Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Нанотехнологии в пищевой промышленности 13
1.1.1 Применение наносистем в пищевых производствах 13
1.1.2 Использование наночастиц металлов в технологии продуктов питания 18
1.1.3 Получение коллоидных растворов наночастиц серебра и их характеристика 23
1.1.4 Антимикробные свойства коллоидных растворов наночастиц серебра 32
1.1.5 Проблемы безопасности использования наночастиц серебра в технологиях получения продуктов питания 36
1.2 Микробиологическая безопасность зернового сырья 42
1.2.1 Микроорганизмы зерна 42
1.2.2 Предотвращение микробиологической порчи зернового сырья 48
1.3 Инфекция и ее источники в бродильных производствах 49
1.3.1 Источники контаминации в технологиях, основанных на переработке зернового сырья 49
1.3.2 Способы обеспечения микробиологической безопасности в технологии продуктов брожения 54
1.4 Пивная дробина – ценный вторичный сырьевой ресурс 55
1.4.1 Характеристика дробины 55
1.4.2 Хранение и переработка пивной дробины 57
1.4.3 Использование пивной дробины для биосинтеза лимонной кислоты 61
Заключение по обзору литературы 64
2 Экспериментальная часть 65
2.1 Объекты исследования 66
2.2 Методы исследования
2.2.1 Метод приготовления основной питательной среды – мясопептонного агара (МПА) 68
2.2.2 Метод приготовления дифференциально-диагностической питательной среды Эндо 68
2.2.3 Метод приготовления жидкой питательной среды для культивирования дрожжей - пивного сусла 68
2.2.4 Метод приготовления питательной среды для культивирования мицелиальных грибов и дрожжей – сусло-агара 69
2.2.5 Метод приготовления высокопитательной среды – сердечно-мозгового агара (BHI) 69
2.2.6 Метод приготовления питательной среды для культивирования грибных микроорганизмов на основе пивной дробины 69
2.2.7 Метод приготовления питательной среды для биосинтеза лимонной кислоты на основе пивной дробины 70
2.2.8 Метод оценки антибактериальной активности коллоидных растворов НЧС 70
2.2.9 Метод оценки биостатической активности коллоидных растворов НЧС в отношении мицелиальных грибов 71
2.2.10 Метод антимикробной обработки зерновой массы 72
2.2.11 Метод «ускоренного хранения» зерна для определения изменений микробиологических показателей 72
2.2.12 Методы определения микробиологических показателей зерна пшеницы 72
2.2.13 Методы определения состава пивной дробины, ячменя и пшеницы 73
2.2.14 Метод антибактериальной обработки дробины 73
2.2.15 Метод определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) НЧС при культивировании A. niger в присутствии бактериальной контаминации 73
2.2.16 Метод совместного культивирования бактериальных и дрожжевых микроорганизмов в присутствии НЧС 74
2.2.17 Метод подсчета концентрации клеток S. cerevisiae в жидкой среде 74
2.2.18 Метод культивирования A. niger в среде на основе пивной дробины 74
2.2.19 Метод определения концентрации лимонной кислоты, накапливаемой при культивировании A. niger 75
2.2.20 Метод определения активной кислотности солодового сусла 75
2.2.21 Метод подготовки проб для определения содержания серебра 75
2.2.22 Метод измерения концентрации НЧС в жидкой среде с применением атомно-адсорбционной спектрометрии (ААС) 76
2.2.23 Метод измерения размера частиц серебра в жидкой среде на основе динамического лазерного светорассеяния (ДЛРС) 77
2.3 Результаты исследований и их обсуждение 78
2.3.1 Изучение антимикробной активности коллоидных растворов НЧС . 78
2.3.2 Антимикробная обработка зернового сырья с применением препаратов НЧС 85
2.3.3 Исследование влияния НЧС на микробную контаминацию дрожжей S. cerеvisiae 89
2.3.4 Антибактериальная обработка пивной дробины препаратом НЧС. 98
2.3.5 Разработка технологических приемов применения НЧС в бродильных производствах 101
2.3.5.1 Применение НЧС для обработки зерна 101
2.3.5.2 Применение НЧС для обработки ЧКД 102
2.3.5.3 Применение НЧС для обработки пивной дробины 103
2.3.6 Экономическая эффективность внедрения технологии разведения чистой культуры дрожжей с применением НЧС 105
Заключение 107
Список литературы
- Проблемы безопасности использования наночастиц серебра в технологиях получения продуктов питания
- Метод приготовления дифференциально-диагностической питательной среды Эндо
- Метод определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) НЧС при культивировании A. niger в присутствии бактериальной контаминации
- Изучение антимикробной активности коллоидных растворов НЧС
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В соответствии с Государственной программой развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы предусмотрено комплексное развитие всех отраслей. Среди приоритетов Программы - развитие импортозамещения и экологическая безопасность сельскохозяйственной продукции и продовольствия.
