Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Лектины растений 8
1.1.1. Общие сведения о лектинах 8
1.1.2. Физиологическая роль лектинов в растениях 13
1.1.3. Гормональная регуляция содержания лектинов в растениях 22
1.2. Общие сведения о цитоскелете растений 25
1.2.1. Микротрубочки 26
1.2.2. Микрофиламенты 29
1.2.3. Промежуточные филаменты 32
1.3. Кортикальный цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка как единый структурный поверхностный аппарат клетки 33
1.4. Фитогормоны и цитоскелет растений 40
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 47
2.1. Объекты исследования 47
2.2. Схема опытов 48
2.3. Выделение лектинов 51
2.4. Определение активности лектинов 53
2.5. Определение митотического индекса 55
2.6. Приготовление реагента Ярива 55
2.7. Регуляторы роста 56
2.8. Модификация компонентов цитоскелета в клетках растений 57
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 59
3.1. Влияние АБК на оризалин-индуцированные изменения активности лектинов 59
3.2. АБК-зависимые изменения активности лектинов у обработанных цитохалазином Б растений 65
3.3. Действие картолина на активность лектинов 72
3.4. Влияние картолина на активность лектинов оризалин-обработанных растений 77
3.5. Влияние картолина и АБК на митотический индекс и относительную длительность фаз митоза 81
3.6. Действие регуляторов роста на изменения митотической активности на фоне оризалина 87
3.7. Фракционный состав лектинов клеточной стенки 92
3.8. Изменения состава лектинов клеточной стенки в процессе низкотемпературного закаливания растений 96
Заключение 107
Выводы 111
Список литературы 112
- Гормональная регуляция содержания лектинов в растениях
- Кортикальный цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка как единый структурный поверхностный аппарат клетки
- Модификация компонентов цитоскелета в клетках растений
- АБК-зависимые изменения активности лектинов у обработанных цитохалазином Б растений
Введение к работе
Решение проблемы продуктивности, интродукции и акклиматизации растений тесно связано с изучением вопросов устойчивости растений к неблагоприятным условиям окружающей среды.
Как известно, абсцизовая кислота является медиатором при ответах
растений на низкие температуры, индуцирующим развитие
морозоустойчивости через изменение экспрессии генов и синтез новых белков [1,2,3]. Принимая во внимание высокую лабильность и чувствительность цитоскелета к различным физико-химическим факторам среды, предполагается, что цитоскелет может быть системой, воспринимающей как гормональные, так и низкотемпературные сигналы [4]. Благодаря интегральной роли в структурной архитектуре клеток, цитоскелет контролирует пространственно-временную организацию и координацию клеточного метаболизма в норме и при стрессе и, в конечном итоге, сохранение структурно-функциональной целостности клеток. В последнее время выдвигается гипотеза, согласно которой цитоскелетные белки и образуемые ими структуры - актиновые и тубулиновые филаменты - дифференцированно вовлекаются в развитие процессов холодовой адаптации: под влиянием АБК - на начальных этапах закаливания (сигнальная функция), а под действием низких температур - на более поздних его стадиях [5,6].
Новый этап в исследовании ответных реакций растительных клеток на воздействия окружающей среды связан с развитием представлений о том, что взаимодействия между цитоскелетом, плазмалеммой и клеточной стенкой играют ключевую роль в восприятии и проведении внешнего сигнала путем создания динамической механической связи из компонентов цитоскелета [7,8]. Несмотря на имеющиеся сведения о присутствии лектинов в клеточных стенках [9] и их зависимости от структурной целостности цитоскелета [10], практически ничего не известно о механизмах регуляции их активности и изменении состава при воздействии неблагоприятных условий внешней среды,
5 в частности низких температур. Изучению этих вопросов также должно способствовать использование антистрессового регулятора роста цитокининового типа действия картолина [11], повышающего устойчивость растений к различным неблагоприятным факторам [12,13,14], в том числе и к морозу [15,16,17].
