Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Окислительный стресс 9
2.1.1. Генерация активных форм кислорода 9
2.1.2. Сенсоры АФК 16
2.1.3. Антиоксидантная защита 18
2.1.3.1. Классификация антиоксидантной системы 19
2.1.3.2. Антикислородная система защиты 23
2.1.3.3. Антирадикальная система защиты 24
2.1.3.4. Антиперекисная система защиты 35
2.1.4. Роль пероксидазы и СОД в регуляции редокс-статуса 45
2.2. Центральная вакуоль клеток растений 48
2.2.1. Вакуолярное содержимое 49
2.2.2. Вакуолярная мембрана - тонопласт 50
2.2.3. Функции центральной вакуоли 54
2.2.4. Антиоксидантная система вакуолей клеток растений 59
2.3. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования 62
3. Объект и методы исследования 65
3.1. Растительный материал 65
3.2. Выделение органелл 66
3.2.1. Метод выделения вакуолей 66
3.2.2. Выделение пластид 68
3.2.3. Выделение ядер 68
3.2.4. Выделение митохондрий 69
3.3. Оценка степени загрязнения изолированных органелл 70
3.3.1. Оценка степени загрязнения фракции вакуолей 70
3.3.2. Оценка степени загрязнения фракций пластид и митохондрий .70
3.4. Получение водных экстрактов из ткани корнеплода и выделенных органелл 71
3.5. Метод определения белка по Бредфорд 72
3.6. Определение активности супероксиддисмутазы 72
3.7. Определение активности пероксидазы 73
3.8. Электрофоретические методы определения активности ферментов 74
3.8.1. Электрофорез нативных белков 74
3.8.2. Изоэлектрофокусирование белков 75
3.8.3. Визуализация активности СОД в ПААГ 75
3.8.4. Определение активности пероксидазы в ПААГ 76
3.8.5. Определение активности каталазы в ПААГ 76
3.9. Статистическая обработка данных 76
3.10. Использованные реактивы 76
4. Результаты исследования 77
4.1. Определение чистоты фракции вакуолей 77
4.2. Исследование супероксиддисмутазы во фракциях изолированных органелл 79
4.2.1. Идентификация супероксиддисмутазы в вакуолях 79
4.2.2. Идентификация активности супероксиддисмутазы в пластидах, ядрах и митохондриях 83
4.3. Исследование во фракциях изолированных вакуолей ферментов, утилизирующих перекись водорода 85
4.3.1. Идентификация каталазы в вакуолях 85
4.3.2. Идентификация и исследование активности пероксидазы во фракциях изолированных вакуолей 86
4.3.3. Исследование способности пероксидазы окислять бетацианины вакуолей корнеплодов свеклы 90
4.4. Динамика активности и изменение изоферментного состава СОД и пероксидазы в зависимости от стадии развития растения 92
4.4.1. Активность и изоферментный состав СОД в онтогенезе растения 92
4 4.4.2. Активность и изоферментный состав пероксидазы в онтогенезе растения 94
4.5. Динамика рН клеточного сока корнеплодов в онтогенезе растения .102
4.6. Динамика активности ферментов и изменение изоферментного состава в зависимости от стрессовых условий 103
4.6.1. Активность и изоферментный состав СОД и пероксидазы при абиотическом стрессе 103
4.6.2. Активность и изоферментный состав СОД и пероксидазы при биотическом стрессе 108
5. Обсуждение 113
6. Заключение 135
7. Выводы 137
8. Список использованной литературы 138
- Роль пероксидазы и СОД в регуляции редокс-статуса
- Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования
- Получение водных экстрактов из ткани корнеплода и выделенных органелл
- Исследование способности пероксидазы окислять бетацианины вакуолей корнеплодов свеклы
Введение к работе
Растительные организмы в силу особенностей своего существования вынуждены постоянно приспосабливаться к действию стрессорных факторов абиотического и биотического происхождения. Воздействие различных факторов зачастую интегрируется в растительной клетке в ответную реакцию сверхпродукции активных форм кислорода (АФК), приводящую к развитию окислительного стресса. Возникающие при окислительном взрыве АФК, с одной стороны вовлекаются в окислительные реакции, выполняют защитные и сигнальные функции, с другой стороны могут быть источником повреждения клеточных структур. Поэтому в клетках осуществляется защита от избыточного кислорода и его активных форм с помощью различных компонентов антиоксидантной системы.