Экологическая безопасность производства пива, кваса, спирта – бродильных производств - в значительной мере обусловлена микробиологической безопасностью сырья и производства. Основные источники контаминации пивоваренного производства - зерновое сырье и ведение дрожжей. Микробная контаминация снижает качество зерна, повышает его потери, привносит в продукт токсины, ухудшает качество дрожжей и может контаминировать продукт (пиво, квас); сокращает продолжительность хранения как готового продукта, так и пивной дробины - ценного сырья для биоконверсии. Снижение микробной контаминации зерна, дрожжей, дробины повышает биологическую безопасность пива (кваса) и продуктов переработки дробины.
Бродильные производства используют большие объемы зерновых ресурсов: ячменя, пшеницы и др., например, в 2014 г. для выработки 760 334 млн дал пива было использовано 1073 тыс. т солода, на производство которого израсходовано 1263 тыс. т пивоваренного ячменя. Принимая во внимание значительные потери зерна при хранении – до 30% за счет развития возбудителей болезней в послеуборочный период - как бактерий, так и мицелиальных грибов, а также тот факт, что многие из последних токсигенные, особое внимание следует уделять разработке современных методов обработки зерна для повышения экологической безопасности произведенных из него пива и других напитков. Также при переработке зерна образуется значительное количество вторичных зерновых сырьевых ресурсов (ВСР), в частности, в пивоварении – пивная дробина. В бродильных производствах на экологическую безопасность пива также влияют дрожжи, от которых зависит качество продукции и ход технологического процесса, а в производстве спирта – выход спирта, скорость и степень сбраживания.
Известно много способов деконтаминации: (обработка кислотами, щелочами, газами, дезинфектантами), на протяжении столетий применяли серебро. Но, учитывая результаты развития науки и технологий, представляет интерес использовать новые его формы, в том числе для целей повышения биологической безопасности - применение серебра в виде наноразмерных частиц (НЧС).
В январе 2014 г. Председателем Правительства Российской Федерации утвержден долгосрочный Прогноз научно-технологического развития России на период до 2030 г. (разработан Минобрнауки РФ, резолюция № ДМ-П8-5 от 3.01.2014), в котором среди семи приоритетных направлений определены два: «Биотехнологии» и «Новые материалы и нанотехнологии». В приоритетном направлении №4 «Новые материалы и нанотехноло-гии» предусматривается расширение применения наноразмерных материалов в различных отраслях и комплексах, в том числе в пищевой промышленности; а перспективными
направлениями научных исследований №2 «Биотехнологии» определены пищевые биотехнологии, в которых отмечена необходимость обеспечения безопасности пищевых продуктов переработки пищевого сырья и отходов. Среди ожидаемых результатов - микробные консорциумы с заданными свойствами и оптимизированными технологическими характеристиками, а также биотехнологические процессы получения полезных ингредиентов из малоценных продуктов переработки растительного сырья.
Потребность в разработке новых эффективных методов повышения биологической безопасности продукции бродильных производств привела к решению проблемы за счет снижения микробиологического заражения культуры дрожжей, зерна, зерновых ВСР с применением наноразмерных частиц серебра, что соответствуют современным направлениям научно-технологического развития России.
Степень разработанности. Значительный вклад в проблемы применения наноси-стем в производстве продуктов питания изучали Тутельян В.А., Гмошинский И.В., Хо-тимченко С.А., Попов К.И., Филиппов А.Н., Жердев А.В., Карпенко Д.В., Сидоренко Ю.И., Ivask A., Fewtrell L., Yada R., Aguilera J.M., Kampers F., Weiss J., Takhistov P. и др.; а в решениях проблем безопасности зерна - Е.Д. Казаков, В.А. Бутковский, Г.Г. Юсупова. Однако, влияние НЧС на широкий спектр микроорганизмов зернового сырья и перерабатывающих его бродильных производств детально не исследовалось.
Цели и задачи. Цель данного исследования - разработка способов повышения биологической безопасности культуры дрожжей, зерна, пивной дробины в результате применения НЧС при разведении чистой культуры дрожжей (ЧКД) для сбраживания зернового сусла бродильных производств и снижения микробной контаминации дрожжей в процессе брожения, а также при обработке зернового сырья и пивной дробины, предназначенной для ее биоконверсии.
