Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Прорастание и рост мужского гаметофита покрытосеменных
1.1 .Зрелое пыльцевое зерно 6-10
1.2. Межклеточные взаимодействия в системе пыльца-рыльце... 10-11
1.2.1. Адгезия пыльцевых зерен 11-12
1.2.2. Гидратация пыльцевых зерен 12-14
1.2.3. Прорастание пыльцевых зерен 15-17
1.3. Организация пыльцевой трубки 17-19
1.4. Рост пыльцевых трубок 19-28
1.5. Факторы прорастания и роста мужского гаметофита в культуре in vitro 28-29
1.5.1. Углеводы 29-30
1.5.2. Бор 30-32
1.5.3. Кальций 32-34
1.5.4. Флавонолы 34-37
1.5.5. Фитогормоны 36-42
1.5.5.1. Жасмоновая кислота 38-39
1.5.5.2. Салициловая кислота 39-40
1.5.5.3. Гиббереллины 40-41
1.5.5.4. АБК 41
1.5.5.5. Цитокинины 42-43
1.5.5.6. Этилен и ИУК 43
1.6. Цель исследования 43-44
Глава 2. Объект и методы исследований
2.1. Характеристика объекта исследования 45-46
2.2. Вегетативное размножение клонов петунии 46
2.3. Культивирование пыльцевых трубок in vitro 46
2.4. Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов in vitro на прорастание и рост пыльцевых трубок 47
2.5. Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов in vivo на прорастание и рост пыльцевых трубок 47
2.6. Определение содержания ИУК и цитокининов методом ВЭЖХ 47-49
2.7. Оценка изменений цитоплазматического рН (рНс) в прорастающем in vitro мужском гаметофите под действием фитогормонов 49-50
2.8. Определение содержания суммы растворимых фенольных соединений и флавонолов 50
Глава 3. Оптимизация среды для прорастания и роста мужского гаметофита петунии в культуре in vitro
3.1. Сахароза 51-52
3.2. Бор 53
3.3. Кальций 53
3.4. Среда культивирования А 53-56
3.5. Среда культивирования Б 57-59
3.6. Использование агар-агара 60-61
Глава 4. Гормональная регуляция прорастания и роста мужского гаметофита петунии
4.1. Эффекты экзогенных фитогормонов и их ингибиторов на in vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самосовместимого клона 62-75
4.1.1. Гиббереллин А3 63-65
4.1.2. АБК 65-69
4.1.3. ИУК 70-75
4.2. Эффекты экзогенных фитогормонов и их ингибиторов на in vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самонесовместимого клона 75
4.3. Синтетический цитокинин 6-БАП 78-80
4.4. Влияние экзогенных фитогормонов на рост пыльцевых трубок in vivo 80-81
4.5. Влияние экзогенных фитогормонов на изменение внутриклеточного рН (рНс) прорастающего in vitro мужского гаметофита петунии 81 -87
4.5.1. ИУК 83
4.5.2. АБК 83
4.5.3. Гиббереллин Аз 83
4.5.4. 6-БАП 83
4.6. Обсуждение 88-89 .
Глава 5. Флавонолы в регуляции развития, прорастания и роста мужского гаметофита петунии in vitro и in vivo
5.1. Динамика содержания суммы растворимых фенольных соединений и флавонолов в системе пыльник-мужской гаметофит. 90-92
5.2. Динамика содержания суммы растворимых фенольных соединений и флавонолов в прорастающем in vitro мужском гаметофите..92-94
5.3. Динамика содержания и локализация растворимых фенольных соединений и флавонолов в системе пыльца-пестик 94-102
5.4. Влияние экзогенных флавонолов на прорастание и рост in vitro мужского гаметофита 102-109
5.4.1. Кверцетин 102-105
5.4.2. Кемферол 106-109
5.5. Влияние экзогенных флавонолов на прорастание и рост in vivo мужского гаметофита 109-110
5.6. Возможность участия флавонолов в качестве эндогенных регуляторов транспорта ИУК в процессах развития, прорастания и роста мужского гаметофита 111-114
5.7. Обсуждение 114-116
Заключение 117-129
Выводы 130-131
Список литературы 132-163
- Межклеточные взаимодействия в системе пыльца-рыльце...