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении зависимости между лектинами клеточной стенки и структурным состоянием цитоскелета при действии регуляторов роста в связи с низкотемпературным закаливанием растений озимой пшеницы.
Исходя из указанной цели, были поставлены следующие задачи:
исследовать влияние АБК на вызванные антицитоскелетными агентами (оризалин, цитохалазин Б) изменения активности лектинов клеточной стенки;
изучить действие картолина на активность растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов в норме и при реорганизации тубулинового цитоскелета;
сопоставить эффекты АБК и картолина на цитоскелет-индуцированные изменения активности лектинов у различающихся по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы;
выявить оризалин-индуцированные изменения митотической активности и длительности фаз митоза в корневых меристемах растений, обработанных АБК и картолином;
выделить лектины клеточной стенки, определить их молекулярную массу и полипептидный состав;
исследовать полипептидный состав и функциональную активность лектинов клеточной стенки в процессе низкотемпературного закаливания растений.
Научная новизна работы. Впервые показано, что АБК оказывает генотипически-обусловленное влияние на цитоскелет-опосредованное
6 повышение активности лектинов клеточной стенки, наиболее выраженное на фоне закаливания у маломорозоустойчивого сорта Безостая 1. По-видимому, экзогенная АБК необходима в качестве дополнительного к действию низких температур фактора, повышающего устойчивость растений к холоду через увеличение стабильности цитоскелета, лишь в тканях маломорозоустойчивого сорта.
Впервые обнаружено, что активность растворимых и связанных с клеточной стенкой лектинов сортоспецифически увеличивается при обработке картолином. Снижение эффекта оризалина на активность лектинов под влиянием картолина свидетельствует о его важной роли в регуляции стабильности микротрубочек.
Впервые охарактеризован полипептидный состав лектинов клеточной стенки. Показано, что через 0.5 ч гипотермии исчезали лектины с мол.м. 42.5 и 78 кДа и появлялись - с мол.м. 34.5, 37, 72 и 69 кДа, а также увеличивалось содержание арабиногалактановых белков. Появление лектина 69 кД, являющегося арабиногалактановым белком, в первые часы действия гипотермии и исчезновение его к концу холодового закаливания позволяет предположить участие этого белка в пусковых механизмах формирования защитных реакций клеток через повышение динамической нестабильности кортикального цитоскелета.
Практическая значимость работы. Выявление субклеточных и молекулярных механизмов адаптации и устойчивости растений к абиотическим стрессовым факторам среды представляет интерес при решении задач по созданию и скринингу новых сортов и форм растений, более приспособленных к нестабильным условиям среды. Установление коррелятивных зависимостей между изменениями физико-химической организации цитоскелета и лектиновой активности при низкотемпературном воздействии позволяет использовать лектины в качестве высокочувствительных цитоскелет-
7 зависимых биодиагностикумов, характеризующих термоадаптивный потенциал и морозоустойчивость растений разных генотипов озимой пшеницы.
Полученные данные могут быть использованы в учебном процессе при чтении курсов по физиологии и биохимии растений, фитострессологии и цитофизиологии растений.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме «Plant cytoskeleton: molecular keys for biotechnology» (Ялта, 1998), на пятой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999), на VII молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 2000), на международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке» (Сыктывкар, 2001), на Ш съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на международном симпозиуме «Plant cytoskeleton: functional diversity and biotechnology implications» (Киев, 2002), на V съезде общества физиологов растений (Пенза, 2003), на международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), на всероссийской конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004), на всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. В работе представлено 17 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 326 наименований, из которых 228 иностранных.
Гормональная регуляция содержания лектинов в растениях
Ввиду широкого распространения лектинов в растительных организмах, а также разнообразия выполняемых ими функций, в настоящее время актуальным является изучение механизмов регуляции их синтеза, структуры, свойств. При этом большое значение отводят действию гормонов на активность и содержание фитоагглютининов.
