Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор
2.1. Передвижение ассимилятов по флоэме из доиорных органов растения в акцепторные 7
2.2. Растущая часть корня 11
2.3. Изучение флоэмной разгрузки в корне 23
2.4. Инвертаза и сахарозосинтаза - ферменты, расщепляющие сахарозу 31
3. Методы и объекты исследования 46
4. Результаты
4.1. Локализация симпластной флоэмной разгрузки в корне...55
4.2. Распределение активности инвертазы и сахарозосинтазы по длине кончиков корней 59
4.2.1 Распределение активности инвертазы по длине кончиков корней кукурузы, пшеницы и дыни 59
4.2.2. Распределение активности сахарозосинтазы по длине кончиков корней кукурузы 61
4.3. Сопоставление активности инвертазы и сахарозосинтазы с областью флоэмной разгрузки и началом роста растяжением в кончике корня 62
4.4. Активность инвертазы и сахарозосинтазы в тканях кончика корня 65
4.4.1. Активность инвертазы 65
4.4.2. Активность сахарозосинтазы 91
4.4.3. Дополнительное окрашивание проционовым красным 2BS срезов, исследованных на активность ферментов 103
4.4.4. Внутриклеточная локализация инвертазы и сахарозосинтазы 110
4.5. Активность инвертазы в сегментах кончиков корней: определение in vitro 115
4.5.1. Подбор условий для определения активности различных форм инвертазы 115
4.5.2. Активность разных форм инвертазы в кончиках корней проростков кукурузы 121
4.5.3. Сравнение активности вакуолярной и цитонлазматической форм инвертазы в кончиках корней проростков кукурузы и тыквы 122
4.5.4. Активность разных форм инвертазы в меристеме, зоне растяжения и зоне закончивших рост клеток корня кукурузы 122
4.6. Распределение растворимых Сахаров по длине корня 132
4.7. Изменение соотношения содержания К+ и растворимых Сахаров вдоль растущей части корня 135
5. Обсуждение 139
6. Заключение 146
7. Выводы 149
8. Список литературы 150
- Передвижение ассимилятов по флоэме из доиорных органов растения в акцепторные
- Инвертаза и сахарозосинтаза - ферменты, расщепляющие сахарозу
- Распределение активности инвертазы по длине кончиков корней кукурузы, пшеницы и дыни
- Дополнительное окрашивание проционовым красным 2BS срезов, исследованных на активность ферментов
Введение к работе
Выявление закономерностей распределения ассимилятов между разными органами растения является одной из важных задач физиологии растений. Известно, что ассимиляты транспортируются по флоэме и что основными транспортирующими фиксированный углерод соединениями являются сахароза и синтезированные на её основе олигосахариды. Движущей силой флоэмного транспорта служит градиент гидростатического давления. Градиент создается, с одной стороны, активным поглощением и аккумуляцией сахарозы в проводящем комплексе ситовидный элемент-сопровождающая клетка терминалей флоэмы донорного листа, что сопровождается поступлением в него воды. С другой стороны, на акцепторном участке ситовидных трубок происходит снижение концентрации ассимилятов в результате их использования в метаболизме или внутриклеточной компартментации в потребляющих клетках, что приводит к выходу воды из транспортного канала. Поэтому активность инвертазы и сахарозосинтазы - ферментов, вводящих сахарозу в метаболизм и тем самым снижающих ее концентрацию на акцепторном конце транспортного канала, - способствует притоку ассимилятов к акцепторам [см. Курсанов, 1976; Patrick, 1997; Гамалей, 2004]. Несмотря на большие успехи в изучении механизмов и движущих сил флоэмного транспорта, до сих пор многие кардинальные вопросы остаются неясными. Нет четкого представления о локализации наиболее интенсивного выхода ассимилятов из флоэмы, то есть флоэмной разгрузки в потребляющих органах, неясно, одинаково ли участие сахарозосинтазы и разных форм инвертазы в разгрузке флоэмы.
Ярким примером акцептора ассимилятов служит растущий корень. Наличие в корне зон, резко различающихся по характеру функциональной активности - деления, роста клеток растяжением и дифференцировки, - делает его хорошим объектом для изучения связи флоэмной разгрузки и активности расщепляющих сахарозу ферментов с процессами деления и растяжения клеток. До сих пор остается неясным, какие факторы сопутствуют переходу клеток к росту растяжением. Можно предположить, что определенную роль в этом процессе играет выход сахарозы из флоэмы и повышение ее концентрации в растущих клетках. Происходящее в результате функционирования инвертазы и сахарозосинтазы изменение соотношения концентраций сахарозы и гексоз в клетке может влиять на экспрессию генов и, соответственно, на судьбу клеток [Koch, 1996; Sheen et al., 1999; Yang et al., 2004]. Кроме того, гидролиз инвертазой молекулы сахарозы на две молекулы гексоз повышает осмотическое давление клетки, необходимое для её растяжения. В повышении осмотического давления клетки участвуют и другие осмотики, прежде всего калий, концентрация которого может меняться в зависимости от
содержания гексоз [Холодова и др., 1989; Красавина, Бурмистрова, 1989], а значит, и от активности инвертазы. Изучение активности расщепляющих сахарозу ферментов в зонах деления и растяжения клеток актуально для понимания взаимосвязи путей метаболизации сахарозы с ростом корня и с флоэмпой разгрузкой.
