Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1. Солеустоичивостьи влияние засоления на рост и водный обмен растений 6
1.2. Рост растений растяжением и водный обмен 15
1.3. Характеристика гормонов и их роль в регуляции роста и водного обмена у растений 25
1.3.1. Абсцизовая кислота 25
1.3.2. Ауксины 35
1.3.3. Цитокинины 41
2. Объект и методы исследования 47
2.1. Условия выращивания растений и проведения экспериментов 47
2.2. Методы исследования 47
2.2.1 Измерение роста растений 47
2.2.2. Определение осмотического давления 48
2.2.3. Определение устьичного сопротивления 48
2.2.4. Определение содержания воды 49
2.2.5. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 49
2.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ 50
2.2.7. Определение содержания гормонов в ксилемном соке 51
3. Результаты и их обсуждение 52
3.1. Быстрая ростовая реакция растений ячменя и пшеницы на засоление 52
3.1.1 Механизм торможения и возобновления роста при засолении. 55
3.1.2. Влияние засоления на физико-химические свойства листа. 60
3.1.3. Изменение осмотического потенциала под влиянием засоления 64
3.1.4 Роль транспирации и устьичной проводимости в регуляции водного обмена и ростовой реакции растений пшеницы и ячменя 67
3.1.5. Пониженная скорость роста у растений на фоне засоления 73
3.2. Влияние засоления на содержание гормонов у растений 74
3.2.1. Влияние засоления на содержание АБК в побегах и корнях растений 75
3.2.2. Влияние засоления на содержание ИУК в растущей зоне побегов ячменя и пшеницы 84
3.2.3. Влияние засоления на содержание цитокининов в растущей зоне побегов ячменя. 87
Выводы 94
- Рост растений растяжением и водный обмен
- Ауксины
- Методы исследования
- Влияние засоления на содержание гормонов у растений
Введение к работе
Актуальность. В современных условиях площади засоленных почв под воздействием различных антропогенных факторов постоянно возрастают. Неблагоприятные воздействия натрий-хлоридного засоления на растения определяются двумя факторами: (1) снижением доступности воды при низких значениях водного потенциала почвенного раствора; (2) токсическим действием ионов натрия и хлора (Строганов, 1962; Termaat and Munns, 1986). Воздействия этих факторов приводят к подавлению роста растений и, в конечном итоге, к снижению их урожайности. Поэтому исследования физиологических механизмов, обеспечивающих поддержание роста растений в условиях засоления, остаются актуальными (Marcelis and Van Hooijdonk, 1999; Fricke, 2002). Особый интерес представляет оценка скорости ростовых реакций молодых растений. Вследствие неравномерности распределения ионов и влаги в почве (Jackson et al, 1990) корни растений, которые растут с очень высокой скоростью (Иванов, 1988), время от времени попадают в очаги с повышенной концентрацией ионов. Быстрая ростовая реакция связана, прежде всего, с изменением скорости роста клеток растяжением, что, в свою очередь, зависит от обмена воды: испарения ее за счет транспирации через устьица листьев и притока из сосудов ксилемы поглощенной корнем воды. В связи с этим для понимания быстрой ростовой реакции необходимо изучать особенности влияния внешних факторов на водный обмен растений (Boyer et al, 1985; Tardieu et al, 2000; Hsiao et al, 2000). Важную роль в регуляции роста при засолении играет осморегуляция (Fricke and Peters, 2002). Рост клеток растяжением может зависеть и от состояния клеточной стенки растений (физической растяжимости ее полимеров, соединенных в трехмерную структуру, а также биохимических процессов, влияющих на прочность связи между этими полимерами) (Cosgrove, 1993). В последнее время разработаны подходы для оценки растяжимости клеточной стенки, которые позволили выявить ее роль в контроле ростового ответа на ряд внешних воздействий (Caderas et al., 2000). Известна роль гормонов в регуляции как водного обмена (Zhang,
4 Davies, 1989; Жолкевич, Пустовойтова, 1996), так и роста клеток растяжением (Cleland, 1971; 1980; Кулаева и др., 1984). Показано также, что засоление влияет на содержание гормонов в растениях (Таланова и др., 1993; Munns et al, 2002). АБК приписывается важная роль в регуляции роста при длительном действии засоления (Munns and Cramer, 1996). Однако роль гормональной системы в быстрой реакции растений на засоление не достаточно ясна. Вместе с тем в лаборатории, в которой выполнялась данная работа, было установлено участие гормонов в быстрой реакции на изменение температуры (Kudoyarova et al, 1998; Веселов и др. 2002) и при других воздействиях (Vysotskaya et al, 2003). Хорошо известно, что растения разных видов различаются между собой по степени солеустойчивости. Так по данным литературы растения ячменя являются относительно солеустойчивыми, в то время как растения твердой пшеницы - гораздо более чувствительны к действию соли (Строгонов, 1962; Rawson et al, 1988). Поэтому сравнительное изучение быстрых реакций на засоление у растений, различающихся по солеустойчивости, представляет особый интерес.