Система детоксикации активных форм кислорода у растений представлена низко- и высокомолекулярными соединениями. Компоненты антиоксидантной системы, особенно ферменты-антиоксиданты вызывают наибольший интерес и активно изучаются. Особое внимание уделяется таким ферментам, как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза и пероксидаза, поскольку они стоят на первых рубежах защиты от АФК. Так, СОД с высокой скоростью катализирует дисмутацию супероксидрадикалов с образованием пероксида водорода (Бараненко, 2006). В свою очередь перекись водорода нейтрализуется каталазой и пероксидазами (Газарян и др., 2006). Однако каталитический цикл пероксидутилизирующих ферментов может находиться в различных редокс-состояниях. Поэтому пероксидаза, например, способна проявлять оксидазную активность, что приводит к образованию супероксида и перекиси водорода (Минибаева, Гордон, 2003). Имеются данные, что Си,2п-СОД может обладать пероксидазной активностью (Liochev, Fridovich, 2004; Kim et al., 2006). Таким образом, пероксидаза и СОД являются не только ферментами антиоксидантной системы защиты, но и редокс-ферментами. Они поддерживают концентрацию АФК в клетке на физиологически допустимом уровне, т.е. осуществляют контроль редокс-статуса клетки. Следует отметить, что в
7 настоящее время СОД и пероксидазы активно исследуются в таких клеточных структурах, как пластиды, митохондрии, пероксисомы, клеточные стенки и т.д. (Бараненко, 2006; Газарян и др., 2006). В тоже время, обращает на себя внимание слабый интерес к этим ферментам у центральной вакуоли.
О пероксидазе и СОД вакуолярной локализации мало сведений, как и об остальных ферментах антиоксидантной системы вакуолей. Если еще можно встретить информацию о пероксидазе центральной вакуоли (вакуолярного сока и тонопласта) (Газарян и др., 2006; Andrews et al., 2002), то о СОД вакуолярного происхождения практически ничего не известно (Ogawa et al.,
1996; Carter et al., 2004). До сих пор обсуждение локализации этого фермента в вакуолях носит предположительный характер.
Указанные вопросы являются важным звеном в изучении антиоксидантних систем центральной вакуоли. Работа в направлении решения этих вопросов представляется интересной и необходимой, поскольку полученные результаты позволят сформировать представление о функционировании в вакуолях редокс-системы, вовлечении ее в ответые защитные реакции клетки и в поддержание внутриклеточного редокс-гомеостаза.
Поэтому настоящая исследовательская работа была посвящена изучению ферментативной системы антиоксидантной защиты у центральной вакуоли клеток растений. Поскольку вопрос о присутствии СОД в этом компартменте оставался открытым, основные усилия были направлены на идентификацию СОД в вакуолях, и изучение динамики ее активности и изоферментного состава. Известно, что эффективное функционирование СОД в клетках растений в значительной степени определяется функционированием пероксидутилизирующих ферментов - каталазы и пероксидазы. В связи с этим представлялось интересным и необходимым исследовать вакуолярные ферменты, способные удалять перекись водорода.
В результате были получены новые данные о ферментах антиоксидантной системы вакуолей. В частности, установлено, что центральная вакуоль, как и другие компартменты клеток растений, содержит
8 супероксиддисмутазу. СОД вакуолярной локализации - Си^п-СОД, представленная несколькими изоформами. Из ферментов, утилизирующих перекись водорода в вакуолях на сегодня выявлена гваяколовая пероксидаза.
Идентифицированные в вакуолях корнеплодов свеклы {Beta vulgaris L.) Си,гп-СОД и пероксидаза изменяли свою активность и изоферментный состав в стрессовых ситуациях, в связи с чем сделано заключение, что ферменты вакуолярной локализации могут быть частью системы антиоксидантной защиты клетки.
Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, кандидату биологических наук Елене Владимировне Прадедовой за постоянное внимание, всестороннюю помощь в работе и ценные замечания при написании рукописи. Сердечная благодарность за помощь в работе научному руководителю лаборатории члену-корреспонденту РАН Рюрику Константиновичу Салясву и доктору биологических наук Наталье Игоревне Рекославской. Кроме того, автор благодарит сотрудников лаборатории физиологии растительной клетки и института за обсуждение результатов, за дружеское участие и поддержку.