Цели и задачи исследования. Основная цель работы - изучить активность расщепляющих сахарозу ферментов в разных зонах кончика корня в связи с флоэмной разгрузкой и переходом клеток к растяжению.
Для этого были поставлены следующие задачи:
- выявить локализацию симпластной разгрузки флоэмы в кончике корня;
- изучить активность инвертазы и сахарозосинтазы в тканях разных зон растущей части корня, используя для этого гистохимический метод in situ;
- изучить активность разных форм инвертазы в зонах деления, растяжения и дифференцировки клеток с помощью биохимического метода in vitro;
- определить содержание растворимых Сахаров (сахарозы, глюкозы и фруктозы) и К+ в зонах кончика корня;
- выявить зависимость активности инвертазы от содержания калия в клетках.
Научная новизна работы. Впервые обнаружена различная активность инвертазы и сахарозосинтазы в зоне деления: в клетках апикальной половины меристемы инвертаза не выявлялась, за исключением клеток ризодермы, а сахарозосинтаза обнаруживала максимальную активность. Это согласуется с участием сахарозосинтазы в синтезе компонентов клеточных стенок, который интенсивно протекает в этой зоне. Использование гистохимического метода позволило установить, что клетки разных тканей различаются по активности инвертазы и сахарозосинтазы даже в одной зоне корня.
Впервые установлено, что локализация нижней границы симпластной флоэмной разгрузки - средняя область меристемы - совпадает с началом выявления активности инвертазы. Переход клеток к растяжению наблюдали несколько дальше от кончика корня. Сформулировано представление о том, что индукция синтеза и/или активация инвертазы разгружающейся из флоэмных окончаний сахарозой в базальной части меристемы является одним из факторов, обуславливающих начало вакуолизации клетки и переход к росту растяжением.
Новым фактом является обнаруженная обратная корреляция активности вакуолярной инвертазы и содержания К+ в клетках зоны дифференцировки корня. Возможно, что пониженная активность инвертазы при повышенном содержании К+ обуславливает взаимозаменяемость К+ и Сахаров в процессах осморегуляции. Состав участвующих в этом процессе гексоз зависит от транспортной формы углеводов. В корнях растений, в которых по флоэме транспортируется в основном сахароза, содержание глюкозы и фруктозы одинаково. Если наряду с сахарозой транспортируются олигосахариды рафинозного ряда, в клетках преобладает фруктоза.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе установлена связь между активностью ферментов первичной метаболизации сахарозы и ростовыми процессами в кончике корня. Полученные результаты способствуют пониманию процессов, приводящих к началу растяжения клеток, что до сих пор остается одной из самых трудных проблем в физиологии роста растений. Расширяется представление о взаимосвязи транспорта (распределения) ассимилятов в растении и активности расщепляющих сахарозу ферментов. Выявленные закономерности могут найти отражение в учебно-методической практике при рассмотрении особенностей делящихся и растущих растяжением клеток, а также в разделе по изучению транспорта ассимилятов.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 14-18 октября 2002), VIII Международной конференции молодых ученых (Киев, 23-25 октября 2002), Научно-практической конференции «Использование достижений современной биологической науки» (Брянск, 3-5 декабря 2002), Молодежной конференции в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева (Москва, 2003), V Съезде ОФР (Пенза, 15-21 сентября, 2003), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 19-23 сентября, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Передвижение ассимилятов по флоэме из доиорных органов растения в акцепторные
Распределение ассимилятов в растении определяется донорно-акцепторными отношениями. На ранних этапах развития донорами ассимилятов являются семена или развившиеся после их прорастания семядоли, позднее эту функцию выполняют зрелые листья, способные обеспечить образовавшимися в ходе фотосинтеза ассимилятами не только себя, но и экспортировать часть ассимилятов в другие органы. К типичным акцепторным органам относятся корни, молодые листья, цветки, плоды, развивающиеся семена, а также различные запасающие органы в стадии накопления.