Для осуществления поставленной цели сформулированы следующие задачи:
разработать способы применения НЧС для снижения количества микроорганизмов - вредителей бродильных производств;
исследовать особенности воздействия НЧС на бактериальные и грибные микроорганизмы, контаминирующие дрожжи, зерно, пивную дробину;
выбрать эффективные и приемлемые для условий бродильных производств растворы НЧС коллоидной степени дисперсности;
подобрать эффективные антимикробные концентрации, химический состав и характеристики растворов НЧС, применение которых целесообразно в бродильных производствах;
разработать технологические приемы обработки дрожжей, пивной дробины нано-частицами серебра; испытать их в производственных условиях,
определить влияние НЧС на свойства дрожжей Saccharomyces cerevisiae и на процесс биоконверсии пивной дробины в результате культивирования на ней мицелиального гриба Aspergillus niger;
разработать рекомендации предприятиям по применению НЧС для обработки дрожжей, дробины, зерна.
Научная новизна
Обнаружена селективная антимикробная активность НЧС в отношении микро-биоты бродильных производств в зависимости от размера и концентрации частиц в среде.
Проанализирована эффективность антимикробного действия НЧС на культуры бактерий в зависимости от морфологических особенностей и расположения их клеток относительно друг друга.
При изучении динамики накопления клеток дрожжей в ходе их культивирования в жидких средах, инфицированных бактериальными контаминантами, установлена интенсификация экспоненциальной фазы роста дрожжей в присутствии НЧС.
Изучено распределение частиц серебра по размеру в сбраживаемых средах методом динамического лазерного светорассеяния и установлено, что в процессе брожения происходит коагуляция частиц серебра с переходом коллоидной системы из нанодисперсного состояния в микродисперсное.
По результатам исследования культивирования A. niger на твердой питательной среде - пивной дробине, обработанной коллоидными растворами НЧС - выявлено как ин-гибирующее, так и активирующее влияние НЧС на продуцент в зависимости от концентрации частиц.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенной сравнительной оценки характеристик препаратов растворов НЧС коллоидной степени дисперсности (отечественного производства и синтезированных в Эталонной нанолабо-ратории МГУПП) выявлены наиболее эффективные препараты для антимикробной обработки в производстве пива и спирта.
На основании изучения действия препаратов НЧС на микроорганизмы бродильных производств подобраны эффективные концентрации препаратов и разработаны способы антимикробной обработки дрожжей при их культивировании; зерна в качестве сырья; пивной дробины как субстрата для получения лимонной кислоты.
Установлено, что применение НЧС:
при культивировании дрожжей улучшает их качество и повышает эффективность;
при обработке зерна снижает его микробиологическую контаминацию;
при обработке дробины значительно снижает обсемененность микроорганизмами, продляет срок ее хранения, повышает эффективность ее использования для биоконверсии.
Проведенные опытно-промышленные испытания применения НЧС при разведении ЧКД на ЗАО МПБК «Очаково» и для обработки пивной дробины на минипивзаводе ООО «НТЦ Солодовые напитки» и на минипивзаводе УНПК МГУПП подтвердили значимость результатов исследования. Определен экономический эффект от применения НЧС.
Методология и методы исследования. Исследования проводили на основе сбора, анализа и систематизации научной информации, а также с использованием инструментальных стандартных и специальных физико-химических и микробиологических методов анализа дрожжей, зерна, пивной дробины с последующей обработкой результатов исследований. Структурная схема проведения исследований представлена на рисунке 1.
Оптимизация способов обработки с применением НЧС
Разработка
рекомендаций
промышленности по
обработке зернового
сырья с применением
НЧС
Разработка приемов
культивирования ЧКД в
присутствии НЧС
Контроль
нанокомпонентов в
конечном продукте
Проведение опытно-промышленных испытаний
Разработка
рекомендаций
промышленности по
обработке дрожжей с
применением НЧС
Разработка
рекомендаций
промышленности по
обработке ВМР с
применением НЧС
Рисунок 1 – Структурная схема проведения исследований
С целью оценки антимикробной активности НЧС использовали методы определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), зоны ингибирования по МУК 4.2.1890-04. Микробиологический контроль осуществляли с применением методов световой микроскопии, определения микробиологического показателя безопасности пищевых продуктов (КМАФАнМ) по ГОСТ 10444.15-94, прямого подсчета клеток микроорганизмов. Массовую концентрацию лимонной кислоты определяли спектрофотометрически по ГОСТ 32113-2013; активную кислотность – потенциометрически по ГОСТ 31764-2012, а также использовали общепринятые в пивоварении методы анализа (ТИ-18-6-47-85. Технологическая инструкция по производству солода и пива).
Исследование свойств коллоидных растворов наночастиц осуществляли при помощи динамического лазерного светорассеяния (ДЛРС) и атомно-абсорбционного спектрального анализа (ААС) на приборе Zetatrac (Microtrac inc, США).