Все сказанное определило цель данной работы, которая состояла в том, чтобы изучить участие гормонов в быстрых реакциях, характеризующих водный обмен и скорость роста растений пшеницы и ячменя в условиях засоления.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
С помощью чувствительного датчика положения провести сравнительный анализ быстрой ростовой реакции листьев растений пшеницы и ячменя на добавление хлорида натрия в питательную среду.
Изучить влияние засоления на транспирацию, устьичную проводимость, содержание воды, осмотический потенциал, а также на растяжимость листа растений для того, чтобы оценить значение водного обмена и состояния клеточных стенок в ростовом ответе на данное воздействие.
Выявить динамику содержания гормонов (АБК, ИУК и цитокининов) в листьях, корнях и ксилемном соке растений при добавлении в питательный рас-
5 твор NaCl, что позволит выявить возможную роль гормонов в передаче сигналов из корня в побег.
4. Сопоставить данные по динамике роста, изменения содержания гормонов и показателей водного обмена, что позволит выявить регуляторную роль гормонов в приспособлении растений к засолению.
Научная новизна. Впервые показано, что возобновление роста на фоне засоления у растений пшеницы и ячменя связано со снижением устьичной проводимости и уменьшением потерь воды за счет транспирации. Обнаружено быстрое накопление АБК в листьях растений, что может быть фактором, обеспечивающим закрытие устьиц под влиянием засоления. При сопоставлении уровня притока гормона из корней с его накоплением в листе установлено, что накопление АБК в побеге происходит не за счет поступления гормона из корней с ксилемным соком. Впервые обнаружено быстрое накопление осмотически активных веществ в зоне роста растений под влиянием засоления, что может быть связано с быстрым увеличением содержания ИУК.
Практическая значимость работы. Обнаружен механизм, обеспечивающий устойчивость растений к кратковременному воздействию натрий-хлоридного засоления, основанный на быстром закрытии устьиц, что способствует снижению поступления ионов с транспирационным потоком и обеспечивает поддержание оводненности тканей за счет снижения потери воды в процессе транспирации. Этот эффект может быть использован при разработке биотеста с целью поиска химических регуляторов, способных повышать солеустойчивость растений, и проводить отбор солеустойчивых форм.
Апробация работы. Работа обсуждалась на Конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Creete, 2002), Ежегодной конференции Общества экспериментальной ботаники (Oxford, 2003), конференции молодых ученых в Пущино (май 2003, первая премия на секции экологической физиологии).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Рост растений растяжением и водный обмен
Таким образом, суммируя все сказанное в предыдущем разделе, можно отметить пристальное внимание исследователей к механизму действия засоления. Реакция на засоление проявлется достаточно быстро. В первую очередь это касается ростовой реакции. Поскольку нас прежде всего интересовала именно быстрая ростовая реакция, которая связана напрямую с водным обменом, в этой главе необходимо подробнее разобрать, от чего зависит рост растений растяжением. На рост растений влияют многие факторы окружающей среды, такие как: свет (Christ, 1978; Parrish and Wolf, 1983; Sattin et al., 1990; Passioura and Munns, 2000), влажность (Shackel et al., 1987; Waldron and Terry, 1987; Glifton-Brown and Jones, 1999), температура (Трунова и др., 1987; Шматько и др., 1989), доступность влаги (Acevedo et al., 1971; Hsiao and Jing, 1987; Thiel et al., 1988; Cramer and Bowman, 1991; Cramer, 1992; Neumann, 1993; Chazen and Neumann, 1994; Passioura and Munns, 2000), а также внутренние регуляторы роста, например, ауксины (Cleland, 1971; Полевой и Саламатова, 1977; Katou and Furumoto, 1986), цитокинины (Кулаева и др., 1984; Downes and Crowell, 1998) и гиббериллины (Cleland et al., 1968; Katsumi and Kazama, 1978). Рост побега обеспечивается делением и растяжением растущих клеток. Последнее происходит путем поглощения воды растущими клетками. В отличие от других живых организмов клетки растений могут сильно увеличиваться в размере в период растяжения. Их объем может увеличиваться в 50-500 раз. Например, в меристеме присутствуют мелкие клетки, чей объем не превышает 1000 микрометров, которые в дальнейшем дают начало клеткам разных размеров, например, клеткам ксилемы, с объемом, превышающим 600 000 микрометров. Такое значительное увеличение размера клеток происходит за счет увеличения объема вакуолей путем повышения содержания в них осмотически активных веществ и, как следствие, повышения способности клеток поглощать воду, и последующего растяжения клеточных стенок. В основном увеличение клеток в размере происходит за счет накопления в вакуоли различных солей. Итак, помимо участия в различных биохимических процессах вода также необходима растениям для поддержания роста. Однако лишь небольшая часть всей поглощаемой растением воды поступает в растущие клетки. Большая ее часть испаряется через устьица с поверхности листьев (транспи-рация).