Основной транспортной формой фиксированного в ходе фотосинтеза углерода является сахароза. В некоторых растениях наряду с сахарозой транспортируются олигосахариды рафинозного ряда (стахиоза, вербаскоза и рафиноза). Это было продемонстрировано в опытах с подкормкой листьев 4СОг и последующим обнаружением метки в этих соединениях во флоэме [см. Курсанов, 1976 стр. 334]. Сахароза является универсальным источником углеводов и других органических соединений для корней. Так, например, известно, что корни долгое время способны расти на минеральной среде, будучи изолированы от надземных органов и получая в качестве источника углерода только сахарозу [Смирнов, 1970].
Передвижение ассимилятов в растении обеспечивается функционированием транспортной системы. Выделяют ближний и дальний транспорт. Ближним называют транспорт от клетки к клетке. Такое передвижение веществ происходит этапе транспорта ассимилятов из клеток мезофилла к проводящим тканям флоэмы, а также на этапе их распространения между потребляющими клетками после разгрузки из флоэмы. Дальним транспортом называют передвижение веществ от одного органа к другому по флоэме. Транспорт веществ по флоэме включает в себя следующие этапы: загрузку флоэмы в донорном органе, собственно передвижение по ситовидным трубкам флоэмы и разгрузку флоэмы в потребляющем органе. Структурным элементом, осуществляющим дальний транспорт ассимилятов, служит проводящий комплекс флоэмы, состоящий из ситовидного элемента и сопровождающей клетки.
Загрузка флоэмы происходит в донорных органах. Во флоэму сахароза может попадать два путями: симпластным или апопластным. Пути загрузки флоэмы различаются у разных видов растений. Симпластный путь загрузки встречается реже и характерен преимущественно для растений, использующих в качестве транспортной формы углерода наряду с сахарозой олигосахариды рафинозного ряда. У растений с симпластной загрузкой плазмодесменные связи не прерываются на всем пути транспорта от клеток мезофилла до ситовидных элементов [см. Гамалей, 2004].
Для большинства растений характерна апопластная загрузка. В этом случае сахароза из клеток мезофилла попадает в апопласт тонких жилок, а затем поступает внутрь флоэмного комплекса с помощью транслокаторов сахарозы, локализованных в плазмалемме как самого ситовидного элемента, так и сопровождающих клеток. В плазмалемме клеток-спутниц обнаружен белок-транслокатор SUC2 [Stadler, Sauer, 1996], [Imlau et al., 1999], а в мембране ситовидных элементов - SUT1 [Kuhn et ah, 1999]. Эти переносчики являются симпортерами сахарозы с протоном и работают в комплексе с Н+-АТФазой. При этом Н+-АТФаза выкачивает протон из клеток с затратой энергии, создавая на клеточной мембране концентрационный градиент протона. Поступление Н+ в проводящий комплекс ситовидный элемент-сопровождающая клетка происходит по градиенту их концентрации и сопряжено с поглощением сахарозы. В результате в области загрузки во флоэме создаётся высокая концентрация сахарозы - до 1М и выше [см. Курсанов, 1976]. В проводящих клетках флоэмы повышается осмотическое давление, в них поступает вода из окружающих клеток, а также из ксилемы. Таким образом при загрузке флоэмы в ситовидных элементах создаётся высокое гидростатическое давление [Patrick, 1996].
При флоэмной разгрузке в акцепторных органах осуществляется массовый выход сахарозы из флоэмных окончаний. Это приводит к понижению осмотического давления во флоэмных окончаниях, вследствие чего вода также выходит из флоэмы в окружающие ткани. При этом гидростатическое давление понижается.
Современные представления о механизме транспорта веществ по флоэме возникли в результате развития гипотезы Мюнха, высказанной им еще в 30-х годах прошлого века [Munch, 1930]. Мюнх предполагал, что движущей силой дальнего транспорта служит присутствующий в ситовидной трубке градиент концентрации сахарозы. Однако не только сахароза, но и другие компоненты определяют состав флоэмного сока. Кроме того, было установлено, что градиент не концентрации, а гидростатического давления в транспортном канале определяет движущую силу флоэмного транспорта ассимилятов [Thorpe and Minchin, 1996]. Создается этот градиент, благодаря разнице содержания ассимилятов, ионов и воды в ситовидной трубке в местах загрузки и разгрузки флоэмы (рис. 1).