Показано влияние гибберелловой кислоты на экспрессию гена, кодирующего лектин БКСЗО массой 30 к Да. Данный белок синтезируется в корнях огурца (Cucumis sativus) и в дальнейшем транспортируется с ксилемным соком в надземные органы растения, где вовлекается в процессы регуляции роста и дифференцировки тканей листа [82].
Имеются данные о прочном связывании конканавалина А и гормонов ауксинового ряда [83], а лектина земляного гороха с гормонами цитокининовой природы [84]. Причем образование комплекса этих лектинов с цитокининами осуществляется не за счет углеводсвязывающих доменов [85]. Однако центр связывания лектинов бобовых с цитокининами пока не известен. Тем не менее, можно предположить, что комплекс лектины - цитокинины участвует в запасании гормонов и регуляции роста растений [86].
Однако имеются лишь отрывочные сведения о роли лектинов вместе с фитогормонами в регуляции роста растений. Участие в контроле индуцируемого ауксинами роста растений показано для многих фитолектинов, в том числе для АЗП [87]. Кроме того, выявлена четкая зависимость между конканавалином А и ИУК-индуцированным ростом гипокотилей и эпикотилей двудольных [88]. Возможно, фитоагглютинины влияют на содержание эндогенных фитогормонов, и их взаимодействие участвует в регуляции ростовых процессов. Так, обработка 4-суточных проростков пшеницы АЗП вызывала быстрое накопление в корнях АБК, индолилуксусной (ИУК), гибберелловой (ПС) кислот, а также цитокинина. Максимум транзитного накопления АБК приходился на 2 ч от начала воздействия лектина, тогда как повышение уровня ИУК и цитокининов было постепенным - с максимумом, приходящимся на 4 ч. Такие изменения нашли отражение в сдвиге баланса фитогормонов ИУК/АБК и цитокинины/АБК в сторону активаторов метаболизма клеток под влиянием АЗП, так, что к концу эксперимента значения этих коэффициентов превышало контрольные вдвое. По-видимому, в основе ростстимулирующего эффекта АЗП на корни проростков лежит перестройка под его влиянием гормональной системы растений [89].
В связи с тем, что разнообразные неблагоприятные воздействия окружающей среды индуцируют накопление АБК, можно предположить, что АЗП участвует в АБК-контролируемом спектре неспецифических защитных механизмов в ответ на стрессовые факторы различной природы. [90,91]. Действительно, стресс-индуцированное повышение эндогенного уровня АБК, также как и экзогенная обработка гормоном пшеницы приводит к многократному усилению синтеза и увеличению содержания АЗП. Имеются данные о АБК-зависимом накоплении АЗП в корнях проростков пшеницы при воздействии осмотического шока и засухи [35], в ответ на засоление среды [92], в культуре клеток при тепловом шоке [93], а также в развивающихся при дефиците влаги зерновках пшеницы [94], что позволяет отнести лектин пшеницы к участникам АБК-контролируемых неспецифических защитных реакций.
Вместе с тем, АЗП, по-видимому, нельзя отнести к стрессовым белкам, несмотря на то, что значительное АБК - индуцируемое накопление АЗП наблюдается в ответ на разнообразные неблагоприятные факторы среды. АЗП является белком, характерным для растений пшеницы на протяжении всего онтогенеза, причем его содержание значительно варьирует в процессе вегетации в нормальных условиях, что может указывать на участие других фитогормонов в регуляции его синтеза.
Ф.М. Шакировой с сотр. [78] была выявлена индукция накопления лектина пшеницы в корнях проростков под влиянием эпибрассинолида (ЭБ), гибберелловой кислоты (ГБ) и индолил-уксусной кислоты (ИУК), что указывает на существование альтернативных АБК путей гормональной регуляции содержания этого белка. Скорость индуцированного гормонами увеличения содержания АЗП, особенно при действии ГК, была вполне сопоставимой с действием экзогенной АБК, что дало основание предположить участие всех изученных гормонов в регуляции синтеза лектина пшеницы на уровне экспрессии его гена. Согласно данным анализа транскрипционной активности гена АЗП, все гормоны вызывали 2-3-кратную активацию синтеза лектиновых мРНК.
