Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Роль лактулозы в здоровом питании 7
1.2. Физико-химические свойства лактулозы 10
1.3. Способы получения и очистки лактулозы 13
1.4. Биотехнология утилизации лактозы 23
1.4.1. Сбраживание лактозы бактериями 25
1.4.1.1. Молочнокислое брожение 26
1.4.1.2. Пропионовокислое брожение 28
1.4.1.3. Маслянокислое брожение 30
1.4.2. Утилизация лактозы плесневыми грибами 31
1.4.3. Сбраживание и окисление лактозы дрожжами и дрожжеподобными микроорганизмами 32
1.5. Цели и задачи исследований 40
Глава 2. Организация работы и методы исследований 44
2.1. Объекты исследований 44
2.2. Характеристика исследуемых дрожжей 46
2.2.1. Trichosporon pullulans 46
2.2.2. Leucosporidium scotti 48
2.2.3. Candida kefyr 49
2.2.4. Kluyveromyces marxianus var.lactis 51
2.3. Методы исследований 52
2.4. Математическая и статистическая обработка результатов экспериментов 54
Глава 3. Изучение окисления лактозы дрожжами в модельных растворах молочного сахара 55
3.1. Влияние способа приготовления посевного материала на интенсивность окисления лактозы 55
3.2. Влияние различных видов дрожжевого экстракта на интенсивность окисления лактозы 64
3.3. Изучение окисления лактозы в модельных растворах молочного сахара различного качества 69
3.4. Исследование окисления лактозы различными штаммами дрожжей 74
Глава 4. Исследование окисления углеводов дрожжами в модельных растворах лакто-лактулозы 81
4.1. Влияние способа стерилизации модельного раствора на рост и метаболическую активность дрожжей 83
4.2. Изучение культивирования лактозоусваивающих дрожжей в модельных растворах лакто-лактулозы 85
4.3. Исследование углеводного состава модельных растворов при культивировании различных штаммов дрожжей 90
4.4. Оптимизация выбора штамма дрожжей и времени культивирования 93
Глава 5. Практическая реализация результатов исследований 102
5.1. Направления практической реализации результатов исследований 102
5.2. Разработка технологии лактулозы с пониженным содержанием лактозы 104
5.2.1. Технологический процесс получения сиропа лактулозы с пониженным содержанием лактозы 104
5.2.2. Оценка экономической эффективности производства сиропа лактулозы с пониженным содержанием лактозы 115
5.2.3. Социальная значимость и экологическая безопасность разработанной технологии 118
Выводы 121
Список использованной литературы
Приложения
- Физико-химические свойства лактулозы
- Характеристика исследуемых дрожжей
- Влияние различных видов дрожжевого экстракта на интенсивность окисления лактозы
- Изучение культивирования лактозоусваивающих дрожжей в модельных растворах лакто-лактулозы
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема создания, поддержания и восстановления нормальной кишечной микрофлоры является одной из наиболее актуальных для здоровья человека.
Большие возможности для коррекции кишечной микрофлоры представляет питание человека, в частности пищевые продукты, содержащие вещества, которые стимулируют (или промотируют) рост бифидофлоры в кишечнике. В настоящее время наиболее широко применяемым промотором или бифидус-фактором является лактулоза.
В промышленности для обогащения пищевых продуктов применяют концентраты лактулозы, производимые чаще всего в виде сиропов. Такие сиропы, помимо лактулозы, содержат немалую долю лактозы, повышенное содержание которой является причиной образования кристаллического осадка при хранении готового продукта, что в свою очередь снижает сроки хранения и потребительскую привлекательность сиропов лактулозы.
Теоретические и практические основы технологии лактулозы заложены в трудах О. Н. Яковлевой, В. Я. Матвиевского, Э. Ф. Кравченко, С. А. Рябцевой, И. А. Евдокимова, А.Г. Храмцова, А.В. Серова, Е. Montgomery, О. Braun, М. Tomita, A. Nangpal и других учёных.
Современные способы эффективного удаления лактозы, применяемые в технологии лактулозы, предусматривают добавление токсичных реагентов, для удаления которых применяют сложные и дорогостоящие методы, в частности селективный ионообмен. Кроме того, использование таких реагентов создаёт потенциальную опасность загрязнения готового продукта токсичными веществами. В связи с этим актуальными являются исследования в области применения биологических и биохимических методов для снижения содержания лактозы в сиропах лактулозы.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение роста и метаболической активности дрожжей в растворах молочного сахара и лакто-
лактулозы и определение направлений использования лактозоусваивающих дрожжей в технологии лактулозы и других областях.