Вдоль транспортного пути сахароза выходит из флоэмы, поскольку между флоэмой и окружающими тканями очень большая разница в концентрации сахарозы. Этот выход скорее всего обеспечивается пассивной утечкой ассимилятов. Он составляет, по некоторым подсчетам, приблизительно 3% от содержимого флоэмного экссудата. На каждый сантиметр пути 6% содержимого ситовидной трубки выходит из транспортного канала, но 3% загружается в неё вновь [Minchin and Thorpe, 1984]. Вышедшая из транспортного канала сахароза используется для поддержания функционирования внепучковых тканей стебля и зрелой части корня. Обнаружены белки, которые осуществляют возврат утекшей из флоэмы сахарозы, уменьшая при этом общую утечку [Minchin and Thorpe, 1987; van Bell, 1993; Oparka and Turgeon, 1999; Patrick, 1997; Schulz, 1998]. В некоторых случаях возможен симпластный выход сахарозы вдоль транспортного пути [Patrick, 1997]. Путь выхода ассимилятов из аксиальных органов, например, стебля, зависит от интенсивности флоэмной загрузки в листе. При интенсивной загрузке концентрация флоэмного сока в проводящем комплексе флоэмы высока и существует большой градиент концентрации между ситовидным элементом и окружающими клетками. Между тем, известно, что при большой разнице тургорных давлений соседних клеток происходит их изоляция друг от друга [Fensom, 1978]. В этих условиях возможность симпластного выхода сахарозы ограничена, преимущественный путь снабжения потребляющих клеток стебля - апопластный. Действительно, при изучении мембранных потенциалов разных клеток поводящего пучка обнаружили значительную разницу между потенциалами ситовидных элементов и паренхимных клеток флоэмы в стебле -объект - , что возможно при симпластной изоляции флоэмного комплекса вдоль пути транспортировки ассимилятов [van Bell, 1993]. Благодаря такой изоляции поддерживается высокое осмотическое давление в ситовидных элементах по сравнению с окружающими тканями. Это свидетельствует в пользу преимущественно апопластного поступления ассимилятов в потребляющие клетки стебля. При снижении интенсивности фотосинтеза понижается концентрация ассимилятов в проводящем канале и становится возможной симпластная разгрузка [Heyes, 1989].
Инвертаза и сахарозосинтаза - ферменты, расщепляющие сахарозу
Прежде чем описывать известные данные о локализации флоэмной разгрузки в корне, отметим структурные особенности развития флоэмы в кончике корня. Известно, что ситовидные элементы протофлоэмы развиваются еще в меристеме, ситовидные элементы метафлоэмы развиваются дальше от кончика корня, после окончания растяжения клеток [Esau and Gill, 1973; Данилова, 1974; Thorsch and Esau, 1981; Eleftheriou and Tsekos, 1982]. Зрелые ситовидные элементы протофлоэмы обнаружены в меристеме корней проростков ячменя [Телепова, 1985], пшеницы [Демченко, 1989а, 19896], а метафлоэмы - в зоне корневых волосков корней проростков ячменя [Телепова, 1985] и пшеницы [Демченко, 19896]. В работе Телеповой [Телепова, 1985] было высказано предположение, что ситовидные элементы метафлоэмы участвуют только в дальнем транспорте веществ, поскольку у них нет выраженных клеток-спутников, а в разгрузке флоэмы участвуют ситовидные элементы протофлоэмы, клетки-спутники которых имеют характерные утолщения клеточной стенки и многочисленные разветвленные плазмодесмы между ситовидными элементами протофлоэмы и клетками-спутниками. Причем, клетки-спутники являются слабодифференцированными клетками в меристеме, и приобретают характерные черты строения в связи со специализацией к разгрузке ассимилятов в начале зоны растяжения. Таким образом, выявленные в данной работе особенности анатомического строения элементов прото- и метафлоэмы, а также клеток-спутников свидетельствуют о возможности флоэмной разгрузки в начале зоны растяжения. Однако о типе флоэмной разгрузки (симпластный или апопластный) ничего сказать нельзя, поскольку из данной работы неясно, есть ли плазмодесмы между клетками-спутниками и окружающими паренхимными клетками.
Среди огромного числа работ по изучению флоэмиого транспорта лишь немногие посвящены изучению локализации флоэмной разгрузки в корне. Первые исследования в этой области проводили методом микроавторадиографии с использованием соединений, меченных 14С [Eschrich, 1983; Schulz, 1994].
Eschrich исследовал разгрузку флоэмы в воздушных корнях Monstera deliciosa, отличающихся необычайно большими зонами деления и растяжения. Донорный лист он помещал в атмосферу 14С02, и исследовал распределение притекающих в корень 14С-соединений на срезах корня. Метка была обнаружена в зрелых элементах протофлоэмы еще в меристематической зоне. Однако выхода ,4С из протофлоэмы не наблюдали, о чем свидетельствовало отсутствие С в остальных тканях этой зоны. Дальше от кончика корня, там, где начинали дифференцироваться элементы метафлоэмы, 14С обнаруживался кроме элементов протофлоэмы и в других тканях корня, что свидетельствует о том, что в этой зоне происходила разгрузке флоэмы. В еще более базальной области корня, в которой элементы протофлоэмы уже перестали функционировать, 14С обнаруживался в элементах метафлоэмы и также в окружающих тканях, то есть в этой зоне также происходила разгрузка флоэмы. Таким образом, наиболее интенсивная разгрузка флоэмы в воздушном корне Monstera deliciosa происходит в двух местах, в одном из которых происходит дифференциация элементов метаксилемы, а в другом - развитие вторичных клеточных стенок клеток коры. Оба эти участка корня отличаются наибольшей потребностью в углеводах для синтеза вторичных клеточных стенок. Предположили, что между описанными двумя участками флоэмной разгрузки может происходить разгрузка флоэмы в случае возникновения потребности в ассимилятах.