Интересно, что обработка проростков цитокининами и ауксинами приводила к кратковременному увеличению уровня АБК, причем накопление АБК предшествовало повышению содержания лектина в корнях, что свидетельствует об опосредованном через увеличение АБК влиянии этих фитогормонов на содержание АЗП. Вместе с тем, гибберелловая кислота и 24-эпибрассинолид не вызывают изменений в концентрации абсцизовой кислоты, что указывает на независимое от АБК участие этих гормонов в контроле содержания АЗП. Вероятно, ГК - и 2,4 эпибрассинолид индуцированное повышение уровня АЗП происходит за счет усиления экспрессии его генов и синтеза белка de novo. Тогда как АБК может участвовать в быстрой, независимой от транскрипции и трансляции, регуляции количественных изменений лектина что, по-видимому, имеет место при стрессовых воздействиях [78].
Кортикальный цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка как единый структурный поверхностный аппарат клетки
Сложный поверхностный аппарат растительной клетки представляет собой структурно и функционально сопряженную систему, ответственную за восприятие и трансдукцию сигналов внешней среды, в том числе и таких экстремальных факторов, как действие высоких и низких температур, водного и солевого стрессов. Это позволяет видеть в клеточной периферии сложный узел физиологического аппарата клетки, способный обеспечивать ее полифункциональность и адекватность ответных реакций.
Известно, что в растущих клетках параллельно кортикальным микротрубочкам с экстраплазматической стороны плазмалеммы откладываются микрофибриллы целлюлозы. При этом расстояние между микротрубочками приблизительно равно расстоянию между откладываемыми микрофибриллами [109]. При переходе к образованию вторичных утолщений клеточной оболочки в виде колец или спиралей микротрубочки собираются в группы-ленты, намечающие места будущих утолщений, и над этими лентами с противоположной стороны плазмалеммы начинают откладываться целлюлозные микрофибриллы, ориентирующиеся так же, как и микротрубочки [95]. Параллельное расположение внутренних микрофибрилл целлюлозы и микротрубочек послужило основанием для предположения, что последние каким-то образом контролируют ориентацию первых при их отложении. В пользу этого предположения свидетельствуют экспериментальные данные, показывающие, что во многих случаях обработка клеток ингибиторами микротрубочек вызывала нарушение ориентации целлюлозных микрофибрилл [110,95].
Согласно наиболее распространенной точке зрения [181,111], синтез целлюлозы и кристаллизация ее в микрофибриллы осуществляется на наружной поверхности плазмалеммы погруженными в мембрану мультиферментными комплексами. Существует предположение [181], что микротрубочки связываются с целлюлозосинтезирующими комплексами и осуществляют их перемещение по плазмалемме путем активного движения самих микротрубочек. Согласно другой точке зрения, направленное движение целлюлозосинтезирущих комплексов создается увеличением текучести липидов в узкой полоске плазмалеммы, расположенной над каждой микротрубочкой [95].
Также в литературе имеются сообщения о том, что положение актиновых филаментов совпадает с ориентацией целлюлозных микрофибрилл клеточной стенки. При переходе клетки к отложению вторичной оболочки в виде вторичных утолщений кортикальные микрофиламенты смещаются к местам этих утолщений вместе с микротрубочками [182,183]. Предполагается, что кортикальные микротрубочки, микрофиламенты и плазмалемма образуют единый структурно-функциональный комплекс, в котором коаксиальные актиновые филаменты контролируют ориентацию тубулиновых структур или стабилизируют их [184,182,183,185].