Положения, выносимые на защиту:
влияние НЧС различных препаратов на микробиоту бродильных производств (дрожжей, зерна, дробины);
способы антимикробной обработки дрожжей и зерна с применением НЧС;
способ антибактериальной обработки пивной дробины с целью ее подготовки к биоконверсии;
теоретическое и экспериментальное обоснование применения коллоидных растворов НЧС как селективного биоцидного агента;
технологические приемы применения НЧС при культивировании дрожжей S. cere-visiae и в подготовке пивной дробины к биоконверсии.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с помощью программы Microsoft Excel с вероятностью Р=0,95. Сформулированные в работе положения, выводы и рекомендации обоснованы с учетом информационно-патентных данных и подтверждены в лабораторных и производственных условиях. Степень достоверности результатов исследований подтверждается проработкой данных в соответствии с тематикой диссертационной работы, постановкой экспериментов, применением современных методов анализа, публикацией основных положений работы в научных изданиях.
Основные положения и результаты исследований представлены на Х научно-практической конференции с международным участием «Экспертиза, оценка качества, подлинности и безопасности пищевых продуктов» (М.: МГУПП, ноябрь 2012), XII Всероссийской научно-практической конференции «Современное хлебопекарное производство: перспективы развития» (Екатеринбург: УрГЭУ, апрель 2011), Межведомственной научно-практической конференции «Инновационные технологии в пищевой промышленности, товароведении и общественном питании» (М.: МГУПП, апрель 2013), Международной выставке высоких технологий «China Hi-Tech Fair 2013» (Китай, Шэньчжэнь: China Hi-Tech Transfer Center, ноябрь 2013), 4-й Совместной конференции Немецкого общества гигиены и микробиологии DGHM и Ассоциации общей и прикладной микробиологии VAAM (Германия, Дрезден: DGHM & VAAM, октябрь 2014), XII Международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (М.: МГУПП, март 2015), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вопросы длительного хранения продовольственных товаров, товароведения и технологий общественного питания» (М.: МГУПП, апрель 2015), Всемирной конференции по технологии, инновациям и предпринимательству «Entrepreneurship for Sust Dev based on Tech and In-nov» (Турция, Стамбул: Istanbul University, май 2015), Осеннем финале по программе «У.М.Н.И.К.» РАН (М.: Президиум РАН, ноябрь 2015).
Результаты исследования отмечены дипломами XIV Всероссийской выставки научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2014»; за победу в конкурсе научно-исследовательских работ, VI межведомственной научно-практической конференции «Товароведение, общественное питание и технологии хранения продовольственных товаров»
(М.: МГУПП, апрель 2014). По результатам работы, автору назначена стипендия Правительства Российской Федерации.
Исследования выполняли в рамках Гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № МК-5220.2014.4 «Обеспечение микробиологической безопасности продуктов питания различных сроков хранения при использовании нано- и криотехнологий».
Диссертация соответствует паспорту специальности 05.18.07 «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ», п.п. 1 и 13.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из 2 глав, заключения, списка литературы и приложений. Диссертационный материал изложен на 163 страницах текста, включает 21 рисунок, 13 таблиц, 7 приложений. Список литературы состоит из 202 источников (в том числе 135 иностранных).
Проблемы безопасности использования наночастиц серебра в технологиях получения продуктов питания
Современная наука определяет понятие «наносистема» как совокупность структурных ультрадисперсных объектов с размерами в переделах 1-100 нм как минимум по одному из измерений, что определяет основные характеристики и свойства данной системы [23, 31, 45, 113, 170].
Вопрос применения наносистем в производстве можно выделить в особую область исследований благодаря их уникальным свойствам, основанным на проявлениях размерного эффекта наночастиц (НЧ) [24]. Наносистемы обладают огромной удельной поверхностью, которая может достигать квадратного километра на 1 кг массы наночастиц. Кроме того, наноразмерные системы несут коллосальный избыток поверхностной энергии, который, выраженный через поверхностное натяжение, в десятки раз превышает поверхностное натяжение воды, при чем поверхностное натяжение возрастает по мере снижения размеров НЧ. Различная форма НЧ обуславливает возникновение дополнительной поверхностной энергии за счет структуры и параметров кристаллических НЧ. Можно наблюдать появление квантово-размерных эффектов в случае, если размер частиц соизмерим с длиной волны де Бройля для электронов. Химические взаимодействия, протекающие между наносистемами и окружающей средой, отличаются особой интенсивностью, приводящей к смещению химического равновесия в процессах и приводящих к значительному повышению скорости обменных реакций.
Размерный эффект также определяет коллоидно-химические процессы, происходящие с участием НЧ [6, 32]. Адсорбционный потенциал и интенсивность адсорбции обратно пропорциональны размерам НЧ. Каталитическая активность также растет с уменьшением размера НЧ. Кроме того, учитывая уникально большую удельную поверхность наносистем, относительная сила адгезии в пересчете на единицу массы НЧ достигает огромных значений. Диффузионные способности НЧ обладают значительным потенциалом, и в зависимости от структуры и дисперсности наноразмерной системы, может возникать объемная, поверхностная, граничная и зернограничная диффузия, благодаря чему процессы осмоса с участием наносистем заметно интенсифицируются. Немаловажно проявление наночастицами уникальных оптических свойств, позволяющих характеризовать размер частиц в зависимости от поглощения и рассеивания света с определенной длиной волны.