Несколько другую картину наблюдал Schulz, исследуя разгрузку флоэмы в проростках гороха [Schulz, 1994]. Он использовал более грубый метод, анализируя содержание метки 14С в 2,5 см сегментах корня. Наибольшее содержание 14С, свидетельствующее о флоэмной разгрузке, обнаруживали в апикальной части корня, в которую входили корневой чехлик, меристема и зона растяжения.
Эти исследования не давали представления о локализации флоэмной разгрузки в разных зонах растущей части корня. Более точные данные о локализации флоэмной разгрузки были получены при использовании CF, за передвижением по флоэме и разгрузкой которого в корне Arabidopsis thaliana наблюдали с помощью КСЛМ [Oparka et ah, 1994; Zhu et al., 1998]. В этих исследованиях показано не только место флоэмной разгрузки, но также и особенности распространения выходящего из флоэмы CF по клеткам и тканям в зоне разгрузки.
Результаты, полученные в работах Zhu с соавт. [Zhu et al., 1998] и Oparka с соавт. [Oparka et al, 1994], согласуются между собой. В работе Zhu с соавт. показано, что зона флоэмной разгрузки находится в пределах 200-600 мкм от кончика корня, а в работе Oparka с соавт. - в пределах 200-700 мкм от кончика корня.
Zhu с соавт. [Zhu et ah, 1998] не обсуждают приуроченности разгрузки к определенным зонам кончика корня. Но в соответствии с приведенной в данной работе схемой расположения зон, можно заключить, что нижняя граница разгрузки находилась в меристеме, а верхняя - до начала зрелой дифференцированной зоны. После выхода из флоэмы распространение CF от клетки к клетке коррелировало с определенным при помощи электронного микроскопа тканеспецифичным распределением плазмодесм. Так, CF диффундировал в апикальном направлении в большей степени по незрелым клеткам коры и эпидермальным клеткам. Относительно низкий уровень CF был в незрелых проводящих клетках даже в условиях, когда в зоне разгрузки CF накапливался до высокого уровня. Движение разгружающегося из флоэмных окончаний CF было направлено в сторону кончика корня, и не было обнаружено значительного перемещения CF в базипетальном направлении.
С помощью КСЛМ Oparka с соавт. [Oparka et al, 1994] удалось показать, что локализация разгрузки CF четко соответствовала протофлоэме, которая является единственной дифференцированной проводящей системой в апикальной быстро удлиняющейся зоне корня арабидопсиса. Наблюдали градиент флюоресценции во флоэмных окончаниях: флюоресценция уменьшалась по направлению от зрелых ситовидных элементов к незрелым, в которых ситовидные пластинки еще не развиты.
Интенсивная флюоресценция наблюдалась через 20-30 минут. Причем, относительно быстрым было перемещение CF по флоэме, и более медленным было его распространение в примыкающие клетки дистальнее зоны корневых волосков. Из протофлоэмы CF более быстро поступал в клетки перицикла и эндодермы, а затем более медленно в клетки коры. По клеткам коры CF распространялся в направлении апекса корня. Движение краски от клеток коры к ризодерме было ограниченным, хотя через некоторое время CF обнаруживался во всех клетках зоны растяжения. Краска не двигалась базипетально по коре или ризодерме даже через несколько часов, что свидетельствует о существовании полярности транспорта после разгрузки и/или о наличии ограничения в симпластном транспорте в базипетальном направлении. Таким образом, зона корневых волосков не получает CF из протофлоэмы и, по-видимому, не имеет доступа к разгружающимся по симпласту ассимилятам. В этой зоне также не было показано латеральной симпластной разгрузки CF из метафлоэмы. Соответственно, симпластная разгрузка ассимилятов в кончике корня осуществлялась из элементов протофлоэмы.
То, что не обнаружен симпластный транспорт из метафлоэмы, согласуется с точкой зрения о том, что комплекс ситовидный элемент-сопровождающая клетка может быть в большой степени симпластно изолирован. Высказано предположение о том, что отсутствие симпластной разгрузки CF в зоне корня, где развиты элементы метафлоэмы, не исключает возможности апопластнои разгрузки сахарозы из зрелых элементов метафлоэмы в этой зоне.