В соответствии с поставленной целью были определены задачи исследований:
Проведение мониторинга способов получения и очистки сиропов лактулозы и биотехнологии утилизации лактозы различными микроорганизмами.
Изучение влияния различных факторов на рост и интенсивность утилизации лактозы дрожжами в концентрированных модельных растворах молочного сахара.
Подбор штаммов дрожжей, наиболее быстро окисляющих лактозу, для проведения дальнейших исследований.
Исследование влияния различных способов стерилизации модельных растворов лакто-лактулозы на рост и метаболическую активность дрожжей.
Исследование роста выбранных штаммов дрожжей в сложных по углеводному составу концентрированных модельных растворах лакто-лактулозы.
Изучение динамики углеводного состава модельных растворов лакто-лактулозы в процессе культивирования различных видов дрожжей.
Определение наиболее подходящего штамма и оптимальных параметров культивирования для максимальной утилизации лактозы и минимальной утилизации лактулозы в модельных растворах лакто-лактулозы.
Определение направлений практической реализации результатов исследований, разработка частной технологии получения сиропа лактулозы с пониженным содержанием лактозы.
Оценка экономической эффективности, экологической безопасности и социальной значимости на примере частной технологии производства сиропа лактулозы с пониженным содержанием лактозы.
Научная новизна состоит в следующем: исследовано влияние различных факторов на интенсивность утилизации лактозы адаптированными к повышенному осмотическому давлению лактозоусваивающими дрожжами в концентрированных растворах молочного сахара. Впервые установлены особенности утилизации углеводов лактозоусваивающими дрожжами в растворах лакто-лактулозы. Определена продолжительность культивирования штаммов Saccharomyces lactis SK и Candida kefyr Y - 203, обеспечивающая максимальную утилизацию лактозы и минимальную лактулозы. Теоретически обоснована и экспериментально установлена возможность использования культивирования лактозоусваивающих дрожжей для снижения содержания лактозы в растворах лакто-лактулозы.
Практическая значимость. Определены основные пути применения лактозоусваивающих дрожжей в технологии лактулозы и производстве биологически-активных добавок, разработана частная технология получения сиропа лактулозы с пониженным содержанием лактозы (ТУ и ТИ 9229-008-46162908-2004, изменение №1, от 26 декабря 2006г.). Проведена опытно-промышленная апробация микробной утилизации лактозы в растворах лакто-лактулозы на ГНУ ВНИМИ (г. Москва) и ООО «Легион» (г.Ставрополь).
Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались на международной научно-практической конференции «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002); 2-ой Всероссийской научно-технической конф. «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002); IV специализированном конгрессе «Молочная промышленность Сибири» (Барнаул, 2004); международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); межрегиональном научно-практическом семинаре «Теория и практика новых технологий в производстве продуктов питания» (Омск, 2005); международном научно-практическом семинаре «Современные направления
переработки сыворотки» (Ставрополь, 2006); симпозиуме международной молочной федерации «Лактоза и её производные» (Москва, 2007).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 11 печатных работ и подана заявка №2007123864 (025992) от 25.06.2007 на изобретение «Способ получения сиропа лактулозы».
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, содержащего 134 наименования, и приложений.
Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 28 рисунков и 9 приложений.
Физико-химические свойства лактулозы
Лактулоза - углевод, относящийся к классу олигосахаридов и подклассу дисахаридов, его молекула состоит из остатков галактозы и фруктозы. Методом масс-спектроскопии было доказано, что связь между этими моносахаридами -это 1-4 связь. Химическое название лактулозы по современной номенклатуре -4-0-Р-0-галактопиранозил-0-фруктоза, или в сокращенной форме 3-D-Gal-(1-4)-P-D-Fru.
Структура молекулы лактулозы может быть представлена в виде формулы Хеуорса и показана на рисунке 1.1.
Теоретически возможно существование 5 конформаций лактулозы: а-или р-пиранозной, а- или р-фуранозной и ациклической. Методом ЯМР-спектроскопии кристаллической лактулозы в ангидридной форме, полученной тремя различными способами, было установлено, что во всех образцах Р-фруктофуранозная форма преобладает над а-фруктофуранозной и р фруктопиранозной при соотношении соответственно 0,745:0,100:0,155.