С другой стороны, клеточная стенка играет важную роль в стабилизации тубулинового цитоскелета: так, удаление клеточной стенки при выделении протопластов приводило к значительным перестройкам кортикальных микротрубочек [186]. Возможно, существуют трансмембранные белки, которые соединяют микротрубочки с целлюлозными микрофибриллами. Различные механические стрессы могут влиять на стабильность тубулиновых структур через такие трансмембранные белки [120]. Это позволило бы микротрубочкам воспринимать изменения клеточного роста через изменения в напряжении клеточной стенки и перестраиваться в соответствии с ними. Подтверждением того, что клеточная стенка стабилизирует тубулиновые филаменты, являются данные полученные Akachi с сотр. (1990) [187]. Эти исследователи установили, что экстенсии увеличивал устойчивость микротрубочек к холоду. Возможное объяснение этого заключается в том, микротрубочки присоединяются к белкам плазмалеммы, связанным с экстенсином.
Во многих растительных клетках найдены белки, способные «сшивать» элементы цитоскелета не только между собой, но также и с мембранными структурами [143]. В литературе обсуждается вопрос о существовании трансмембранных белков, связывающих элементы цитоскелета с клеточной стенкой [7].
Обнаружение у киназ клеточных стенок (WAKs) помимо трансмембранного и экстрацеллюлярного, Ser/Thr цитоплазматического домена, дало основание предполагать, что WAKs являются наиболее важными «линкерами» клеточной стенки и цитоскелета [188,189]. Показано, что фосфорилированная WAK1 Arabidopsis прочно связана с плазмалемма-ассоциированными пектинами клеточной стенки и выступает в качестве рецептора при эндоцитозе [188,190]. Интересн, что потеря клетками бора, который взаимодействует с RGII пектинами клеточной стенки, приводит к нарушению эндоцитоза пектинов и непосредственно влияет на структурное состояние цитоскелета [191]. Вероятно, бор играет важную роль в процессах, опосредованных взаимодействием клеточного матрикса и цитоскелета, в том числе и в трансдукции сигнала.
Благодаря сигнальным и адгезивным свойствам, предполагается что арабиногалактановые белки (АГБ), относящиеся к р-лектинам, могут осуществлять взаимодействие компонентов клеточного матрикса с плазматической мембраной и цитоскелетом [192]. В клетках BY-2 протопластов показано, что АГБ обладают способностью связываться как с пектинами клеточной стенки [193] , так и с WAKs [194]. Интересно, что мутанты по АГБ Sos5 характеризуются теми же свойствами, что и мутанты по актиновому цитоскелету [195], а также WAKs-мутанты [188,189], что свидетельствует о возможности участия АГБ в проведении сигнала от клеточной стенки к цитоскелету в цитоплазму.
Участие АГБ в цитоскелет-опосредованной передаче сигналов подтверждается и результатами ингибиторного анализа. Показано, что воздействие реагентом Ярива, связывающим углеводную часть АГБ, на клетки BY-2 приводило к дезорганизации и деполимеризации микротрубочек [196].
Интересно, что обработка ингибиторами полимеризации цитоскелетных филаментов и реагентом Ярива оказывает схожее действие на процессы роста и развития растений. Установлено, что обработка как латранкулином Б, так и реагентом Ярива приводила к ингибированию роста растяжением целого ряда растений [197].
Несмотря на то, что актин- и тубулинсвязывающие формины эукариот являются строго цитоплазматическими белками, в растительных клетках обнаружен формин I, содержащий экстрацеллюлярный и трансмембранный домен [198]. Показано, что экстрацеллюлярный участок растительных форминов I обладает высокой степенью гомологии к структурному белку клеточной стенки - экстенсину [199]. Предполагается, что формин I участвует во взаимодействии клеточного матрикса и цитоскелета, благодаря наличию высоко-консервативных актин-связывающих доменов FH1 и FH2 [198,199], а также оказывает влияние на полимерное состояние микрофиламентов [200,201]. В клетках растений обнаружен миозин VII, ассоциированный с плазмалеммой, который связывается, с одной стороны с каллозосинтазными комплексами [200], а с другой с элементами актинового цитоскелета. Вероятно, миозин VII выступает в качестве сенсора механических сигналов окружающей среды [202].