- Факторы прорастания и роста мужского гаметофита в культуре in vitro
- Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов in vitro на прорастание и рост пыльцевых трубок
- Эффекты экзогенных фитогормонов и их ингибиторов на in vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самонесовместимого клона
Введение к работе
Независимо от того, прорастает ли пыльцевое зерно in vivo - на воспринимающей поверхности рыльца пестика или in vitro - на среде культивирования, в нем происходит реорганизация цитоплазмы и элементов цитоскелета для обеспечения выхода пыльцевой трубки. Эти изменения происходят в течение нескольких минут после гидратации и включают поляризацию актинового цитоскелета (Tiwari and Polite, 1988), переориентацию вегетативного ядра (Lalanne and Twell., 2002), концентрацию митоходрий и полисахаридов в кончике пыльцевой трубки (Mazina et al., 2002). В процессе гидратации пыльцевое зерно из неполярной клетки превращается в высоко поляризованную клетку (Edlund et al., 2004). Механизм, лежащий в основе процесса поляризации не ясен, несмотря на то, что в последние десять лет процессы, вовлеченные в регуляцию роста пыльцевой трубки, постоянно привлекали внимание исследователей (Mascarenhas, 1993; Pierson et al., 1994; Nasrallah, 1994; Feijo et al., 1995; Hepler, 1997; Wolters-Arts et al., 1998; Messerli, Robinson, 1998; Franklin-Tong, 1999; Матвеева, Ермаков, 1999; Geitmann et al., 2000; Nasrallah, 2000; Gu et al., 2005; Yoon et al., 2006). Сигнал поляризации в конечном счете активизирует ROP1, GTP-связанный белок, вовлеченный в динамику F-актина и установление градиентов кальция в кончике пыльцевой трубки (Gu et al., 2003). Остаются невыясненными молекулярные и регуляторные механизмы прорастания и роста пыльцевой трубки, в том числе идентификация внешних и внутренних сигналов, которые регулируют ROP1-сигнальный комплекс и характеристика молекулярной связи между сигналами hROPI GTPase.
В качестве кандидатов на участие в этом процессе рассматриваются ионы (Feijo et al., 1995), липиды (Lush et al., 1998; Wolters-Arts et al., 1998) и фитогормоны (Ковалева и др., 2000; 2002; Kovaleva & Zakharova, 2003; Ковалева и др., 2004; 2005). Данная работа является продолжением начатых ранее исследований и направлена на изучение факторов гормональной регуляции прорастания и роста пыльцевых трубок.
Межклеточные взаимодействия в системе пыльца-рыльце...
Структура и метаболизм рыльца, приспособленные к восприятию пыльцы, создают условия для ее адгезии, гидратации и прорастания, обеспечивая осмотический баланс и достаточное снабжение водой и питательными веществами (Knox, 1984).
Адгезия является фундаментальным свойством всех клеток, которая инициирует процесс межклеточного узнавания. Адгезия пыльцевых зерен, как первый этап взаимодействия пыльцы и рыльца, обусловлена высокой вязкостью и клейкостью экссудата рыльца растений.
Анализ компонентов пыльцы и пестика гладиолуса показал, что адгезивные свойства могут проявлять арабиногалактановые белки, моносахариды, гликопротеины и гликолипиды (Clarke et al, 1979).