Распределение активности инвертазы по длине кончиков корней кукурузы, пшеницы и дыни
Изучение активности сахарозосинтазы в корне показало, что этот фермент принимает такое же участие в расщеплении сахарозы в корне, как и в тканях других органов растений [Lyne and ар Rees, 1972].
На проростках гороха был проведен сравнительный анализ активности сахарозосинтазы и растворимых форм инвертазы в апикальных 6 мм корня, а также в коре и стели участка корня гороха 6-24 мм от кончика корня [Dick and ар Rees, 1976]. Было показано, что активность сахарозосинтазы в апикальных 6 мм корня примерно такая же, как активность щелочной инвертазы, и в несколько раз меньше, чем активность кислой инвертазы. Активность сахарозосинтазы была выше в стели, чем в коре [Lyne, ар Rees, 1972], причем активность сахарозосинтазы была выше, чем активность обеих форм инвертазы в стели, а в коре, наоборот, активность сахарозосинтазы была ниже, чем активность обеих форм инвертазы [Dick and ар Rees, 1976].
Данные по распределению активности расщепляющих сахарозу ферментов были сопоставлены с содержанием эндогенных Сахаров - глюкозы, фруктозы и сахарозы - в соответствующих участках корня [Lyne and ар Rees, 1971; Dick and ap Rees, 1976]. Оказалось, что максимальное содержание сахарозы соответствует тем участкам, где активность кислой инвертазы мала, то есть в апикальных 3 мм корня и в стели 6-24 мм от кончика корня. Минимальное содержание сахарозы и максимальное содержание гексоз соответствует высокой активности кислой инвертазы, например, в сегменте 3-9 мм от кончика корня или в коре на участке 6-24 мм от кончика корня. В отличие от кислой инвертазы, активность щелочной инвертазы не соответствует изменению содержания Сахаров по длине корня. Положительная корреляция между содержанием сахарозы и активностью щелочной инвертазы и сахарозосинтазы прослеживается в коре и стели: активность этих ферментов выше там, где выше содержание сахарозы, то есть в стели, и наоборот, там, где содержание сахарозы ниже, активность этих ферментов тоже ниже. Полученные данные позволили заключить, что изменения в активности расщепляющих сахарозу ферментов являются важным аспектом развития корня, а также частью механизма, посредством которого осуществляется регуляция углеводного метаболизма в развивающемся корне.
К изучению активности расщепляющих сахарозу ферментов в корне вернулись лишь в 1989 году [Chapleo and Hall, 1989а]. Авторами данной работы были проведены исследования, хотя и несколько более детальные, но все же подобные тем, которые проводились ранее. В результате были подтверждены известные данные, а также были получены новые сведения о распределении активности расщепляющих сахарозу ферментов в корне. В качестве объекта исследования использовались растения клещевины (Ricinus communis), а активность ферментов, как и в более ранних работах, определяли биохимически в сегментах корня, а также в стели и коре. Впервые было изучено распределение сахарозосинтазы по длине корня, и было показано, что в апикальных 3 мм корня активность сахарозосинтазы мала, в следующем 3-мм сегменте немного увеличивается, а далее от кончика корня остается неизменной. Кроме того, впервые была изучена активность инвертазы клеточной стенки по сегментам корня, а также в коре и стели корня. Было показано, что активность инвертазы клеточной стенки очень мала, в несколько раз ниже активности вакуолярной инвертазы, и по длине корня практически не меняется, лишь незначительное увеличение активности отмечено в 3-6 мм от кончика корня. В коре активность инвертазы клеточной стенки, как и вакуолярной инвертазы, несколько выше, чем в стели.
С развитием методов молекулярной биологии стало возможным изучать экспрессию различных генов. Благодаря этому, была изучена экспрессия генов нескольких изоформ инвертазы в различных органах растения, в том числе, и в корнях нескольких видов растений. Данные по экспрессии генов вакуолярной инвертазы в корнях, полученные в этих исследованиях, хорошо согласуются с активностью этой формы фермента, показанной ранее биохимически. Так, в апикальных 1 см кончиках корней проростков кукурузы была обнаружена мРНК генов двух изоформ вакуолярной инвертазы Ivrl и Ivr2 [Xu et al., 1996], в корнях бобов была обнаружена мРНК гена еще одной изоформы вакуолярной инвертазы VJVCINV [Weber et al., 1995].