Модификация компонентов цитоскелета в клетках растений
В настоящее время не подвергается сомнению тот факт, что АБК выполняет в клетках растений роль триггерного сигнала, способствующего формированию механизмов адаптации к низким температурам через изменение экспрессии генов и синтез новых белков [257]. В тоже время вопрос о вовлечении АБК в развитие морозоустойчивости остается дискуссионным [258,3]. Предполагается, что низкие температуры и гормон индуцируют развитие морозоустойчивости различными путями [1]. В восприятии и трансдукции сигнала как от АБК, так и от низких температур ключевая роль принадлежит сложному поверхностному аппарату клетки, включающему клеточную стенку, плазмалемму и цитоскелет. Новый этап в изучении ответных реакций растительных клеток на воздействия окружающей среды связан с развитием представлений о том, что лектины и цитоскелет представляют единую структурно-функциональную систему, обеспечивающую адекватную реакцию на внешнее воздействие [259].
Так, введение в интактные ткани листьев и корней растений озимой пшеницы модификатора тубулинового цитоскелета оризалина приводило к сортоспецифичному увеличению активности лектинов клеточной стенки, что свидетельствует о зависимости активности лектинов от структурной целостности цитоскелета (рис. 1,2). В связи с этим можно предположить, что повышение или понижение стабильности микротрубочек будет приводить к соответствующим изменениям активности лектинов.
В наших экспериментах мы наблюдали АБК-опосредованное снижение чувствительности активности лектинов в корнях и листьях незакаленных растений к действию ингибитора полимеризации микротрубочек (рис. 1,2).
Причем реакция активности лектинов на действие гормона прямо коррелировала со степенью морозоустойчивости сорта. Так, наименьший эффект оризалина на фоне АБК наблюдался в растениях высокоморозоустойчивого сорта Альбидум 114, наибольший - у маломорозоустойчивого сорта Безостая 1. Уменьшение влияния оризалина на активность лектинов под действием гормона, вероятно, связано с тем, что абсцизовая кислота может принимать участие в стабилизации цитоскелетных структур, приводя к снижению сродства тубулиновых филаментов к деполимеризующим агентам. Эти результаты согласуются с данными иммуноцитохимических анализов, в соответствии с которыми обработка проростков озимой пшеницы гормоном значительно увеличивала количество полимеризованных микротрубочек в клетках оризалин - обработанных корней, при этом реакция тубулинового цитоскелета была также генотипически детерминированной [4].
В то же время, механизм стабилизирующего эффекта АБК на микротрубочки остается до конца невыясненным. Показано, что изменение ориентации микротрубочек от случайной и поперечной к наклонной и продольной коррелирует с увеличением стабильности тубулиновых структур к деполимеризующему действию оризалина [220]. Так, Сакияма и Шибаока (1990) [230] установили, что обработка эпикотилей гороха АБК приводила к повышению числа кортикальных микротрубочек с продольной ориентацией вместо поперечно-ориентированных, что отражалось на их стабильности.
Тонким механизмом, который участвует в изменении стабильности цитоскелета под действием АБК, может быть индуцируемое гормоном изменение содержания свободного Са [260]. Показано, что величина воздействия АБК на цитоплазматический Са2+ зависит от ее концентрации. Так, небольшие количества АБК (0-2 мМ) вызывали мгновенные увеличение содержания Са2+ в меристематических клетках корней арабидопсиса, а более высокие (10 мМ) - немедленное его снижение [261]. Суг с сотр. (1991) [262] установили, что изменение структурного и полимерного состояния тубулиновых филаментов опосредуется через ассоциированные с микротрубочками белки, активность и конформация которых регулируется концентрацией цитозольного Са через процессы фосфорилирования. Принимая во внимание, что мембранно-цитоскелетный комплекс является динамичной системой, чувствительной к уровню ионов Са [104], и связывание с компонентами цитоскелета ассоциированных с плазмалеммой белков регулируется наличием этих катионов, можно предположить, что эффект АБК, вероятно, опосредован изменением концентрации кальция.