При изучении опыления у Brassica oleracea (сухой тип рыльца) в системе пыльца-рыльце были выявлены четыре типа межклеточного связывания (Ferrary et al, 1985). Сразу после контакта пыльцы с папиллами рыльца осуществлялось первичное связывание, которое наблюдалось как в случае совместимого, так и несовместимого опыления. Вторичное связывание наблюдалось через 15 минут после контакта и продолжалось примерно 90 минут до выхода пыльцевых трубок. Следующий тип связывания наблюдали только в случае несовместимого опыления при контакте пыльцевой трубки с кутикулой. Последний тип связывания происходил между растущей пыльцевой трубкой и поверхностью папиллы рыльца (Ferrary et al, 1985). Авторы высказали предположение, что ферментативно регулируемый процесс липидной полимеризации, возможно, служит механизмом связывания мужского гаметофита с папиллой рыльца, представляя альтернативу процессу агглютинации, с участием гликопротеинов или лектинов, как полагали другие авторы (Clarke and Gleeson, 1981).
На рыльцах трансгенных растений Brassica было установлено, что адгезия пыльцевых зерен зависит от гликопротеинов SLG (S-locus glycoprotein) и SLR1 (S locus related protein) (Luu et al., 1999). Оба белка взаимодействуют in vitro с белками оболочки пыльцы (PCPs), цистеин-богатыми белками, которые экспрессируются в мужском гаметофите (Doughty et ah, 1993).
У лилии показана адгезия между пыльцевыми трубками, а также между пыльцевой трубкой и эпидермисом проводникового тракта столбика (Park et al., 2000; Mollet et al., 2000; Lord, 2001; Lord and Mollet, 2002; Lord, 2003). Установлено, что в зоне адгезии между пыльцевой трубкой и поверхностью клеток столбика присутствуют арабиногалактановые белки. Эти белки выявлены также в стенке пыльцевой трубки, однако, в ее апикальной части они отсутствуют (Li et al., 1995). Исследование адгезии пыльцевых трубок и матрикса столбика в культуре in vitro позволило авторам выявить два соединения, связанные с адгезией в рыльце и столбике: специфический полисахарид и цистеин-богатый белок SCA (stigma/stylar cystein-rich adhesin). Было установлено, что SCA не синтезируется в пыльце, но пыльца связывает его как in vivo, так и in vitro (Mollet et al., 2000; Lord, 2001; 2003).
Пыльца освобождается из пыльника в дегидратированном (содержание воды - 15-35%) и метаболически мало активном состоянии (Heslop-Harrison, 1979). При попадании на рыльце пестика, пыльцевые зерна абсорбируют воду и питательные вещества, после чего начинают прорастать (Taylor and Hepler, 1997).
В процессе гидратации пыльцевые зерна набухают, при этом перестраиваются организация цитоплазмы и ее метаболизм, возрастает осмотическое давление, которое приводит к разрыву апертуры пыльцевого зерна. Предполагают, что в месте появления пыльцевой трубки целостность интины нарушается вследствие активации ферментов (Makinen and Brewbaker, 1967; Knox and Heslop-Harrison, 1970), которые совместно с осмотическим давлением обеспечивают выход пыльцевой трубки. Общий объем пыльцевого зерна варьирует между отдельными видами, но у всех изученных видов максимальный объем пыльцевого зерна наблюдали при появлении пыльцевой трубки (Heslop-Harrison, 1987).
Предполагается, что запасенная в процессе развития пыльцевого зерна мРНК транслируется на полирибосомах, которые формируются на протяжении гидратации пыльцевого зерна (Taylor and Helper, 1997). Одновременно с этим в процессе гидратации активируются дыхание и окислительное фосфорилирование (Hoekstra, Bruinsma, 1979).
Цингер и Петровская-Баранова в 1961 году показали, что в среднем слое интины содержатся белки, которые выходят из мужского гаметофита на поверхность рыльца в процессе гидратации пыльцевых зерен. Эти белки представляют собой нуклеазы, протеазы, кутиназы, карбогидразы и другие ферменты. Они являются продуктами гаплоидного поколения, так как секретируются из микроспор или позднее из вегетативной клетки мужского гаметофита.