На растениях ячменя, например, было показано, что количество воды, идущей на рост составляет всего 1% от транспирационного потока (Fricke, 2002). Для кукурузы этот показатель составил 2% (Tang and Boyer, 2002). Уравнение, описывающее скорость потока воды (г), идущей к растущим клеткам выглядит как (Lockhart, 1965): г = (ДЧ%(1),где Л1? - градиент водного потенциала АХР= V Ч р.к., где: Ч — водный потенциал источника воды (в данном случае, ксилемы) (МПа), Ч р.к. — водный потенциал растущих клеток (МПа), L - гидравлическая проводимость, показатель, характеризующий объем воды, который проходит за единицу времени через единицу поперечного сечения, если приложена разница водного потенциала в 1 МПа. Единицей измерения L является м х сек _1 х МПа"1. Исходя из представленного выше уравнения скорость поступления воды в клетку будет зависеть от градиента водного потенциала (ВП) между источником воды и растягивающейся клеткой, а также от суммарного сопротивления клеточных мембран и ксилемы на всем протяжении пути воды к клетке. Именно градиент ВП и определяет направление движения воды, которая всегда перемещается из области с высоким ВП (источник воды: почва, ксилема) в область с более низким ВП (клетки корня, растущие клетки). Объем потока воды, который направляется к устьицам зависит от разницы между ВП ксилемы и ВП дифференцированной ткани листа в области устьиц. В свою очередь, объем потока, поддерживающего рост, зависит от разницы между ВП ксилемы и ВП растущих клеток. Следовательно, от соотношения ВП дифференцированных и растущих клеток листа будет зависеть доля воды, которая идет на рост. Величина градиента водных потенциалов во многом зависит от уровня ВП ксилемы. ВП ксилемы имеет отрицательную величину у транспирирующих растений, но может быть нулевым или даже положительным в условиях отсутствия транспирации растений и зависит как от скорости транспирации, так и от ВП почвы (среды). Градиент ВП, необходимый для поддержания роста также зависит от ВП протопласта растущей клетки, который складывается из осмотического и гидростатического компонентов. Осмотическая составляющая водного потенциала протопласта определяется количеством солей, растворенных в вакуоли и объемом последней. Гидростатическое давление на уровне клетки представлено тургором, на уровне растения - транспирацией, поддерживающей отрицательное гидростатическое давление. Тургор клетки также зависит от объема протопласта и свойств клеточной стенки (Cutler, 1980). Дж. Бойер и Г. By (Воуег and Wu, 1978) в своих работах продемонстрировали, что элонгация гипокотилей сои, прежде всего, зависит от величины разности между водными потенциалами растягивающейся зоны и источника воды и меньше связана с абсолютной величиной ВП протопласта растягивающихся клеток.