9 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Роль пероксидазы и СОД в регуляции редокс-статуса
Поддержание физиологического редокс-статуса внутри клеток играет существенную роль во многих процессах, например, таких как синтез ДНК, экспрессия генов, ферментативная активность и т.д. Избыток АФК, образующихся под действием различных стрессоров, может вызывать в растительных клетках нарушение редокс-гомеостаза. Например, повышение концентрации АФК, способно приводить к изменению редокс-состояния клетки за счет окисления молекул GSH. Взаимодействие GSH и АФК может быть, как прямым, так и опосредованным (GSH восстанавливает окисленные молекулы). Поэтому при окислительном стрессе отмечается активизация глутатион-зависимых антиоксидантных систем (ферментов аскорбат-глутатионового цикла, глутатион-8-трансферазы, глутатионпероксидазы и т.д.), снижающих уровень GSH и изменяющих, тем самым, соотношение GSH/GSSG. С другой стороны, большую роль в редокс-регуляции играет процесс модификации сульфгидрильных групп в белках, в который также вовлечены АФК и тиолсодержащие молекулы, в том числе GSH. Таким образом, многие клеточные процессы, регулируемые АФК, сопровождаются модуляцией уровня редокс-статуса глутатиона (Октябрьский, Смирнова, 2007).
Главную роль в регуляции редокс-состояния клетки из всех АФК играет НоСЬ. Внутриклеточная концентрация перекиси водорода, используемая клетками для регуляторных целей, находится в очень узком диапазоне от 1 до 700 нМ. Если концентрация Н2О2 превышает 1 мкМ, то она токсична для клеток (Октябрьский, Смирнова, 2007). Как упоминалось выше, образование перекиси водорода в растительных клетках происходит в результате контакта Ог с восстановленными компонентами электрон-транспортных цепей фотосинтеза и дыхания, а также в некоторых ферментативных реакциях, протекающих в пластидах, митохондриях, цитозоле, пероксисомах и апопласте. Особый интерес вызывает образование Н202 в апопласте. Это обусловлено тем, что именно продукция АФК на уровне плазмалеммы играет ключевую роль в сигналинге при воздействии биотических и абиотических стрессоров, а также в некоторых процессах роста и развития. На плазмалемме локализована одна из наиболее мощных систем генерации АФК в растительной клетке, а именно, НАД(Ф)Н-оксидаза (Asai et al., 2008). У животных найдено пять изоформ этого фермента, выполняющих разные функции в разных тканях и органах (Geiszt, 2006; Brandes, Kreuzer, 2005; Ushio-Fukai, 2006). А НАД(Ф)Н-оксидазу растений определяют как RBOH (respiratory burst oxidase homolog). Этот фермент является гомологом фагоцитарной каталитической субъединицы gp91phox животных (Sagi, Fluhr, 2006; Carol, Dolan, 2006; Kobayashi et al., 2007; Jones et al., 2007; Sumimoto, 2008). НАД(Ф)Н-оксидаза катализирует образование супероксидного радикала из кислорода, который затем превращается в Н202 спонтанно или в результате ферментативных реакций (с участием СОД). С помощью генетических и биохимических подходов роль НАД(Ф)Н-оксидазы в качестве ключевой АФК-синтезирующей системы растительных клеток продемонстрирована в стрессовых реакциях, индуцированных патогенным инфицированием, в процессе регуляции роста клеток и закрывании/открывании устьиц (Быстрова, Буданова, 2007; Минибаева, 2009).