Разнообразная природа экссудата рылец у растений различных семейств наводит на мысль о существовании у них различных механизмов гидратации (Heslop-Harrison and Heslop-Harrison, 1992). У видов с влажными рыльцами, таких как Lilium, экссудат содержит большое количество воды и служит благоприятной средой для прорастания пыльцы. Однако у этих видов пыльца покрыта липидным слоем и показано, что липиды играют важную роль в гидратации пыльцы и проникновении ее в ткани рыльца. Длинноцепочечные липидные молекулы в оболочке пыльцы арабидопсиса также вовлечены, как полагают, в последующий процесс гидратации пыльцы (Pruitt, 1997; Wilhelmi andPreuss, 1999).
Липидная компонента экссудата влажного рыльца играет существенную роль в процессе полярного роста пыльцевой трубки в тканях столбика у петунии (Wolters-Arts et al., 1998). Предполагают, что длинноцепочечные липиды действуют в качестве сигнала к стимулированию гидратации, но не ясно, играют ли они какую-либо роль в сохранении запаса воды в рыльце, что является важным для проникновения и продвижения пыльцевых трубок в тканях пестика.
Факторы прорастания и роста мужского гаметофита в культуре in vitro
В пыльце, во время ее созревания в пыльнике, аккумулируется высокий уровень углеводов (Stanley and Linskens, 1974; Pacini, 1996; Добровольская 2006). Пыльцевые зерна используют углеводы как источник энергии и превращают их в материал для построения стенки пыльцевой трубки - пектин, целлюлозу и каллозу (Mascarenhas, 1993; Derksen et al., 1995). Первичный источник углеводов находится в фотосинтезирующих листьях, где происходит их ассимиляция. Затем углеводы транспортируются по флоэмным тканям пыльника и апопласт столбика в форме сахарозы (Bush, 1993). У петунии клетки проводникового тракта пестика содержат хлоропласты, и это способствует прямому перемещению углеводов в апопласт столбика (Jansen et al., 1992). В апопласте проводникового тракта столбика сахароза проникает в растущую пыльцевую трубку, и благодаря наличию фермента инвертазы, в ней происходит превращение сахарозы в глюкозу и фруктозу (Ylstra et al., 1998).
В среде культивирования пыльцевых трубок углеводы контролируют осмотическое давление и служат субстратом для их метаболизма. Было обнаружено, что при прорастании пыльцы на растворе сахара увеличивается количество крахмала в пыльцевых трубках, что авторы связывали с необходимостью получения пыльцевыми трубками питательных веществ извне (Ylstra et al., 1998). Очевидно, сахара служат источником питания растущих пыльцевых трубок и важным источником энергии. Высокий уровень метаболизма сахарозы наблюдали в пыльце петунии при образовании трубок в первые 15 минут культивирования (Ylstra et al., 1998).
Различные транспортеры Сахаров были выделены из растений (Bush, 1993). У петунии был выделен РМТ1 (petunia monosaccharid transporter 1), который высоко гомологичен растительным транспортерам моносахаридов. РМТ1 принадлежит к небольшому семейству генов и специфично экспрессируется в мужском гаметофите. РМТ1 активируется в пыльце после первого митоза, высокий уровень мРНК транскриптов аккумулируется в зрелом пыльнике, в прорастающей пыльце и в растущих пыльцевых трубках (Ylstra et al., 1998). С помощью РМТ1 моносахариды переносятся через мембрану пыльцевой трубки. РМТ1 действует как симпортер, который переносит моносахариды вместе с протонами. Для этого необходима энергия в форме АТФ. В 1994 году Houline and Boutry выделили ЬҐ-АТФазу, АНА9, из плазмалеммы пыльцы у арабидопсиса (Houline and Boutry, 1994). Перенесенные транспортером через мембрану пыльцевой трубки моносахариды используются в процессе роста пыльцевой трубки для образования каллозных пробок, синтеза стенки и дыхания (Ylstra et al., 1998).