Величина градиента ВП указывает, насколько скорость роста растения зависит от гидравлической проводимости тканей. Высокие значения градиента ВП были зарегистрированы для ткани гипокотиля (Nonami et al., 1997), а также листьев двудольных (Воуег, 1974) и однодольных (Fricke et al., 1997; Fricke and Flowers, 1998; Martre et al., 1999, 2001; Tang and Boyer, 2002). Однако имеется ряд работ, в которых показано, что величина данного градиента либо незначительна (Cosgrove and Steudle, 1981), либо он (градиент) вообще отсутствует (Malone and Tomos, 1992; Meahcheryakov et al., 1992). Следующим показателем, влияющим на скорость потока воды к растущим клеткам, является гидравлическая проводимость тканей. Гидравлическая проводимость (обратное понятие - гидравлическое сопротивление) складывается из проводимостей многочисленных мембран, которые преодолевает вода на пути от источника воды до клетки-мишени. Она подсчитыва-лась много раз в работах различных ученых (Molz and Boyer, 1978; Silk and Wagner, 1980; Cosgrove, 1985). Уровень гидравлической проводимости определяется, во-первых, способом транспорта воды в ткани, а, во-вторых, той движущей силой, которая поддерживает поток воды. Существует три основных пути транспорта воды по растению: апопластный (по клеточным стенкам), симпластный (по цитоплазме клеток, через плазмодесмы) и трансклеточный. В тех участках ткани, где клеточные стенки не содержат водоотталкивающих компонентов вода идет по апопласту. Например, клетки эпидермиса и коры корня, которые не содержат лигнина или суберина. Поэтому, какая-то часть воды, попадая в корень, может двигаться по апопласту. Благодаря присутствию в клеточной стенке сильно гидратированных полисахаридов, гидравлическое сопротивление такого пути минимально. Лигнификация клеточных стенок, например, клеток эндодермы корня (пояски Каспари), склеренхимы сосудистых пучков приводит к снижению их гидравлической проводимости. В таких случаях движение воды становится возможным только по симпластному или трансклеточному пути (Steudle, 2000). На долю апопластного транспорта приходится меньший объем по сравнению с симпластным и трансклеточным. При этом гидравлическая проводимость апопласта может в 100 раз превышать данный показатель для симпластного и трансклеточного пути (Steudle and Peterson, 1998). Вообще, транспорт воды по симпласту может начаться не только на уровне поясков Каспари, но и ближе к поверхности корня. Преимущество в движении воды по симпласту состоит в том, что на долю клеток приходится гораздо больший объем корня по сравнению с апопластом. Казанская школа специалистов по водному обмену приписывает симпластному транспорту очень важное значение (Анисимов и Раткович, 1992). Предполагается, что за счет работы сократительных белков вода может активно проталкиваться по симпласту за счет неких гипотетических устройств, напоминающих мышечные структуры сосудистой системы животных (Жолкевич и др., 1985)
Ауксины
Ауксины - гормоны, являющиеся производными индола. У растений ауксины синтезируются из триптофана или предшественников триптофана (индола или индолглицеролфосфата) в примордиях листьев, молодых листьях или развивающихся семенах. Л.Михальчук с сотрудниками (Michalczuk et al., 1992), изучая биосинтез ИУК в культуре клеток Daucus carota предположили, что растение может использовать, одновременно, как триптофан-зависимый, так и триптофан-независимый путь синтеза ИУК. Однако позже было показано существование определенной связи между путем биосинтеза ИУК и возрастом растений. Так, например, у 7-дневных проростков АгаЫ-dorsis thaliana более 50% всей ИУК синтезируется из триптофана, а уже через неделю данное количество составляло менее 10% (Normanly, 1997). К промежуточным метаболитам путей биосинтеза ИУК относятся шикимовая кислота, антраниловая кислота, триптофан, индолилпировиноградная кислота, индолилацетальдегид, индолилацетамид, индолилмолочная кислота (Bandurski et al., 1995; Bartel, 1997). Одним из наиболее активных ауксинов является р индолил - 3 - уксусная кислота (ИУК), или гетероауксин. В тканях все природные ауксины могут находиться как в свободной, так и конъюгированной форме, представляя собой сложные эфиры и амиды (например, 6-О-индолил-З-ацетилглюкоза или индолил-3-ацетшыпуо-инозитол). Конъюгированная форма гормона, вероятно, служит для постоянного пополнения пула свободных молекул ИУК. Конъюгаты ИУК различаются между собой по способности к гидролизу при действии ферментов растений и липофильностью, способствуя тем самым доставке ИУК в определенные ткани или даже клеточные органеллы (Cohen and Bandurski, 1982). Будучи в связанном состоянии ИУК также защищена от пероксидазного окисления (Cohen and Bandurski, 1978; Park and Park, 1987). Помимо непосредственно самой ИУК, растения содержат ряд соединений, также обладающих ауксиновой активностью. Однако в отличие от активной формы гормона все эти вещества проявляют свою биологическую активность в концентрации во много раз превышающей содержание ИУК.