Наряду с НАД(Ф)Н-оксидазами плазмалеммы, заслуживают внимание и другие АФК-синтезирующие системы, локализованные в клеточной стенке, например, гваяколовые пероксидазы. Установлено, что первичный всплеск содержания пероксида водорода, например, при патогенезе, генерируется внеклеточными пероксидазами, в последствии вновь синтезированная Н202 активирует НАД(Ф)Н-оксидазу (Колупаев, 2007). Как упоминалось выше, пероксидазы могут проявлять оксидазную активность с окислением железа гема из валентности 2 в валентность 3 и передачей электронов с восстановителей, таких как НАДН, на кислород. Подобная активность пероксидазы приводит к образованию супероксида и Н202 (Минибаева, Гордон, 2003; Полесская, 2007; Quan et al., 2008). Так, было показано, что в обработанных элиситором клетках фасоли (Phaseolns vulgaris L.) Н202 образуется при работе пероксидазы клеточных стенок. Окислительная вспышка в клетках фасоли подавлялась цианидом калия и была не чувствительна к дифенилениодонию, ингибитору НАД(Ф)Н-оксидазы, что подтверждает роль апопластной пероксидазы в генерации АФК (Bolwell et al., 2002). Апопластная пероксидаза может продуцировать АФК не только при патогенном инфицировании (Bolwell et al., 2002; Bindschedler et al., 2006), но и при поранении (Minibayeva et al., 2009), и прорастании семян (Roach et al., 2008). Существуют данные, что пероксидазы клеточных стенок генерируют перекись при подщелачивании апопласта. Активация этой функции пероксидаз наблюдается в стрессовых условиях, особенно при инфицировании растений патогенными микроорганизмами (Полесская, 2007; Bolwell et al., 2002). В апопластном пространстве пероксидазы способны генерировать и другие АФК. Например, они катализируют реакцию между 02 и Н202, которая приводит к образованию НО . Каталитический цикл пероксидаз достаточно сложен, они могут индуцировать реакции образования гидроксилрадикала и в присутствии ЫАДН (Schopfer, 2001; Schopfer, Liszkay, 2006). Гидроксильный радикал разрезает полимеры клеточных стенок," ослабляя связи между ними, и способствует, таким образом, растяжению клетки в процессе роста (Полесская, 2007).
Пероксидазы клеточных стенок генерируют и супероксидный радикал. Например, при окислении фенольных соединений перекисью образуется НАД -радикал, который спонтанно восстанавливает кислород до 02 . Последний быстро переходит в Н202 либо за счет окисления еще одного НАДН, либо при участии СОД. В последнее время установлено, что СОД (Си п-СОД и Мп-СОД), наряду с регуляцией уровня супероксидного радикала, активно синтезируют перекись водорода. Поэтому некоторые авторы рассматривают, например, Mn-СОД не только как противоокислительный фермент, но также как ключевой фермент, вовлеченный в создание клеточного редокс-потенциала (Buettner et al., 2006). Си п-СОД апопласта тоже может катализировать дисмутацию 02 , восстанавливать 02 Fe(II) или окислять 02 Fe(III). Таким образом, фермент способен действовать как супероксиддисмутаза, супероксидредуктаза (с Fe(II) в качестве восстановителя активного сайта Cu(II)) и супероксидоксидаза (Liochev, Fridovich, 2000). Кроме того, было показано, что Си,2п-СОД. может обладать пероксидазной активностью (Kim et al., 2006; Liochev, Fridovich, 2004). Таким образом, пероксидазы и Си,2п-СОД апопласта способны генерировать Н2С 2 и одновременно уменьшать ее уровень. Благодаря своей АФК-синтезирующей системе апопласт вовлечен в генерацию, рецепцию стрессовых сигналов и в последующий контроль за ростом, и защитой растительных клеток (Quan et al., 2008; Полесская, 2007). А пероксидаза и Си,2п-СОД, наряду с другими генераторами АФК и антиоксидантами, являются неотъемлемыми элементами редокс-системы апопласта и клетки в целом.
Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач исследования
Выделение вакуолей из ткани корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) проводили модифицированным макрообъемным методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН (Саляев и др., 1981). Детали стандартных операций этого метода заключались в следующем: 400 г запасающей ткани корнеплодов столовой свеклы нарезали специальным аппаратом в 800 мл среды выделения с плотностью 1.036 г/см3 (50 мМ NaH2P(VKOH (рН 8.0), 0.8 М КС1, 20 мМ ЭДТА). Раствор фильтровали, а полученную суспензию центрифугировали в течение 15 минут при 250g. Полученный осадок вакуолей ресуспендировали в растворе с плотностью 1.045 г/см , содержащем 6.5 мМ трис/HCl (рН 7.4), 1 М КС1, 1 мМ MgCb. Суспензию фильтровали через сито с капроновой планктонной сеткой (130 меш) и центрифугировали в течение 10 минут при 50g. Полученные органеллы согласно методическим предписаниям подвергались дополнительной очистке в градиенте плотности сахарозы или использовались для получения везикул тонопласта.