Лактулоза представляет собой белое кристаллическое вещество, не имеющее запаха, хорошо растворимое в воде и сладкое на вкус. Ее можно перекристаллизовать из 50%-ного раствора метанола в виде гексагональных бесцветных пластин, при этом получается ангидридная форма. При кристаллизации лактулозы из водного раствора была получена тригидратная форма, существенно отличающаяся по своим физико-химическим свойствам от ангидридной [124]. Так, например, ангидридная форма очень гигроскопична -при 30С и влажности 81% уже через 24 ч влажность кристаллов повышается до 7%, а через 48 ч доходит до 20%. Кристаллы тригидрата в тех же условиях не меняют своих свойств, но теряют кристаллизационную воду при нагревании выше 35С, поэтому их рекомендуется хранить при низких температурах.
Кристаллические формы лактулозы отличаются также по точке плавления и теплоте растворения. Основные физико-химические свойства лактулозы в сравнении с лактозой, по данным [124, 72, 61], представлены в таблице 1.1.
Химическая активность лактулозы обусловлена ее строением как восстанавливающего (редуцирующего) углевода и определяется прежде всего концентрацией в растворе ациклической формы. Лактулоза дает реакцию Селиванова на кетозу, восстанавливает раствор Фелинга при нагревании, в отличие от лактозы не окисляется гипоиодитом и бромом. Эти свойства используются для идентификации и выделения лактулозы.
В соответствии с теоретическими положениями химии углеводов существует два основных механизма распада лактулозы [71]. Первый предполагает Р-элиминацию, отщепление галактозильного остатка и образование изосахариновой кислоты. Эта реакция является наиболее вероятной причиной разложения лактулозы в щелочных растворах при нагревании и образования побочных продуктов реакции изомеризации. Второй механизм распада - через ендиольную форму путем эпимеризации и дальнейшего разложения галактозилманнозы на моносахара. Эти реакции необходимо учитывать при изучении закономерностей процесса изомеризации и определении оптимальных условий получения лактулозы. На физико-химических свойствах лактулозы основаны также методы ее определения.
Характеристика исследуемых дрожжей
Для экспериментальных исследований использовали 4 штамма дрожжей, полученных из различных источников. Штаммы Candida kefyr Y - 203, Trichosporon pullulans Y - 1536, Leucosporidium scottii Y - 1537 получены из ВКПМ (Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов). Штамм Saccharomyces lactis SK из ВНИМИ (Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности). Ниже приведены характеристики видов используемых штаммов Candida kefyr Y - 203, Trichosporon pullulans Y -1536, Leucosporidium scottii Y - 1537, Saccharomyces lactis SK. Синонимы: Oidium pullulans, Basidiotrichosporon pullulans. Trichosporon fuscans. Стандартное описание вида. Рост на жидкой полной дрожжевой среде: после трёх суток культивирования строение клеток цилиндрическое, реже сферическое; размер клеток - (3,5-7 )х(5,3-21) цм; на поверхности среды наблюдается образование матовой или глянцевой, гладкой или шероховатой плёнки; осадок отсутствует или выражен слабо. Рост на плотной полной дрожжевой среде: после культивирования в течении одного месяца штриховая культура окрашивается в оранжево-желтый или белёсый цвет, поверхность колоний шероховатая и матовая, края колоний изрезаны, с мицелиальной бахромой. При микроскопировании культуры, выращенной на кукурузном агаре, наблюдается обильное развитие мицелия и артроспор, также наблюдается образование псевдомицелия с шаровидными или овальными бластоспорами, расположенными одиночно, попарно, или в виде коротких цепочек или гирлянд. Дрожжи вида Trichosporon pullulans не способны к брожению, образованию бесполых эндоспор, расщепляют арбутин, ассимилируют нитраты, образуют крахмал и уреазу, хорошо растут на безвитаминных средах. Способность к ассимиляции различных источников углерода представлена в таблице 2.2 [126]. v - некоторые штаммы дают положительную реакцию, другие отрицательную + или w - реакция положительная или слабовыраженная ( в зависимости от штамма) + (-) - реакция положительная, реже отрицательная Синонимы: Candida scottii, Azymocandida scottii Стандартное описание вида Leucosporidium scottii Рост на солодовом сусле: после трёх суток культивирования наблюдаются овальные вытянутые клетки, расположенные одиночно или парами, размером (1 - 7)х(4 - 16) цм; размножение верхушечным почкованием; также присутствуют нити псевдомицелья; в пробирках наблюдается образования небольшого осадка; спустя один месяц на поверхности среды образуются формирования неправильной формы, также увеличивается количество осадка. Рост на сусло-агаре: после трёх суток культивирования наблюдаются овальные вытянутые клетки размером ( 1- 4)х(3 - 12) цм; также присутствуют нити псевдо- и истинного мицелия; после месяца культивирования колонии окрашиваются в кремовый цвет и покрываются обильной слизью, по периферии заметно обильное развитие мицелия. При микроскопировании 3-5-суточной культуры наблюдается начало развития псевдомицелия Cadida-типа; спустя месяц обнаруживается псевдомицелий, несущий грозди бластоконидий, также присутствует истинный мицелий с эндоспорами. Дрожжи вида Leucosporidium scottii не способны к брожению, не образуют крахмал, разлагают арбутин, ассимилируют нитраты, растут в безвитаминной среде, образуют уреазу. Способность к ассимиляции различных источников углерода представлена в таблице 2.3 [126].