Известно, что индолилацетальдегид, являясь ближайшим предшественником ИУК, обладает сходной с ней биологической активностью. Близкими по активности аналогами ИУК являются: нафтилуксусная кислота, 2,4 - дихлор-феноксиуксусная кислота, индолилмасляная кислота. До конца не выяснена роль обнаруженных у растений индолил-3-бутиловой кислоты (ИБК) и 4-хлор-индолил-3-уксусной кислоты (4-СІ-ИУК). Некоторые авторы предполагают, что ИБК может принимать участие в формировании корней растений (Epstein et al., 1986). Показано также наличие биохимической связи между ИУК и ИБК, которая проявляется в их взаимном превращении (ИУК-ИБК) (Epstein and Lavee, 1984; Ludwig-Muller and Epstein, 1991). Соединение 4-СІ-ИУК было обнаружено у растений, в основном относящихся к сем. Fabaceae, и в семенах сосны, причем в некоторых тестах активность данного соединения в 100 раз превышала активность самой ИУК (Reinecke et al., 1995). На растениях кукурузы было показано существование трех различных типов ауксиновых рецепторов, локализованных на мембранах эндоплазмати-ческого ретикулума (I), тонопласта (И) и самой плазмалемме (III), различающиеся различным сродством к отдельным формам гормона. Так, например, I и II тип рецепторов обладают большим сродством к 1 - NAA (нафтилуксус-ная кислота), тогда как III тип - к ИУК, 2,4 - D и 2 - NAA (Palme et al., 1991). 1.3.2.2. Роль ауксинов в растении. Относительно роли ауксинов известно, что они: 1. стимулируют растяжение клеток и рост осевых органов растений (Cleland, 1971; Полевой и Саламатова, 1977); 2. определяют апикальное доминирование, подавляя рост боковых побегов (Tamas, 1995); 3. замедляют процессы старения листьев (Reid, 1995; Gianfagna, 1995); 4. определяют распределение ассимилятов, воздействуя на флоэм-ный транспорт (Brenner and Cheikh, 1995); 5. участвуют в формировании фото - и гравитропизмов побегов и корней (Kaufman et al., 1995; Lomax et al., 1995); 6. стимулируют образование и рост корней растений (Krikorian, 1995). К числу остальных не менее важных функций ауксинов относится влияние их на дифференциацию проводящих тканей (Aloni, 1995), на созревание плодов (Ludfort, 1995) и цветение растений (Metzger, 1995). Ауксины и рост В настоящее время общепризнанно, что ИУК является активатором роста растяжением осевых органов. В частности было выяснено, что ауксин индуцирует увеличение растяжимости клеточных стенок, усиливает дыхание, синтез белков и нуклеиновых кислот и многие другие процессы (Холодный, 1956; Полевой, 1965; 1972; Key, 1969; Cleland, 1971; Ray, 1974). А.Хагер и сотрудниками (Hager et al., 1971) предположили, что действие ауксина на рост осуществляется через регуляцию кислотности клеточной стенки, а именно путем активации протонного насоса, выкачивающего ионы из цитоплазмы в клеточную стенку. Активированная ауксином Н - помпа увеличивает концентрацию Н в участке стенки, примыкающем к плазма-лемме; подкисление активирует ферменты, изменяющие пластичность клеточной стенки, а это в свою очередь способствует росту клетки растяжением (Полевой и Саламатова, 1977). А.Хагер и сотрудниками (Hager et al., 1971) предполагали, что ауксины активируют ЇҐ - АТФазу, локализованную в плазматической мембране клеток. Однако российскими исследователями (Полевой и Саламатова, 1975) было показано, что в основе ауксин - зависимой протонной помпы лежит не АТФаза, а редокс - цепь.
Предполагается, что ауксин увеличивает пропускную способность редокс - цепи в плазмалемме, которая, взаимодействуя с редокс - цепью митохондрий функционирует как протонная помпа (Полевой и Саламатова, 1977). Многочисленными работами было показано, что ингибиторы дыхания и окислительного фосфорилирования, а также ингибиторы синтеза белка полностью подавляли выделение Н4" растительными тканями и ингибировали их рост (Полевой и Саламатова, 1973; Marre et al., 1973; Rayle, 1973; Cleland, 1980). В исследованиях Дж.Кросс с сотрудниками (Cross et al.u 1978) показано, что ауксины не связываются непосредственно с АТФазой, из чего можно предположить существование определенной цепи в передаче сигнала от аук-синсвязывающих белков протонной помпе. Основными способами активации протонной помпы ауксинами являются: 1) фосфорилирование АТФазы ауксин - чувствительными протеинкиназами. В свою очередь протеинкиназы могут активироваться повышением уровня диацилглицерола или ионов Са2+ в цитоплазме клетки (Ettlinger,1988; Felle, 1988; Gehring,1990). G - белок также может способствовать активированию протеинкиназ; 2) синтез некоторых типов фоосфолипидов, осуществляющийся под действием активированных ауксинами фосфолипаз (Cleland, 1995). В.Полевой и Т.Саламатова (Полевой и Саламатова, 1977) предложили следующую общую схему действия ИУК: ИУК, взаимодействуя с рецептором в клеточной мембране, активирует ІҐ - помпу, в результате чего подкисляется и размягчается клеточная стенка. Кальций клеточных стенок, вытесняемый ионами ЬҐ, поступает в цитоплазму и способствует секреции через плазмалемму содержимого везикул аппарата Гольджи, и в результате в клеточную стенку поступают "блоки" для ее синтеза. Одновременно ИУК взаимодействует с другим рецептором, который, играя роль "фактора транскрипции", активирует синтез РНК в ядрах. Возможно, оба процесса взаимосвязаны: синтез РНК усиливается настолько, насколько возрастает функциональная активность мембран, и служит для пластического обеспечения роста растяжением. Несколько иная схема действия ауксина на Н - насос была предложена Е.Марре (Магге, 1977). Ее отличие касается локализации первичного рецептора ИУК и природы протонной помпы. Согласно этой схеме, первичные рецептор ИУК находится на мембране эндоплазматического ретикулуму, протонная помпа представляет собой АТФазу. В реакциях, приводящих к действию ИУК на систему обмена Н7К+, участвует короткоживущий белок, синтезируемый короткоживущей РНК. ИУК индуцирует синтез этого белка, необходимого для ее физиологического действия (Cleland, 1971). О локализации рецептора ИУК на мембране эндоплазматического ретикулума свидетельствуют также данные, полученные П.Реем (Ray, 1977).