Закаливание растений к холоду уменьшало восприимчивость активности лектинов клеточных стенок к оризалину в корнях и листьях Мироновская 808 и Альбидум 114 (рис. 1,2), тогда как в растениях сорта Безостая 1 эффект оризалина усиливался, особенно в листьях (рис.2). Аналогичные результаты были получены с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии [4]. Снижение чувствительности лектиновой активности к ингибитору полимеризации МТ корней и листьев закаленных проростков является отражением стабилизирующего влияния закаливания на тубулиновые структуры. Отмеченные различия в реакции активности лектинов отличающихся по морозоустойчивости сортов могут быть связаны с разной скоростью протекания адаптационных процессов.
При совместной обработке растений сорта Безостая 1 АБК и холодом в течение 7 суток была выявлена разнонаправленность их действия на оризалин-индуцированные изменения активности лектинов клеточных стенок. Низкие температуры усиливали эффект ингибитора полимеризации МТ на активность лектинов, тогда как в закаленных и обработанных гормоном растениях наблюдали уменьшение влияния оризалина (рис. 1,2). В корнях и листьях закаленных проростков Мироновская 808 эффект оризалина на лектиновую активность на фоне АБК также уменьшался, однако, в меньшей степени, чем в растениях маломорозоустойчивого сорта. Обработка растений Альбидум холодом и гормоном приводила к усилению чувствительности лектинов клеточной стенки к действию ингибитора полимеризации микротрубочек (рис. 1,2). Эти данные также согласуются с результатами иммуноцитохимического анализа [4].
Вероятно, экзогенная АБК необходима в качестве дополнительного к действию низких температур фактора, повышающего устойчивость растений к холоду через увеличение стабильности тубулинового цитоскелета, лишь в тканях маломорозоустойчивых сортов. Наблюдаемый нами эффект АБК на оризалин - индуцируемые изменения активности лектинов в закаленных к холоду растениях Альбидум 114 может быть обусловлен избыточной аккумуляцией гормона в клетках высокоморозоустойчивого сорта. Известно, что холодовое закаливание растений само по себе увеличивает содержание эндогенной АБК в большей степени в клетках устойчивых к низким температурам сортов озимой пшеницы [263]. Несмотря на то, что продолжительное закаливание приводит к снижению темпов накопления гормона, при добавлении экзогенной АБК ее содержание становится в клетках выше необходимого уровня, что вызывает деструкцию микротрубочек.
АБК-зависимые изменения активности лектинов у обработанных цитохалазином Б растений
Выращивание незакаленных растений на среде с картолином приводило к увеличению МИ. Митотическая активность корней под влиянием регулятора роста была наиболее высокой у сорта Альбидум 114 (табл.1). При этом картолин вызывал накопление телофаз и уменьшение доли профаз в незакаленных растениях сорта Мироновская 808 и Альбидум 114, тогда как относительное содержание остальных фаз митоза практически не изменялось. В клетках корней проростков сорта Безостая 1 обработка картолином приводила к увеличению числа профаз и метафаз и снижению относительной длительности метофазы и телофазы (рис.8).
Наблюдаемая нами реакция митотической активности корней на обработку картолином может быть связана с цитокининовой природой картолина. Так, обработка экзогенными цитокининами проростков кукурузы и Arabidopsis индуцировала деление и сокращала продолжительность клеточного цикла меристемы [298].