Мировое развитие нанотехнологий привело к возникновению новейшего сектора промышленности с многомиллиардным оборотом. Мировой уровень объема продаж нанопродуктов в пищевом секторе и в секторе упаковки напитков только в период с 2002 по 2004 гг. скачкообразно увеличился со 150 млн до 860 млн долларов, а к 2010 г. превысил 20,4 млрд долларов [162]. Согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО) к концу 2015 г. доходы компаний, специализирующихся на использовании нанотехнологий могут возрасти до триллиона долларов США, а число работников, трудящихся в данной сфере, достигнет 2 млн [97]. В 2010 г., большая часть предприятий, применяющих наноразмерные материалы, сконцентрирована, согласно статистике, на территории Северной Америки, а в Европе находится около 30 % нанотехнологичного производства. Другими странами, ведущими разработки в области наносистем, являются Китай, Корея и Япония. К марту 2006 г. на мировом рынке были доступны свыше 200 пищевых продуктов, помеченных производителем индексом «нано». К 2010 г. этот показатель возрос до 800, при чем только 10 % такой продукции относится к непосредственному наличию наноразмерных систем в самом продукте. Дальнейший рост количества пищевых товаров, изготовленных с применением нанотехнологий не вызывает сомнений. В настоящее время более 200 компаний во всем мире, включая Nestle, Kraft, Unilever, General Mills, ведут активные исследования и разработки в области создания «нанопродуктов» [162].
Объем научной работы в области исследования нанотехнологий год от года увеличивается. Для Российской науки, изучение наноразмерных систем, их свойств и способов применения остается достаточно новым направлением. Однако, нельзя не отметить положительную динамику в данном направлении науки и техники. Так, число зарегистрированных в нашей стране патентов с 2005 по 2011 гг. возросло почти в 10 раз, а государственные инвестиции в «нано-сектор» – более, чем в 22 раза [9].
Высокодисперсные системы, размером менее 1000 нм известны коллоидной химии достаточно длительный период времени. Они возникают в процессе производственного цикла, входят в состав выпускаемых изделий, образуются в природных условиях в растительном мире и живых организмах. Значительное количество продуктов питания изначально имеют в своем составе частицы размером в пределах 1-1000 нм [127]. Белки, например, бета-лактоглобулин, имеющий длину около 4 нм, могут подвергаться денатурации, под воздействием температуры, рН и механического давления, а получившиеся в результате компоненты формируют большие структуры волокнистого строения, одно из измерений которых будет исчисляться в нанометрах. Белок-полисахаридные смешанные растворы могут самопроизвольно разделиться на фазы с нано- или микроразмером капель, диспергированных в непрерывной фазе. Гранулы крахмала расширяются при нагревании и увлажнении, освобождая биополимеры, которые могут быть перекристаллизовываться в наноразмерные структуры, например, рекристаллизованные амилозы могут иметь размер около 10-20 нм. Декстрины и другие продукты распада в результате экструзии могут быть использованы для инкапсуляции биоактивных веществ в определенных районах и т.д. Жиры, например, моноглицериды, могут самостоятельно собираться в разнообразные морфологии на наноуровне, и иерархически структурируясь в триглицериды, способны кристаллизоваться с образованием комплексов размером 10-100 нм. Графическая иллюстрация вышеперечисленных процессов представлена на рисунке 1.1.
Метод приготовления дифференциально-диагностической питательной среды Эндо
Зерно – чрезвычайно важное пищевое и кормовое сырье, от его состояния зависит качество и будущего урожая, и получаемого из него хлеба и кормов. Патогенная микробиота семенного зерна может вызывать гибель проростков и всходов, корневые гнили, снижение продуктивной кустистости и, как следствие, приводить к снижению урожая и технологических показателей зерна нового урожая. В зерне, идущем на переработку, присутствуют мицелиальные грибы и бактерии, некоторые из которых продуцируют токсичные вторичные метаболиты (микотоксины), снижающие пищевое и кормовое качество зерновой продукции.
Зерно достаточно обеспечено питательными веществами, которые при определенных условиях выступают в роли благоприятной среды для развития микроорганизмов. Значительное количество микроорганизмов, насекомых и клещей при определённых благоприятных условиях отрицательно влияют на зерно, иначе говоря, сокращают в нём содержание сухих веществ, способствуют его загрязнению, а также, отравляют токсинами своей жизнедеятельности. Зараженность зерна вредителями и болезнями проявляется на его дальнейшей переработке в пищевой промышленности.