Методы исследования
Для регистрации роста использовали аналоговый индуктивный электромеханический датчик перемещений, представляющий собой измеритель- ный дифференциальный линейный трансформатор с подвижным сердечником (Дедов, 1997). Механическая связь сердечника с верхним концом побега растения осуществлялась с помощью тонкой лавсановой нити (диаметр 0,1 мм), перекинутой через одношкивный блок. Измерительный сигнал датчика непрерывно записывали на самопишущем приборе типа КСП- 4. 2.2.2. Определение осмотического давления Осмотическое давление определяли отдельно для растущей и дифференцированной зоны листа. Собранный материал, в среднем по 7 - 10 растений на каждую точку, сначала замораживали, а затем оттаивали. С помощью обычного шприца выдавливали клеточный сок и его осмотический потенциал определяли с помощью осмометра по температуре замерзания. Предварительную калибровку прибора производили стандартными растворами NaCI в концентрациях: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 и 0,5 М. 2.2.3. Определениеустьичного сопротивления Устьичную проводимость растений определяли с помощью автоматического порометра МкЗ (Англия). Принцип измерения устьчной проводимости состоит в том, что узкая листовая камера, содержащая датчик относительной влажности воздуха, прижата к листовой поверхности растения и водяной пар, испускаемый во время транспирации повышает относительную влажность воздуха в пределах листовой камеры. Прибор автоматически регистрирует продолжительность времени (АТ5»/0) повышения относительной влажности в камере в фиксированном интервале значений от номинального заданного уровня до +5%. Предварительную калибровку проводили с помощью специальной пластины, содержащей набор отверстий известными диффузионными сопротивлениями. По результатам калибровки строился калибровочный график в координатах "сопротивление - показания прибора", используя известное сопротивление каждой группы отверстий. По показаниям прибора и полученному калибровочному графику вычислялось устьичное сопротивление растений. 2.2.4. Определение содержания воды Содержание воды (СВ) в растущей и дифференцированной зоне листа расчитывали по формуле: СВ = [(FW-DW)/FW] х Ю0%, где FW — сырой вес, DW — сухой вес, TW — тургорный вес. Относительное содержание воды (ОСВ) определяли для дифференцированной части первого листа пшеницы и третьего листа ячменя по формуле: ОСВ = [(FW - DW)/(TW - DW)] х 100%; Сырой вес определяли сразу после отделения дифференцированной части листа, после чего листья помещались в камеру, насыщенную парами воды. На следующий день листья взвешивались для определения тургорного веса. Сухой вес определяли после высушивания побегов при температуре 70С. Дефицит воды в тканях растений оценивали как (100-ОСВ) %. 2.2.5.