Для дополнительной очистки вакуоли суспендировали и суспензию вносили в ступенчатый градиент плотности (1.050, 1.080, 1.145, 1.180 г/см ), составленном из смеси растворов 1 М КС1 и 1.8 М сахарозы, содержащих 20 мМ трис-HCl (рН 7.4). Использовался флотационный способ очистки, когда органеллы располагались в самом нижнем слое градиента. При центрифугировании градиента в течение 10 мин при 125g крупные вакуоли двигались вверх быстрее примесей, и быстрее достигали седиментационного равновесия. Вакуоли собирались на границе плотностей в виде ярко-красных зон, в то время как примеси оставались в нижнем слое, не успевая подняться, а конгломераты клеточных стенок и ядра оседали. О локализации вакуолей судили по распределению окраски (пигмента бетацианина) в градиенте (Кузеванов и др., 1985; Саляев и др., 1981; Катков и др., 1990). В таком градиенте плотности получали две фракции вакуолей: фракцию "тяжелых" вакуолей, место локализации которой в градиенте приходилось на слои между 1.080 и 1.145 г/см ; и фракцию "легких" вакуолей, которые собирались на границе слоев с плотностью 1.050 и 1.080 г/см . Вакуолярные фракции отбирали, суспендировали в среде (6.5 мМ трис/HCl (рН 7.4), 1 М КС1, 1 мМ MgCl2) и центрифугировали 10 минут при 100g. Чистоту фракций контролировали под световым микроскопом NU-2E ("Carl Zeiss", Германия). Полученный материал, "легкие" и "тяжелые" вакуоли, использовали для исследования ферментативной активности.
Везикулы тонопласта получали из изолированных вакуолей, которые подвергали осмотическому шоку, разбавляя осадок органелл в 10 раз гипотоническим раствором (1 мМ трис/HCl (рН 7.4), 1 мМ MgCb, 1 мМ р-меркаптоэтанола). Затем полученный лизат очищали от примесных структур, центрифугируя при 15000g в течение 20 мин. Полученную в результате надосадочную жидкость центрифугировали при 60000g в течение 60 мин для отделения везикулы тонопласта от раствора вакуолярного сока. Осадки тонопласта тщательно ресуспендировали в свежей порции гипотонического раствора и повторно центрифугировали при тех же условиях и получали осадок вакуолярных мембран (Саляев и др., 1981).
Все этапы выделения проходили при комнатной температуре, за исключением центрифугирования, которое осуществляли при 4С. Для получения фракции пластид ткань корнеплода гомогенизировали в соотношении 1:3 (масса : объем) в растворе, содержащем 10 мМ пирофосфат Na/HCl (pH 7.8), 330 мМ сорбита, 5 мМ MgCb, 2 мМ ЭДТА, 3 мМ цистеина, 5 мМ р-меркаптоэтанола (Asada, Badger, 1984). Гомогенат фильтровали через нейлоновую сеть (130 меш) и осаждали 5 мин при 3500g. Полученные в результате осадки ресуспендировали раствором, содержащим 50 мМ HEPES/KOH (рН 7.6), 330 мМ сорбит, 10 мМ NaCl, 1 мМ MgCI2, 2 мМ ЭДТА, 0.5 мМ КН2Р04. Проводили повторное осаждение при 2000g 3 мин. После чего полученные осадки вновь ресуспендировали и наносили на ступенчатый градиент перколла (10, 30, 40, 70 и 90%), приготовленный на основе выше указанного раствора. Градиент центрифугировали в течение 15 мин при 6000g. Интактные хлоропласты обычно проходят сквозь 30%-ный перколл и скапливаются на границе между слоями 40 и 70% перколла. Ядра, как самые тяжелые органеллы, проходят все слои перколла и образуют осадок на дне пробирки, а митохондрии остаются в верхнем слое градиента, в буфере для гомогенизации. Поскольку в клетках запасающих тканей корнеплода свеклы присутствуют в основном лейкопласты, то в данном случае наиболее чистую фракцию пластид собирали на границе 30 и 40% перколла. Для удаления перколла к суспензии пластид добавляли не менее 50 мл буфера для гомогенизации и центрифугировали 5 мин при 3500 g (Зубо, Кузнецов, 2008). Полученные осадки пластид использовали в дальнейшей работе. Ткань корнеплода растирали в гомогенизаторе в среде 1:3 (масса : объем), содержащей 50 мМ К-фосфатного буфера (рН 7.5), 300 мМ сахарозы, 1 мМ MgCb, 0.5 мМ СаС12, 50 мМ КС1, 3 мМ ЭДТА, 0.05% цистеина, 2 мМ ДТТ, 0.3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0.5% ПВП, 12 мМ р-меркаптоэтанола. Гомогенат фильтровали через два слоя нейлоновой сети (130 меш) и центрифугировали в течение 15 минут при 4000g. Осадок ресуспендировали средой, состоящей из 50 мМ трис/HCl (рН 7.2), 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ КС1, 0.5 мМ СаСЬ, 5 мМ цистеина. Суспензию также фильтровали и центрифугировали в течение 30 минут при 6000g в ступенчатом градиенте сахарозы (1.0, 1.3, 1.5 и 1.6 М), который готовился на основе буфера, содержащего 50 мМ трис/HCl (рН 7.2), 1 мМ ЭДТА, 70 мМ КС1. В результате митохондрии оставались в буфере для ресуспендирования, пластиды собирались на границе между слоями 1.3 М и 1.5 М сахарозы, а ядра проходили через слой 1.6 М сахарозы и оседали. Осадок аккуратно собирали со дна пробирки и разбавляли средой ресуспендирования в 30-50 раз, затем центрифугировали в течение 40 мин при 18000g и получали обогащенную фракцию ядер (Методы изучения мембран растительных клеток, 1986).