Бор является широко распространенным микроэлементом, влияющим на продуктивность растений. Дефицит бора является причиной мужской стерильности, гибели растущих меристем, задержки развития цветка, образования семян и плодов (Dell and Huang, 1997). Бор стимулирует АТФазную активность Н+-помпы и способствует поглощению ионов К+ (Benderdour et al., 1998). Бор повсеместно присутствует в почве, в виде борной кислоты и в этой форме поступает в клетку через корни на протяжении всей жизни растения. Полагают, что борная кислота вместе с молекулами воды может транспортироваться в клетку путем диффузии через липидный бислой биологических мембран и/или через аквапорины. Аквапорины -трансмембранные протеины с 6 мембранными доменами и молекулярной массой 26-30 Ша. Они относятся к МІР семейству, которое является древним семейством белков, и присутствует у млекопитающих, амфибий, дрожжей, бактерий и растений (Chrispeels et al., 1999).
Бор является необходимым элементом для прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок (Benderdour et al., 1998; Blevins and Lukaszewski, 1998, Brown et al., 2002). Бор влияет на водный баланс пыльцы. Во многих случаях пыльцевые зерна быстро поглощают воду и разрываются при отсутствии осморегуляторов в среде. Бор играет роль в транслокации Сахаров. Транслокация Сахаров является активным процессом, для которого необходима энергия для движения Сахаров через плазматическую мембрану. Способность ионов бора образовывать боратно-углеводные комплексы может облегчать вход Сахаров в клетку (Linskens and Kroh, 1970).
В экспериментах in vitro с использованием микросомальной фракции зрелой пыльцы лилии (Obermeyer et al., 1996) было установлено, что бор стимулирует активность ЬҐ-АТФазьі плазмалеммы. Одновременно наблюдали небольшую гиперполяризацию мембраны. На основании полученных данных авторы высказали предположение, что бор, воздействуя на электронтранспортную систему плазмалеммы, может стимулировать прорастание и рост пыльцевых трубок (Obermeyer et al., 1996).
Хемотропный эффект бора впервые доказали Robbertse с сотр. в 1990 году. Они исследовали влияние бора на рост пыльцевых трубок петунии в системе semi-in vivo. Пыльцевые трубки росли по направлению к источнику бора. Также было показано, что пыльца многих видов растений дефицитна по бору, но зато в рыльцах и столбиках этого элемента содержится очень много, что позволяет предполагать участие градиента бора в регуляции роста пыльцевых трубок и в условиях in vivo (Robbertse et al., 1990).
Методика изучения эффектов экзогенных фитогормонов и флавонолов in vitro на прорастание и рост пыльцевых трубок
В бутоны петунии самосовместимого клона (за 1 сутки до раскрытия) с помощью микропипетки вводили водные растворы фитогормонов (гиббереллина Аз, АБК, ИУК), 6-БАП в концентрации 10"5М и флавонолов (кверцетина и кемферола) в концентрациях от 10"12М до 10"8М. Контрольные бутоны обрабатывали водой. Опыление проводили пыльцой из раскрытых цветков. Через месяц подсчитывали количество завязавшихся семян. Опыты проводили в 3-х биологических повторностях. Содержание ИУК и цитокининов определяли по методу (Скоробогатова,
Захарова и др., 1999). Навеску растительного материала заливали охлажденным 80% водным метанолом в соотношении 1:20 и оставляли при 4С в холодильнике на две недели. Затем растительную массу отфильтровывали и метанольный раствор упаривали до водного остатка, который затем подкисляли 1% раствором НС1 до рН 2-3. Подкисленный водный остаток очищали трехкратной экстракцией гексаном в соотношении 1:1. Гексановые экстракты отбрасывали и к водному остатку добавляли 1% раствор антиоксиданта (неозон Д - 1 мл на пробу). Все пробы доводили до одного объема дистиллированной водой. Затем эти растворы трижды экстрагировали на качалке этилацетатом в соотношении 1:1 (30 мин при 200 об/мин). Этилацетатные вытяжки объединяли, упаривали досуха и оставляли для определения индолилуксусной кислоты. Оставшийся после экстракции водный остаток доводили 20%-ным раствором КОН до рН 8 и два раза экстрагировали бутанолом, насыщенным водой (30 мин при 200 об/мин). Бутанольную фракцию упаривали досуха и оставляли для определения цитокининов.