Влияние различных видов дрожжевого экстракта на интенсивность окисления лактозы
Для оценки влияния различных видов дрожжевого экстракта на интенсивность окисления лактозы были использованы модельные растворы на основе фармакопейного молочного сахара, характеристика которого представлена в таблице 3.3.
В модельный раствор добавляли питательные соли и дрожжевой экстракт в количествах, приведённых в таблице 2.1. В модельный раствор 1 добавляли экстракт хлебопекарных дрожжей лабораторного приготовления, в модельный раствор 2 - экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) промышленного производства. Количество добавок в обоих видах модельных растворов было одинаковым.
Посевной материал дрожжевой культуры S.lactis SK приготавливали согласно второму способу. Культивирование проводили при температуре 30С, при постоянной аэрации стерильным воздухом со скоростью 50 ±10 л/ч. Через определённые отрезки времени из биореактора отбирали пробы, в которых определяли некоторые параметры, характеризующие процесс культивирования.
Начальная концентрация клеток в обеих средах приблизительно одинакова, около 100 млн/см3, с течением времени концентрация клеток увеличивается, особенно интенсивно это происходит в первые 12 часов культивирования. В дальнейшем скорость накопления биомассы снижается, что связано с завершением логарифмической фазы роста. Нарастание содержания дрожжевых клеток наблюдается в ходе всего процесса культивирования и достигает максимального значения 1231 ±269 млн/см3 в модельном растворе 1 и 980 ±165 млн/см в модельном растворе 2 (таблица 3.4).
В результате катаболизма аминокислот и пептидов, входящих в состав дрожжевого экстракта, дрожжевые клетки выделяют некоторые карбоновые кислоты (пировиноградная, а-кетоглутаровая и др.) [12], о чём свидетельствует уменьшение рН, характеризующееся практически одинаковыми значениями в обоих модельных растворах.
Кривые роста дрожжей S.Iactis SK в модельном растворе при добавлении различных видов дрожжевого экстракта
Как видно из рисунка 3.4, достаточно высокая активность посевного материала обеспечивает интенсивное размножение клеток, наблюдаемое в первые 6 часов культивирования как в модельном растворе 1, так и в модельном растворе 2. В последующее 3 часа интенсивное размножение в растворе 1 продолжается, тогда как в растворе 2 наблюдается замедление скорости размножения, что свидетельствует о начале перехода развития популяции дрожжей в стационарную фазу, длящуюся в течение последующих 15 ±2 часов. В растворе 1 фаза логарифмического роста продолжается на 3 ±1 часа больше, что обеспечивает увеличение концентрации жизнеспособных клеток приблизительно на 150 - 300 млн/см по сравнению с раствором 2. Более продолжительная фаза логарифмического роста способствовала также увеличению общего времени культивирования дрожжей в растворе 1. Увеличение продолжительности фазы логарифмического роста связано, по всей видимости, с более полноценным составом модельного раствора, обеспечивающим достаточное количество питательных веществ для интенсивного размножения дрожжевых клеток.
Дрожжевой экстракт лабораторного приготовления, входящий в состав модельного раствора 1, оказывает положительное влияние не только на накопление биомассы, но и на интенсивность окисления лактозы, что подтверждает кинетика изменения содержания сухих веществ.
Содержание сухих веществ в обоих модельных растворах уменьшается с 22 до 20% в течении первых 9 часов культивирования (рисунок 3.5). В дальнейшем интенсивность снижения в среде 2 замедляется, и в последующие
Кинетика изменения содержания сухих веществ модельного раствора при добавлении различных видов дрожжевого экстракта 21 (±2) часа содержание СВ уменьшается с приблизительно одинаковой скоростью, достигая значения 14,8 ±0,6% через 30 часов после начала культивирования. В последние 18 часов скорость окисления лактозы значительно замедляется, что в конечном итоге приводит к прекращению снижения концентрации сухих веществ при достижении конечного значения 14,4 ±0,9%.