В качестве основного источника проникновения микроорганизмов на поверхность растений, а за тем и на зерно, можно выделить почву. Патогенные микроорганизмы, обнаруживаемые в почве, разделяют на три группы [43]: - патогенные микроорганизмы, которые постоянно обитают в почве, а именно Clostridium botulinum, некоторые виды Actinomyces, возбудители микотоксикозов и подкожных микозов. - спорообразующие патогенные бактерии: Bacillus anthracis, Clostridium tetani, виды Clostridium, вызывающие анаэробные инфекции. Для них характерно размножение в благоприятных условиях и существование в виде спор продолжительное время. - патогенные микроорганизмы, проникающие в почву с выделениями человека и животных и удерживающиеся относительно недолго. К ним относят различные неспоровые бактерии Salmonella, Shigella, Vibrio, Brucella, Pseudomonas.
В разнообразных почвенных структурах складываются различные по составу сообщества. Их воздействие на физиологические процессы растений может быть, как положительным, так и отрицательным. Например, фитопатогенные микроорганизмы синтезируют фитотоксины, способные задерживать рост растений, а иногда полностью приводить к их гибели.
Примером положительного воздействия является описанное в литературе взаимодействие растений с плодотворными микроорганизмами, то есть с продуцентами комплекса антибиотических веществ, обладающих высокой физиологической динамичностью и подавляющих рост целого ряда фитопатогенов. Их антагонистические свойства нашли широкое применение в сельскохозяйственных отраслях. Растения взаимодействуют и с полезными микроорганизмами, которые, обладая высокой физиологической активностью, подавляют рост целого ряда фитопатогенов [20]. Корни растений выделяют в среду такие экзометаболиты как аминокислоты, сахара, минеральные соли и т. д., а определенные представители ризосферных микроорганизмов питаются за счет этих продуктов жизнедеятельности и оказывают положительное влияние на его развитие и продуктивность [3], например Basidiomycetes, который образует симбиоз с корнями растений, формируя своего рода чехол из мицелия или скопления в виде клубков, что способствует лучшему развитию растения.
Помимо данных представителей в среде находятся сапрофитные мицелиальные грибы, актиномицеты, дрожжи. К положительному влиянию таких микроорганизмов на растения относят улучшение фосфорного питания растений путем эффективного растворения соединений фосфора бактериями и активацию роста за счет угнетения патогенных микроорганизмов и возрастания устойчивости растений к заболеваниям.
В процессе активной жизнедеятельности небольшое количество бактерий, развивающихся в зоне корня, переходит на надземные органы растений. Но ввиду минимального содержания питательных веществ и влаги на поверхности растительного организма могут развиваться только эпифиты.
Эти микроорганизмы, проявляя свою антагонистическую активность по отношению к фитопатогенам, являются естественными защитниками растительных организмов. В тоже время наблюдается способность некоторых форм эпифитных бактерий губительно воздействовать на растения. По мнению ученых, фитопатогенные бактерии произошли от эпифитных. Доказательством этого являются найденные переходные формы, которые занимают положение между сапрофитными, эпифитными и паразитирующими фитопатогенными бактериями. Так, было установлено, что посредником между эпифитным микроорганизмом Xanthomonas herbicola aureum и фитопатогенными бактериями этого рода является Xanthomonas heterocea, активно развивающаяся на различных растениях [17].
По-видимому, ведущим фактором эволюции эпифитных бактерий в направлении паразитизма послужило питание растительными тканями. Попадая на зараженные растения, бактерии начинают питаться мертвыми, а затем отмирающими тканями и в дальнейшем дают начало развитию паразитирующих форм. Закономерная вариабельность и приспосабливаемость организмов к факторам питания определяет вероятность эволюции сапрофитных бактерий в направлении паразитизма [1].
В результате исследований микрофлоры растений пшеницы в преобладающем количестве были найдены грамотрицательные палочки Herbicola aureum и Pseudomonas fluorescens. Другие сопутствующие им группы находились в меньших количествах. Это бактерии, представленные следующими родами: Micrococcus, Baccilus, Streptococcus, Sarcina и др. Также иногда встречаются и фитопатогенные бактерии. Однако их появление, в большинстве случаев связанно с инфекционным процессом, происходящем в растении.
Метод определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) НЧС при культивировании A. niger в присутствии бактериальной контаминации
Подготовка проб осуществляется по способу мокрой минерализации на основе описанного в ГОСТ 26929-94 [12]. Способ основан на полном разрушении органических веществ пробы продукта при нагревании с серной и азотной концентрированными кислотами с добавлением хлорной кислоты или пероксида водорода, или при нагревании только с пероксида водорода.
В колбу с пробой продукта вносят азотную кислоту из расчета 10 см3 на каждые 20 см3 сброженного сусла и выдерживают не менее 15 мин. Затем в колбу вносят 2—3 стеклянных шарика для равномерного кипения, закрывают грушевидной стеклянной пробкой и начинают нагревать на электроплитке слабо, затем сильнее, упаривая содержимое колбы до объема 3—5 см3.