Данные по экспрессии генов инвертазы клеточной стенки не столь однозначны. Так, например, в корнях бобов экспрессия гена инвертазы клеточной стенки V/CWINV2 была, ниже, чем экспрессия гена вакуолярной инвертазы VJVCINV [Weber et al., 1995], что хорошо согласуется с показанным биохимическими методами соотношением активности этих форм инвертазы в корнях других растений. Обнаруженная высокая экспрессия генов других изоформ инвертазы клеточной стенки CINI и Afitfrctl соответственно в корнях Chenopodium rubrum [Roitsch et al., 1995] и Arabidopsis thaliana [Tymowska-Lalanne et al., 1996] вступает в некоторое противоречие с данными биохимических исследований, показывающих низкую активность инвертазы клеточной стенки в корнях других видов растений. Экспрессия генов двух изоформ инвертазы клеточной стенки pDCl 11 npDC141 отсутствовала в корнях картофеля [Hedley et al., 1994], возможно, что в них экспрессируется какая-то еще изоформа инвертазы клеточной стенки.
Метод in situ гибридизации позволяет выявить мРНК данного белка в отдельных клетках и тканях. С помощью этого метода было изучено распределение мРНК гена изоформы вакуолярной инвертазы Ivr2 по клеткам и тканям кончика корня кукурузы [Wu and Koch, 2000). мРНК Ivr2 была обнаружена в эпидермисе по всей исследованной поверхности кончика корня, кроме области непосредственно примыкающей к чехлику, а также в стели в области проводящих тканей и во внутренних клетках многослойного перицикла на расстоянии начиная от 2 мм от кончика корня и дальше, предположительно до 5-8 мм от кончика корня. Данные, полученные этими методами, не могут точно отражать активность ферментов, поскольку само по себе наличие мРНК не может свидетельствовать о том, что будет синтезирован белок, поскольку его синтез может не произойти из-за возможной посттранскрипционной регуляции.
Для изучения ферментов в отдельных клетках и тканях возможно также применение иммуноцитохимического метода, позволяющего выявить наличие белка изучаемого фермента. С применением этого метода было исследовано распределение двух изоформ сахарозосинтазы SS1 и SS2 в корнях ячменя [Guerin and Carbonero, 1997]. Изоформа SSI была обнаружена в клетках корневого чехлика, а также вдоль проводящего пучка, на расстоянии начиная от 600 мкм от кончика корня, сразу же после меристемы. Изоформа SS2 не была обнаружена в клетках корня. Этот метод также не дает достоверной информации об активности фермента, поскольку имеющийся белок может быть неактивен вследствие наличия ингибиторов или других регуляторных факторов.
Для того чтобы определить наличие активности фермента в отдельных клетках и тканях необходимо использовать гистохимический метод. Он также имеет существенный недостаток - невозможность оценить количественно активность фермента. Поэтому более полную картину об активности фермента в изучаемом органе можно получить при использовании одновременно двух методов - гистохимического, позволяющего определить наличие активной инвертазы в отдельных клетках и тканях, и биохимического метода, позволяющего количественно оценить активность фермента, хотя и не на клеточном уровне, а в сегментах исследуемых органов. Такие исследования на кончике корня не проводились.
Дополнительное окрашивание проционовым красным 2BS срезов, исследованных на активность ферментов
Одним из способов изучения флоэмной разгрузки является использование флюоресцентных красителей, которые транспортируются по флоэме вместе с флоэмным током и выходят из флоэмных окончаний в местах разгрузки. В данной работе для определения места разгрузки флоэмы использовали флюоресцентный краситель карбоксифлюоресцеиндиацетат (CFDA), который применялся ранее другими исследователями для этой же цели [Wang and Fisher, 1994; Wang et al., 1994]. Так как при работе с интактными корнями, флюоресценцию CF с помощью флюоресцентного микроскопа можно наблюдать только на тонких корнях, нами были изучены корни проростков дыни, арабидопсиса, льна, томатов и огурца. В целом, на разных растениях были получены сходные результаты.
Более детально изучали выход CF в апексе корня на проростках дыни. Флюоресценцию CF можно было наблюдать в кончике корня через 20-30 минут после нанесения CFDA на семядоли проростка. Флюоресценция проявлялась в виде слабого свечения узкой полоски, расположенной на расстоянии 590±85 мкм от кончика корня. По мере увеличения длительности экспозиции свечение разгружающегося CF становилось более ярким, а флюоресцирующая полоска расширялась. Нижняя граница флюоресцирующей полоски, расположенная ближе к кончику корня, изменялась незначительно в течение всего времени экспозиции - до 10 часов: она слабо сдвигалась по направлению к кончику корня. Верхняя граница полоски флюоресценции CF, расположенная дальше от кончика корня, с течением времени отодвигалась весьма существенно. Так, через 1,5 часа после начала экспозиции верхняя граница полоски флюоресценции CF наблюдалась в области 880±80 мкм от кончика корня, через 4 часа - в области 1130±100 мкм от кончика корня и через 10 часов - в области 1720±180 мкм от кончика корня (рис. 3).