Изучение культивирования лактозоусваивающих дрожжей в модельных растворах лакто-лактулозы
Для исследований использовали штаммы S.lactis SK и C.kefyr Y - 203, отобранные как наиболее активно утилизирующие лактозу в ходе проведения экспериментов, описанных в главе 3. Посевной материал приготавливали согласно второму способу. Выросший в матрасных колбах инокулят смывали с поверхности агаризованного модельного раствора молочного сахара-сырца при помощи 75 ±10 см3 модельного раствора лакто-лактулозы, после этого полученную суспензию дрожжевых клеток вносили в биореактор, содержащий 425 ±10 см3 модельного раствора лакто-лактулозы. Культивирование проводили при температуре 30С, постоянной аэрации стерильным воздухом со скоростью 50 ±10 л/ч, без коррекции рН. В ходе культивирования из биореактора отбирали пробы, в которых измеряли ряд показателей, приведённых в таблице 4.4.
Как видно из рисунка, дрожжи C.kefyr Y - 203 демонстрируют более высокую скорость роста в период фазы экспоненциального роста, что обеспечивает более высокие показатели концентрации жизнеспособных клеток в последующие часы культивирования. Повышенные показатели концентрации жизнеспособных клеток дрожжей культуры C.kefyr Y - 203, скорее всего, связаны со способностью этого штамма эффективнее, по сравнению со штаммом S.lactis SK, использовать для роста различные углеводы в качестве источников углерода и энергии. Из рисунка 4.1 видно, что по прошествии 80 часов после начала культивирования значительно возрастает диапазон значений доверительного интервала. По нашему мнению, это является следствием неустойчивости системы при длительном культивировании. Вероятно, при увеличении продолжительности процесса более чем на 80 часов культуры дрожжей подвергаются повышенному влиянию различного рода внешних и внутренних факторов, способных в значительной степени повлиять на дальнейшее развитие популяции дрожжевых клеток.
При сравнении кинетики изменения концентрации жизнеспособных клеток в модельном растворе лакто-лактулозы и в модельном растворе фармакопейного молочного сахара заметно, что и в том, и в другом модельных растворах развитие популяции дрожжевых клеток характеризуется поочерёдной сменой одних и тех же фаз развития, однако продолжительность этих фаз в разных модельных растворах существенно отличается. В модельном растворе лакто-лактулозы длительность фаз роста приблизительно в два раза больше, вследствие этого время культивирования также увеличивается в два раза, по сравнению с модельным раствором фармакопейного молочного сахара. Более продолжительное время культивирования дрожжей в модельном растворе лакто-лактулозы, скорей всего, связано с меньшей метаболической активностью дрожжей вследствие более сложного углеводного состава раствора лакто-лактулозы. При культивировании штамма S.lactis SK в модельном растворе фармакопейного молочного сахара концентрация жизнеспособных клеток в период стационарной фазы роста более чем на 30% меньше, чем концентрация клеток в аналогичный период в растворе лакто-лактулозы (рисунок 4.2).
Похожая закономерность наблюдается при культивировании дрожжей C.kefyr Y - 203, однако различие в значениях концентрации жизнеспособных клеток гораздо меньше по сравнению со штаммом S.lactis SK, что говорит о большей способности этого штамма использовать для роста различные углеводы.
Модельный раствор лакто-лактулозы является системой, содержащей разные углеводы, которые являются источниками углерода и энергии для дрожжевых клеток. Наличие нескольких источников углерода и энергии в некоторых случаях требует большего времени для их утилизации, по сравнению с единственным источником. Так, например, для полного сбраживания углеводов дрожжами K.fragilis в нативной молочной сыворотке необходимое время культивирования на 48 часов меньше, по сравнению с сывороткой с гидролизованной лактозой [115]. В большинстве случаев для катаболизма различных углеводов необходимы разные ферментные системы, для регуляции синтеза которых задействованы различные механизмы индукции и репрессии, причем одни и те же вещества (индукторы и репрессоры) могут действовать на разные ферментные системы. Процессы индукции и репрессии ферментных систем в клетках при утилизации нескольких источников углерода и энергии тесно взаимосвязаны, и чем более многообразен углеводный состав, тем более сложной является эта взаимосвязь [114, 34].