Получение водных экстрактов из ткани корнеплода и выделенных органелл
Суммарная активность пероксидазы из тканевых экстрактов зачастую была в 1.5-2 раза выше активности вакуолярной пероксидазы, и имела два оптимума рН, которые также зависели от природы субстрата (рис. 9, Б). Пик пероксидазной активности с ГВ приходился на рН 5.0, а с ДАБ - на рН 8.0.
С целью определения сродства фермента к субстрату исследовали кинетические характеристики пероксидазы. В результате выяснилось, что вакуолярная пероксидаза имела большее сродство к ДАБ: для ДАБ - Vm/Km = 0.25 мин 1, для ГВ - Vm/Km = 0.037 мин"1. А величины Vm/Km для ГВ и ДАБ у пероксидазы тканевых экстрактов оказались практически равными, 0.23 и 0.22 мин"1, соответственно.
Различные оптимумы рН и одинаковые кинетические характеристики для разных субстратов у пероксидазы тканевых экстрактов могли свидетельствовать о присутствии нескольких изоформ фермента, предпочитающих разные рН и имеющее разное сродство к субстратам. Поэтому был исследован изоферментный состав пероксидазы при помощи метода ИЭФ, поскольку только этот метод позволяет определить весь спектр изоформ фермента, который в клетках растений представлен кислыми (анионными) и основными (катионными) пероксидазами.
Результаты, полученные после ИЭФ с последующим зимографическим окрашиванием, подтвердили предположение о множестве изоформ пероксидазы в клетках корнеплода. У покоящихся корнеплодов, на которых проводилось исследование, изоферментный состав пероксидазы был очень лабилен и зависел от продолжительности покоя (рис. 10). Так, в тканевых экстрактах на разных этапах покоя обнаруживалось от 15 до 23 изоформ пероксидазы разной природы: от 12 до 17 изоформ - "анионных", от 3 до 7 -"катионных" или основных (рис. 10).
В вакуолярных экстрактах с помощью ИЭФ также выявлено множество изоформ пероксидазы (рис. 11). Спектр изопероксидаз тоже изменялся в зависимости от продолжительности покоя корнеплода. На разных этапах покоя было выявлено от 10 до 16 изоформ фермента, то есть на несколько изоформ меньше, чем в тканевых экстрактах. 9-10 анионных изоформ проявлялось на зимограммах белков из фракции "тяжелых" вакуолей, тогда как количество анионных изоформ из фракции "легких" вакуолей варьировало в пределах от 8 до 10. От 1 до 7 изоформ катионных пероксидаз обнаруживалось в обеих фракциях. Таким образом, было установлено, что в вакуолях корнеплодов столовой свеклы присутствовала пероксидаза, предпочитающая в качестве субстрата бензидины, и оптимумы рН для ее активности приходились на низкие значения (рН 5.0-6.0). Локализованная в вакуолях пероксидаза представлена широким спектром изоформ, как "кислой", так и "щелочной" природы. Известны факты, свидетельствующие о способности вакуолярной пероксидазы окислять бетацианины (Martinez-Parra, Munoz, 2001). Поскольку практически ничего не известно о том, что является основным субстратом вакуолярной пероксидазы корнеплодов столовой свеклы, мы предприняли попытку проверить, способна ли в нашем случае пероксидаза окислять бетацианины, которые в больших количествах накапливаются в вакуолях корнеплода. К водным экстрактам, полученным из вакуолей и ткани корнеплода добавляли: 1) Н202; 2) Н2С 2 и цианистый калий; 3) пероксидазу хрена; 4) пероксидазу хрена и Н2О2; 5) пероксидазу хрена, КЬСЬ и цианистый калий. Изменение концентрации бетацианинов отслеживали по уменьшению величин оптической плотности D(540) при длине волны 540 нм. Разница между первоначальными и конечными значениями оптической плотности (AD) служила единицей измерения, по которой судили о количественных изменениях бетацианинов. В ходе экспериментов