Экстракция, очистка и концентрирование гормонов Для определения содержания гормонов растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80 %-ным этанолом. Спиртовой экстракт отделяли центрифугированием и упаривали до водного остатка. Цитокинины, содержащиеся в аликвоте водного остатка, концентрировали на картридже С-18, с которого их элюировали, пропуская через картридж 5 мл 80 %-ного этанола. После упаривания спирта досуха образец растворяли в минимальном объеме 80 %-ного спирта и наносили на пластину для тонкослойной хроматографии (ТСХ), которую проводили в системе растворителей бутанол: аммиак: вода (6:1:2). Положение на хроматограмме зеа-тина, его рибозида и нуклеотида определяли с помощью соответствующих метчиков. После элюции гормонов в течение ночи из соответствующих зон фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) их содержание определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Экстракцию АБК и ИУК из аликвоты водного остатка проводили после его подкисления до рН 2-3 1 н HCI дважды диэтиловым эфиром в соотношении 1:5 (органическая фаза/водная фаза). Из объединенной органической фазы АБК реэкстрагировали 1 %-ным гидрокарбонатом натрия, взятым в соотношении 1:3 (водная фаза/органическая фаза). Органическую фазу отделяли и отбрасывали, а из водной (после подкисления до рН 2-3) вновь дважды извлекали гормон диэтиловым эфиром и метилировали их диазометаном (Кис-лин и др., 1985). 2.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ Иммуноферментный анализ проводили в лунках полистеролового планшета. На первом этапе конъюгат гормона сорбировали на твердой фазе в течение 1,5 ч при 37 С. После 3-кратной промывки физиологическим раствором, содержащим 0,05 % твина 20, в лунки вносили антисыворотку к гормону, разведенную физиологическим раствором, содержащим 0,5 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05 % твина 20, вместе с раствором стандарта гормона или растительным экстрактом. После инкубации в течение 1 ч при 37 С количество антител, специфически связанных на планшете, определяли с помощью бараньих антител против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой. Для оценки активности пероксидазы использовали смесь следующего состава: 0,4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,06 М фосфатном буфере рН 5,3, содержащим 0,006 % перекиси водорода. Оптическую плотность раствора после фиксации серной кислотой измеряли на микрофотометре (Titertek Uniscan) при 492 нм. 2.2.7. Определение содержания гормонов в ксилемном соке Для определения содержания гормонов в ксилемном соке у растений отрезали надземную часть и оставшееся основание побега (15-20 мм) вместе с корневой системой прикрепляли к прибору. Создаваемое вакуумным насосом отрицательное давление (-0,6 МПа) приводило к поднятию ксилемного сока растений по капилляру. Для сбора ксилемного сока брались контрольные и опытные растения (через 15 минут после начала засоления). Ксилем-ный экссудат собирали каждые 15 минут в предварительно взвешенные пластиковые пробирки типа Eppendorf. Концентрацию гормонов в корневом экссудате измеряли с помощью ИФА. Скорость поступления АБК из корней в побег рассчитывали по формуле Vn= С Утр, где Vn- скорость доставки АБК из корней (нг АБК/растение в час), С - концентрация АБК в ксилемном соке (нг/мкл пасоки), а Утр - скорость транспирации (мкл воды/растение в час) (Jackson, 1993).
Влияние засоления на содержание гормонов у растений
На сегодняшний день хорошо известно, что основным стрессовым гормоном растений является АБК (Кефели и др., 1989; Шакирова и Безрукова, 1998; Zeevaart, 1999). Имеется большое количество работ, посвященных изучению роли АБК при воздействии водного дефицита на растения. В частности, показано влияние АБК на работу устьичного аппарата (Mansfild and MsAinsch, 1995), осмотическое приспособление (Griffiths et al, 1996), рост растений (Cramer et al., 1998). В связи с этим представляло большой интерес посмотреть, каким образом наблюдаемое изменение роста растений при засолении питательного раствора связано с изменением содержание АБК в побегах и корнях растений ячменя. 3.2.1. Влияние засоления на содержание АБК в побегах и корнях растений. Содержание АБК в побеге растений ячменя определяли отдельно для его растущей (зоны: А - 0 -20 мм и В - 20 - 40 мм от основания листа) и дифференцированной (зона D — центральная часть листовой пластинки) части. В побегах пшеницы также разделяли растущую зону 0 — 40 мм от основания листа и дифференцированную зону - центральная часть листовой пластинки. Исследования показали, что добавление NaCI в питательную среду приводило к увеличению содержания АБК как в побегах, так и в корнях растений ячменя и пшеницы (рис. 13, 14). Причем, отмеченное накопление АБК у опытных растений происходило очень быстро и достигало высокого уровня. Реакция растений ячменя. В побегах ячменя уже через 10 мин после начала воздействия содержание АБК в растущей зоне В опытных растений превышало содержание ее у контрольных растений в 6 раз и оставалось на этом же уровне в течение последующих 20 мин. Следует отметить, что данная растущая зона, характеризуется максимальной относительной скорость роста (Fricke, 2002). При действии засоления в зоне А растений ячменя также было отмечено постепенное накопление АБК в течение часа после воздействия, но здесь ее содержание оставалость ниже, чем в зоне В.