Колбы охлаждают, вносят 10 см3 азотной кислоты, содержимое упаривают до объема 5 см3, после чего охлаждают. Эту процедуру повторяют 2-4 раза.
В колбу вносят 10 см3 азотной кислоты, 5 см3 серной кислоты, 4 см3 хлорной кислоты (или вместо хлорной кислоты 4 см3 пероксида водорода) из расчета на каждые 20 см3 сброженного сусла. Содержимое колбы упаривают до объема около 5 см3, не допуская образования коричневой окраски жидкости. При появлении коричневой окраски нагревание прекращают.
Колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 см3 азотной кислоты и 2 см3 хлорной кислоты (или вместо хлорной кислоты 2 см3 пероксида водорода) и снова нагревают до появления белых паров серного ангидрида. Если при этом раствор не обесцветился, эту процедуру повторяют. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным или бледно-желтым.
Для удаления остатков кислот в охлажденную колбу добавляют 10 см3 воды и кипятят 10 мин с момента выделения белых паров, затем охлаждают. Добавление воды и нагревание повторяют 2 раза.
Если при этом образуется осадок, в колбу вносят 20 см3 воды, 2 см3 серной кислоты, 5 см3 соляной кислоты и кипятят до растворения осадка, постоянно дополняя испаряющуюся воду. Полученный минерализат после охлаждения используют для анализа, полностью или количественно переносят водой в мерную колбу, доводят до метки водой и перемешивают.
Метод измерения концентрации НЧС в жидкой среде с применением атомно-адсорбционной спектрометрии (ААС) Метод основан на измерении излучения, испускаемого первичным источником и поглощенного атомами в основном состоянии, причем интенсивность поглощения зависит от концентрации элемента. Измерения проводят на атомно-абсорбционном спектрометре КВАНТ–Z.ЭTA с электротермическим атомизатором и зеемановской коррекцией фонового поглощения резонансного излучения [30].
Для измерения используют пробы, подготовленные по методу 2.2.21. Измерения оптической плотности атомного пара производят на резонансной спектральной линии элемента, излучаемой соответствующей лампой с полым катодом. Измеряемая оптическая плотность атомного пара определяемого элемента связана с концентрацией этого элемента в анализируемой пробе градуировочной зависимостью, определяемой в процессе градуировки. Градуировка производится, как минимум, по четырем градуировочным растворам, включая фоновый (нулевой или бланковый) раствор.
При измерении применяют соответствующую программу нагрева графитовой печи, состоящую из стадии испарения, трех стадий пиролиза, стадии атомизации и стадии очистки. Выбирают дозировку аликвоты в 0,015 см3. Параметры работы печи на различных стадиях выставляют в соответствии с таблицей 2.2 [52].
Метод основан на определении коэффициента диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа характерного времени флуктуаций интенсивности рассеянного света. Измерения проводят на приборе Microtrac Zetatrac по методике производителя [199]. Zetatrac представляет собой блок-анализатор со встроенной кюветой для помещения образца. В кювете находятся два электрода для определения дзета-потенциала. Через отдельную системную плату прибор подключен к компьютеру, на который установлено специализированное программное обеспечение – Microtrac FLEX 10.5.4, которое автоматически анализирует результаты и проводит статистическую обработку. Для исключения из измерения фоновых помех, предварительно заполняют кювету анализатора жидкой средой (разбавленным суслом), не содержащей НЧС, и проводят background анализ. Далее кювету промывают дистиллированной водой и заполняют анализируемым образцом. Вводят необходимые параметры и запускают процедуру измерения - Perform Sample Measurement Run.
Антимикробную активность (бактериостатический и фунгистатический эффекты) изучали для микроорганизмов, наиболее распространенных в пивоваренном, спиртовом и других бродильных производствах.
Бактериостатический эффект НЧС в значительной степени зависит от размера частиц, способа синтеза и стабилизирующих агентов. Для выбора препарата, наиболее пригодного для применения в пищевой промышленности, требуется оценить степень бактериостатической активности исследуемых растворов. Анализ проводили с использованием разновидности метода зон ингибирования при культивировании на твердых питательных средах, преимущества которого заключается в том, что определение величины бактериостатического действия происходит с учетом способности частиц диффундировать в питательную среду. Эксперименты показали, что исследуемые коллоидные растворы НЧС проявляют антимикробное воздействие на различные штаммы микроорганизмов. Через 12 ч после начала опыта можно было четко определить границы зоны ингибирования. Характерной особенностью определяемых зон ингибирования было полное отсутствие роста биомассы микроорганизмов вокруг центральной лунки (рисунок 2.3).