установили, что в том случае, когда к образцу (тканевой или вакуолярный экстракт с бетацианинами) добавляли пероксид водорода, оптическая плотность достоверно уменьшалась (рис. 12), что свидетельствовало об окислении бетацианинов. Если вместе с Н2О2 добавляли ингибитор большинства оксидоредуктаз цианистый калий, то уменьшения оптической плотности практически не происходило, или оно было менее выраженным. Если вносили пероксидазу хрена и перекись водорода, то оптическая плотность бетацианинов значительно уменьшалась и AD достигала максимальных величин. Такого эффекта не наблюдалось, если пероксидаза хрена была внесена без перекиси водорода. При добавлении цианистого калия к образцам с пероксидазой хрена и Н2О2 AD уменьшалась в 1.5-2 раза по сравнению с AD в отсутствие ингибитора, что могло указывать на участие пероксидазы в процессах окисления бетацианинов. Следует отметить, что все наблюдаемые эффекты были более выраженными в тканевых экстрактах. вакуолярных и тканевых экстрактов в присутствии Н2О2, пероксидазы хрена (РОХ) и цианистого калия (KCN). Полученные результаты давали основание полагать, что гваяколовые пероксидазы могли вовлекаться в окисление бетацианинов вакуолей корнеплодов свеклы.
В цикле развития корнеплода свеклы различают такие основные стадии, как первый год вегетации и период покоя, каждая из которых протекает при определенных условиях температуры и влажности. Для работы брали корнеплоды во время роста растения в первый год вегетации и корнеплоды, находящиеся в состоянии покоя. В последнем случае отбор проводили на разных временных отрезках: в начале покоя (в первый месяц после уборки); в глубоком покое (январь - февраль) и на завершающих этапах покоя (май - июнь). На этих фазах была исследована активность вакуолярной СОД.
В результате установили, что уровень активности фермента в первый год вегетации был ниже, чем во время покоя корнеплода (рис. 13). Наибольшая активность выявлялась впервые недели покоя, сразу после уборки и в течение последующего месяца хранения корнеплодов при пониженных температурах. На других стадиях покоя она несколько снижалась и становилась сопоставимой с активностью во время роста.
Исследование способности пероксидазы окислять бетацианины вакуолей корнеплодов свеклы
К настоящему времени установлено, что центральная вакуоль служит не только для запасания, детоксикации и деградации эндогенных и экзогенных соединений, но также активно включается в ответные защитные реакции клетки в стрессовых ситуациях, в том числе и при окислительном стрессе (Андреев, 2001). Однако антиоксидантные системы в центральной вакуоли, если рассматривать их по всем трем уровням защиты, до сих пор практически не изучены, особенно это касается ферментативных механизмов защиты. Возможно, основная причина заключается в сложности изолирования и получения чистых фракций вакуолей в достаточных количествах, необходимых для исследования.
В нашем институте в 80-е годы был разработан метод выделения и очистки вакуолей, который позволял получать чистые фракции органелл из корнеплодов столовой свеклы {Beta vulgaris L.) в достаточных для биохимического исследования количествах (Саляев и др., 1981; Кузеванов и др., 1985). На протяжении долгого времени этот метод эффективно применяли, чтобы изучать компоненты вакуолярного сока и транспортные системы тонопласта (Пузанова и др., 1982; Кузеванов и др., 1985). Приступая к изучению ферментативной антиоксидантной системы у центральной вакуоли, мы воспользовались этим методом выделения, а также знанием и опытом, которые накопили сотрудники нашего института за долгие годы работы с изолированными вакуолями.