Что касается дифференцированной зоны (D) третьего листа растений ячменя, то мы наблюдали первичное накопление АБК уже через 10 мин после начала воздействия (36 нг/г сухого веса и 120 нг/г сухого веса у контрольных и опытных растений, соответственно), после чего содержание ее у опытных растений постепенно снижалось и через час после воздействия составляло 61 нг/г сухого веса. Несмотря на то, что накопление АБК происходило также и в дифференцированной зоне листа и в корнях, тем не менее, концентрация АБК в растущей зоне и через 10 мин, и через 30 мин после за- соления превышала ее содержание в остальных частях растения. И только через 1 час после начала воздействия концентрация АБК в растущей зоне начинала снижаться и уже незначительно отличалась от концентрации ее в других частях растения. Измерение содержания АБК в корнях показало, что у контрольных растений оно составляло 12—14 нг/г сухого веса. Самое значительное накопление АБК в корнях опытных растений было зафиксировано через 10 мин после начала засоления и составило 61+13 нг/г сухого веса, а уже через 20 мин концентрация АБК в корнях снизилась до 22 нг/г сухого веса, т.е. более чем на 50%. Содержание АБК в корнях растений ячменя как после 2, так и после 20 часов на фоне засоления уже практически не отличалось от уровня контрольных растений. В дальнейшем, содержание АБК во всех частях побега (и в растущей, и в дифференцированной) и в корнях снижалось, и уже через 2 часа после начала засоления было примерно на уровне контрольных растений. Реакция растений пшеницы. Как в побегах, так и в корнях растений пшеницы наблюдалось увеличение содержания АБК при засолении питательного раствора (рис.14). Подобно растениям ячменя повышение уровня АБК в побегах растений пшеницы при засолении питательного раствора было количественно более выражено в растущей зоне листа. В растущей зоне побегов пшеницы содержание АБК увеличивалось в 4 раза через 15 минут после добавления в их питательную среду хлорида натрия. В дальнейшем содержание ее в данной растущей зоне снижалось с 395,5 нг/г до 181,5 нг/г (к 1ч) и до 158,5 нг/г (к 2ч), но по-прежнему оставалось выше, чем содержание АБК в растущей зоне побегов контрольных растений пшеницы. В дифференцированной зоне листа растений пшеницы через 15 минут после засоления питательного раствора было отмечено накопление АБК примерно в 3 раза по сравнению с контрольными растениями. Устьичная проводимость второго листа после начала воздействия снижалась постепенно и к 45 мин уменьшилась лишь на 19 ммоль м"2 сек 1. В тоже время резкое падение устьичной проводимости в третьем листе побега отмечалось уже через 10 мин после засоления на 33 ммоль м"2 сек"1. Известно также, что фитогормоны, в частности, АБК способны регулировать экспорт веществ из листьев. И.Киселева и О.Каминская (2002) предположили, что уровень АБК регулирует соотношение путей использования продуктов фотосинтеза в листе.
Так, высокое содержание этого гормона коррелировало с пониженной экспортной функцией. Эти данные литературы дают нам основание полагать, что повышение уровня АБК в листе при засолении могло способствовать использованию ассимилятов для собственных нужд листа (например, обеспечивая осморегуляцию). Изучение адаптивных реакций растений при действии различных стрессовых факторов показало, что АБК способна играть ключевую роль в регуляции неспецифической устойчивости растений (Таланова и др., 1993). В литературе уже описана способность АБК накапливаться в побеге в течение нескольких минут после стрессового воздействия (Blatt, 1990). Однако по-прежнему нет единого мнения относительно того, что является источником повышенного содержания АБК в побеге. Многие исследователи придерживаются мнения, что в случае влияния водного дефицита, основным источником АБК, которая накапливается в побеге являются корни (Davies and Zhang, 1991; Ribaut and Pilet, 1991; Griffiths et al, 1996). Увеличение поступления АБК из корней также наблюдали и под влиянием засоления (Munns et al., 2001). Однако этот эффект был обнаружен только через сутки после начала воздействия соли. В наших исследованиях также было интересно посмотреть, что является источником накопления АБК в побеге. Итак, в наших экспериментах самое значительное накопление АБК как в растущей, так и в дифференцированной зоне побега наблюдалось уже через 10 минут после начала воздействия соли. Если исходить из того, что накапливающаяся в побеге АБК приходит из корней, то содержание ее в ксилемном соке к этому времени тоже должно увеличиться. Измерение содержания АБК в ксилемном соке через 10 минут после засоления показало, что, несмотря на то, что содержание АБК в корнях опытных растений увеличивается в 5 раз, концентрация ее в ксилемном соке остается почти неизменной и составляет 17,8 + 1,9 и 19,5 + 2,1 нг/мл в контроле и опыте, соответственно. По мнению М.Джексона (Jackson, 1993) нельзя ограничиваться одной информацией о концентрации гормона в ксилемном соке, как это делают многие исследователи. Поскольку большое число воздействий влияет на скорость транспирации, изменение концентрации гормона в ксилемном соке может быть следствием его разбавления или концентрирования. При этом доставка гормона может оставаться постоянной. Так, например, при засухе скорость транспирации снижается.