На основании измерений размеров клеток корня установили, что рост клеток растяжением начинался на расстоянии около 1250 мкм от кончика. Соответственно, нижняя граница флюоресценции CF, а, значит, и симпластной разгрузки флоэмы, находилась примерно в середине зоны меристемы. При коротких экспозициях (до 1,5 часов) накопление CF наблюдали в базальной половине этой зоны. При более длительных экспозициях (до 10 часов) яркую флюоресценцию отмечали также и в зоне растяжения. Одной из причин регистрируемой в этой области корня флюоресценции могло быть сохранение при росте клеток растяжением CF, разгрузившегося еще в меристематические клетки. Однако усиление интенсивности флюоресценции в растягивающихся клетках свидетельствует скорее о том, что симпластный выход CF из флоэмы происходил и в этой зоне корня или краситель по плазмодесмам поступал из меристемы. Показано, что все клетки меристемы и зоны растяжения связаны плазмодесмами [Warmbrodt, 1985, 1986; Zhu et al., 1998; Ma, Peterson, 2001], а также имеется целый ряд данных, свидетельствующих о том, что разгрузка в растущих потребляющих акцепторах симпластная [Giaquinta et al, 1983; Farrar, 1985; Warmbrodt, 1985; Oparka, 1994; Schulz, 1995]. В то же время какое-то количество ассимилятов, в отличие от CF, может разгружаться и по апопластному пути.
В корнях проростков арабидопсиса через 2 часа после нанесения CFDA на семядоли на всем протяжении корня наблюдали флюоресценцию в виде двух тяжей, соответствующих проводящим пучкам. Это свидетельствует о том, что существенного выхода CF из флоэмы, т.е. симпластной разгрузки, в дифференцированных областях корня не происходило. Ближе к кончику корня было отчетливо выражено накопление CF (рис. 4а). Подобную картину наблюдали в работах [Орагка et al., 1994; Zhu et al., 1998]. Таким образом, разгрузка CF в корнях проростков арабидопсиса существенно не отличалась от разгрузки в корнях дыни - накопление CF было отчетливо выражено вблизи кончика корня. Сходную локализацию флюоресценции CF наблюдали также в кончиках корней льна, огурца, томатов.
При изучении разгрузки CF в проростках арабидопсиса, корни которых имели молодые боковые корни, наблюдали интенсивную флюоресценцию в апексе молодого бокового корня, а в апексе главного корня свечения практически не было. Возможно, это указывает на то, что молодой боковой корень является более сильным акцептором, чем главный корень. Возможно также, что CF достигает в первую очередь те акцепторные органы, которые находятся ближе на пути следования от донорных органов (рис. 46).
Наши результаты согласуются с полученными ранее на корнях арабидопсиса [Oparka et al., 1994: Zhu et al., 1998]. В этих работах также разгрузку наблюдали в кончике корня, в области дифференциации протофлоэмных элементов. Мы показали, что и на корнях растений из других семейств (дыни, огурцов, томатов и льна) разгрузка флоэмы осуществляется также в самом кончике корня. Это позволяет предполагать, что в корнях разных растений наблюдается общая закономерность - накопление притекающего сверху CF сначала в базальной части меристемы, а затем и в начале растяжения. В литературе не было данных о том, как соотносится в корне место разгрузки флоэмы и распределение активности расщепляющих сахарозу ферментов - инвертазы и сахарозосинтазы.
Распределение активности расщепляющих сахарозу ферментов инвертазы и сахарозосинтазы в кончиках корней изучали гистохимическим методом [Sergeeva, Vreugdenhil, 2002]. В контрольных определениях (см. обозначения на подписях к рисункам) кончики корней или срезы инкубировали без добавления субстрата реакции (сахарозы). В этом случае во всех опытах не наблюдали синего окрашивания, которое должно было бы возникнуть в результате ряда реакций после расщепления сахарозы инвертазой или сахарозосинтазой. На этом основании можно считать, что появляющееся синее окрашивание отражает активность фермента. В работе проводили более 10 опытов, которые дали сходные результаты.
Распределение синего окрашивания, отражающего активность инвертазы, менялось по длине кончиков корней всех трех видов изученных растений сходным образом (рис. 5а-в). Активность инвертазы выявлялась в корневом чехлике. Наиболее интенсивно окрашивались апикально расположенные зрелые и слущивающиеся клетки. В клетках апикальной половины меристемы активность инвертазы выявлялась только в клетках ризодермы, в остальных клетках этой области реакции не выявлена. В этой области корня пролиферативная активность клеток наиболее высокая. Поэтому можно полагать, что процесс деления клеток не требует активности инвертазы.