Вакуоли клеток запасающих тканей корнеплода столовой свеклы представляют собой крупные структуры, окрашенные пигментом бетацианином, поэтому чистоту фракции изолированных органелл можно контролировать под световым микроскопом (Кузеванов и др., 1985; Саляев и др., 1981; Катков и др., 1990). Наряду с традиционным способом контроля, предприняли попытку оценить степень загрязнения фракции вакуолей пластидами и ядрами по присутствию в них ДНК. Исследовали несколько фракций изолированных вакуолей разной степени очистки: фракция 1 — это вакуолярная фракция до очистки в градиенте плотности, она, как было установлено ранее, содержала незначительные примеси клеточных стенок, пластид и, возможно, ядер; фракция 2 - фракция из нижних слоев градиента, загрязненная более мелкими клеточными структурами; фракция 3 очищенные в градиенте плотности так называемые "тяжелые" вакуоли; фракция 4 — очищенные в градиенте плотности вакуоли, названные "легкими" (рис. 2, А, Б). Ранее Кузеванов и Катков с соавт. (1985), получавшие такие же зоны "тяжелых" и "легких" вакуолей в том же градиенте плотности, исследовали их химический состав и плавучую плотность, и пришли к заключению, что, скорее всего, эти фракции образованы двумя популяциями вакуолей. Ткань корнеплода свеклы морфологически неоднородна, имеются хорошо выраженные участки крупных и мелких клеток, соответствующие зонам межкольцевой паренхимы и паренхимы сосудисто-волокнистых пучков (кольцевой паренхимы). В столовой свекле клетки зоны межкольцевой паренхимы содержат вакуоли с меньшей плавучей плотностью (в пределах 1.030-1.060 г/см ), то есть более "легкие", потому что в них больше ионов калия, натрия, органических кислот и аминокислот. А клетки зоны кольцевой паренхимы имеют вакуоли с большей плавучей плотностью (1.060-1.110 г/см , "тяжелые"), в них больше сахарозы и бетацианинов. Используя тот же градиент для очистки и фракционирования вакуолей, мы получали те же две популяции вакуолей (Кузеванов и др., 1985; Катков и др., 1990). Во фракциях "тяжелых" и "легких" вакуолей ДНК отсутствовала (рис. 2, В). Следовательно, в них не было ДНК-содержащих структур или их количества были незначительны, особенно если учесть объем анализируемого образца. Загрязнение, по-видимому, кольцевой или фрагментами линейной ДНК, отмечены во фракции 1, т.е. в неочищенных вакуолях и во фракции 2, в которой остается основная масса примеси органелл. Таким образом, было установлено, что изолированные вакуоли из фракций 3 и 4 достаточно чистые и пригодные для исследования (рис. 2). В двух чистых фракциях вакуолей идентифицировали ферменты, относящиеся к антирадикальным и к антиперекисным системам защиты. Особый вклад в защиту от супероксидного радикала вносит супероксиддисмутаза. Этот фермент стоит на первых рубежах защиты от АФК и является одним из важных компонентов антирадикального уровня защиты. Известно, что СОД представлена в клетках растений тремя молекулярными формами: Си,2п-СОД, Мп-СОД и Fe-СОД. Эти ферменты могут быть разделены электрофорезом в полиакриламидном геле, а их активность идентифицирована на основании чувствительности к ингибиторам: KCN и Н2О2. Таким образом, в клетках корнеплодов столовой свеклы были идентифицированы все три формы СОД (Fe-, Мп- и Cu,Zn СОД). Согласно полученным результатам из трех форм СОД, выявленных в тканевых экстрактах корнеплодов, в вакуолях определили две (рис. 4). Во фракции "тяжелых" вакуолей были идентифицированы такие формы СОД, как CUjZn-СОД и Мп-СОД. При этом Мп-СОД выявлялась только при экстракции в присутствии 0.1% тритона Х-100. Во фракции "легких" вакуолей обнаружена одна форма СОД - Си,2п-СОД, которая проявлялась всегда, независимо от вида экстракции, с детергентом или без него (рис. 3). Проявление активности Fe-СОД во фракциях неочищенных вакуолей (рис 3, дорожки 5 и 6) могло свидетельствовать о загрязнении пластидами, так как, известно, что этот фермент расположен главным образом в хлоропластах некоторых высших растений (Бараненко, 2006). Мы обнаружили, что в наших экспериментах Rf Fe-СОД из фракции пластид совпадал с Rf Fe-СОД из неочищенной фракции вакуолей, что могло указывать на присутствие пластид в вакуолярной фракции (рис. 6).