Изучение антимикробной активности коллоидных растворов НЧС
Из опытных данных видно, что присутствие НЧС в питательной среде позволяет быстро подавить развитие бактериальной микробиоты и интенсифицировать процесс накопления биомассы продуцента. Наибольшее количество кислоты было накоплено на 4 сут культивирования. Характерно, что интенсивность выделения лимонной кислоты продуцентом значительно повышена в образцах, обработанных раствором НЧС. Полученные данные могут свидетельствовать об активирующем действии НЧС в отношении A. niger. Важно отметить, что концентрация лимонной кислоты в образце, содержащим НЧС, оказалась на 5 % выше, чем в контроле. В образцах где культивирование A. niger проводили на нестерильной пивной дробине, не прошедшей обработку НЧС, накопление биомассы продуцента было значительно ингибировано. Общее количество лимонной кислоты, синтезированной в процессе культивирования, составило только 25 % от аналогичного показателя опытных образцов с НЧС. Можно заключить, что наличие бактерий, присутствующих в образцах необработанной пивной дробины негативно влияет на развитие A. niger. Внесение НЧС ингибирует бактериальную микробиоту и способствует росту биомассы продуцента. Аналогичный эффект будет наблюдаться при использовании других мицелиальных грибов – продуцентов органических соединений.
Таким образом, антибактериальную обработку дробины для увеличения ее срока годности препаратом КНД-С-К12 с целью дальнейшей биоконверсии можно считать целесообразной. Обработка дробины с применением НЧС проверена в производственных условиях минипивзаводов МГУПП и ООО «Солодовые напитки». Установлено, что обработанную препаратом дробину можно хранить при 20-30 оС в течение 14 сут без увеличения содержания в ней микроорганизмов.
На основании лабораторных исследований разработаны технологические приемы обработки зерна с целью снижения его контаминации, чистой культуры дрожжей S. сerevisiae и пивной дробины для предотвращения их инфицирования и повышения продуктивности. Предложенные технологические приемы характеризуются внесением НЧС в зерновую массу, сусло или пивную дробину на различных стадиях технологической подготовки. Разработаны рекомендации промышленности (см. приложение Д).
Технологический прием обработки ячменя препаратом НЧС КНД-С-Х12 с целью снижения микробиоты зерна представлен на рисунке 2.14. Прием отличается тем, что для удаления КНД-С-Х12 с поверхности зерна и снижения вероятности попадания НЧС в пиво, зерновую массу, предназначенную для солодоращения или в качестве несоложеного сырья при получения пивного сусла, выдерживают в 0,15 %-ном растворе NaOH в течение 3-5 ч.
В следующем способе НЧС были применены для снижения контаминации ЧКД S. cerevisiae, вследствие чего произошло повышение их продуктивности и качества. По результатам исследований проведены производственные испытания в условиях МПБК «Очаково» и подана заявка на изобретение (см. приложение Е). Для обработки дрожжей рекомендован препарат КНД-С-К12 (рисунок 2.15).
Технологическая схема разведения ЧКД с применением НЧС 2.3.5.3 Применение НЧС для обработки пивной дробины
В результате опытно-промышленных испытаний в условиях двух минипивзаводов проверен способ подготовки пивной дробины к биоконверсии, включающий антибактериальную обработку сырой дробины препаратом НЧС КНД-С-К12, обогащение дробины источниками азота и минеральными веществами как питательной среды для получения лимонной кислоты (рисунок 2.16).
По результатам исследований разработаны несколько приемов обработки сырья, продуктов ключевых стадий и продуктов бродильных производств растворами наночастиц серебра, два из которых проверены в производственных условиях. Предложенные способы позволяют повысить безопасность сырья и готовой продукции вследствие снижения уровня биологической инфекции на отдельных стадиях производств, продлевая использование в бродильных производствах большого числа генераций дрожжей и улучшая продуктивность продуцента лимонной кислоты.
В бродильных производствах развитие бактериальной инфекции способно негативно повлиять на органолептические свойства конечного продукта. Потери пива, связанные со снижением качественных показателей, составляют до 4 % от общего объема вырабатываемой продукции [27, 42]. Принимая во внимание особенностей коммерческого производства пива в небольших объемах, этот показатель может быть существенно выше для малых предприятий. Принимая во внимание тот факт, что для обеспечения конкурентоспособности, продукция минипивоварен должна обладать выдающимися органолептическими характеристиками, даже незначительные изменения вкуса, цвета и запаха пива могут привести к потере значительного числа потенциальных покупателей. Использование коллоидных растворов НЧС для контроля микробиологической контаминации дрожжей S. cerevisiae может привести к снижению потерь продукции. На основании современных цен на пивоваренное сырье [28] был рассчитан ожидаемый экономический эффект от применения технологии разведения дрожжей с использованием НЧС для производства пива «Лагер» [25] (см. приложение Ж). Экономические показатели представлены в таблице 2.11.