С другой стороны, согласно результатам, приведенным в главе 3.3, добавление в среду выращивания регулятора роста картолина приводило к возрастанию уровня лектиновой активности в корнях проростков всех исследуемых сортов. В то же время, в литературе широко обсуждается возможность участия лектинов в регуляции клеточного деления и, как следствие, в реализации ростовых процессов клеток [78]. Так, обработка клеток пшеницы АЗП, стимулировала деление их корней и ускоряла прохождение клетками митотического цикла. Вполне вероятно, что реакция меристемы корней незакаленных растений сорта Альбидум 114 на картолин может быть связана с наиболее значительным увеличением активности растворимых лектинов под действием данного препарата.
Добавление картолина в среду выращивания закаленных растений также приводило к повышению МИ всех трех сортов, особенно у Альбидум 114 (табл.1). В этих условиях происходило увеличение числа телофаз. Так, у Безостой 1 процент телофаз в контроле составлял 16% и 26% в варианте с картолином, у Мироновской 808 - 9% и 14%, у Альбидум 114 9% и 10% соответственно (рис.9).
Как известно, повышенная устойчивость растений к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и к низким температурам связана с накоплением АБК, скоростью изменения ее концентрации, а также повышенным уровнем ауксинов и цитокининов. Согласно литературным данным, обработка картолином на фоне низких температур тормозила резкое накопление АБК и предотвращала снижение уровня ИУК и цитокининов [78].
Вероятно, возрастание концентрации гормонов-активаторов под действием картолина поддерживает обмен веществ при действии стресс-факторов и создает предпосылки для восстановления роста и других физиологических процессов при репарации.
В то же время такой эффект картолина может быть опосредован влиянием лектинов на гормональный баланс растений при неблагоприятных условиях среды. Так, предобработка растений озимой пшеницы АЗП способствовала поддержанию интенсивности деления клеток корней проростков при гипотермии на уровне контрольного варианта, что сопровождалось накоплением цитокининов и ауксинов [78].
Таким образом, полученные нами результаты позволяют предположить, что картолин участвует в регуляции деления клеток корней проростков озимой пшеницы опосредовано через накопление лектинов и изменение гормонального баланса растений. Как известно, рост растений осуществляется за счет деления и растяжения клеток. Тубулиновые и актиновые филаменты, а также образующие их белки являются обязательными регуляторами морфогенетических процессов. При этом морфогенетическая роль микротрубочек заключается прежде всего в детерминации места и направления деления клетки [7,299]. В наших экспериментах наблюдали увеличение МИ в корнях проростков, инкубированных в течение 3 ч в оризалине (табл.1), что, вероятно, связано с образованием метафазно-анафазного блока. Внесение АБК в среду выращивания незакаленных растений полностью снимало оризалин-индуцированное увеличение МИ в корнях проростков сорта Мироновская 808 и уменьшало у Альбидум 114 и Безостаяі (табл.1). При этом наблюдалось увеличение числа анафаз и отсутствие телофаз в клетках корней Безостая 1. АБК вызывала увеличение числа клеток в стадии телофазы и сокращение всех остальных фаз митоза у Альбидум 114 и, особенно, в растениях сорта Мироновская 808 (рис.10), что, вероятно, связано с высокой фенотипической пластичностью данного сорта. По-видимому, АБК оказывает положительное влияние на структурное и полимерное состояние тубулиновых филаментов, что может способствовать уменьшению ингибирующего влияния оризалина на клеточный цикл растений озимой пшеницы. Так, обработка АБК проростков озимой пшеницы приводила к усилению агрегации цитоскелетных структур между собой и возрастанию их флуоресценции в клетках меристематической зоны [4]. Согласно данным Марка (1998) [300], именно повышение уровня агрегации тубулиновых компонентов является причиной увеличения их иммунофлуоресценции и стабильности в клетках. Обработка картолином незакаленных растений приводила к сортоспецифическому уменьшению влияния ингибитора полимеризации микротрубочек на митотическую активность (рис.8).
