и растительных масел на производстве, а также химико-экологического мониторинга содержания токсичных элементов в растительных маслах.