Для определения цитокининов (зеатина), сухой бутанольный остаток растворяли в 2 мл 80%-ного метанола. Метанольный экстракт пропускали через колонку, заполненную 0.51 г поливинилпирролидона (Polyclar AT, Serva). Цитокинины элюировали 80%-ным раствором метанола с добавлением концентрированного аммиака и упаривали досуха. Полученные пробы анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Условия хроматографирования при работе приборов фирмы Biotronic: детектор ультрафиолетовый, длина волны 268 нм, колонка Ultrapac Column Lichrosorb RP 18.5 мкм, размер 4x250 мм. Элюэнт - система растворителей: ацетонитрил-вода-уксусная кислота (55:44:1). Скорость элюации 0.5 мл/мин, время удерживания зеатина - 7 мин. Идентификацию зеатина проводили сравнением времен удерживания стандартного зеатина (Calbiochem) с природным. Минимальная регистрируемая концентрация зеатина составила 30 нг в аликвоте пробы (20 мкл).
Сухой этилацетатный остаток растворяли в 2 мл фосфатного буфера (рН 8) и пропускали через колонку с поливинилпирролидоном - 0.51г. Элюировали фосфатным буфером и собирали во фракции для определения ИУК (объемом 2 мл каждая). Фракции подкисляли 1% раствором НС1 до рН 2-3 и два раза экстрагировали диэтиловым эфиром (30 мин при 200 об/мин). Полученные пробы анализировали методом ВЭЖХ.
Условия хроматографирования для определения ИУК: детектор флуоресцентный RF-530 (Shimadzu). Em - 350 нм, Ex - 280 нм, колонка Ultrapac Column Lichrosorb RP 18.5 мкм, 4x250 мм. Элюэнт - 40% раствор метанола, скорость элюации 0.3 мл/мин, время удерживания 5 мин. Идентификацию ИУК проводили при сравнении времени удерживания стандартной ИУК (Sigma) с природной. Минимальная регистрируемая концентрация ИУК составила 250 пкг в аликвоте пробы (20 мкл). Опыты проводили в двух биологических и двух аналитических повторностях. Ошибка методов определения содержания фитогормонов не превышала 20%.
Внутриклеточный рН (рНс) пыльцевых зерен оценивали после их предварительной нагрузки флуоресцеин диацетатом или 2 ,7 -бис(2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеина ацетоксиметиловым эфиром. Как липид-растворимые эфиры эти соединения способны проникать через плазматическую мембрану внутрь клеток и превращаться в цитозоле в результате отщепления от них ацетильных групп под действием цитозольной эстеразы соответственно во флуоресцеин и 6-карбоксифлуоресцеин. Как заряженные гидрофильные флуорофоры, они остаются в цитозоле и характеризуются выраженной рН-зависимостыо спектров возбуждения и флуоресценции (Graber et al., 1986; Fricker et al., 1997). На основании измерений интенсивностей флуоресценции образцов при 530 нм, возбуждаемой при 440 (F44o) и 490 (F490) нм, рассчитывали величину отношения F490/F440 как меру рНс (Трофимова и Молотковский, 1988; Fricker et al., 1997). Процесс прорастания пыльцевых зерен инициировали при 25-26С, помещая их на 1, 2 и 4 часа в водную среду, содержащую 0.4 М сахарозу и 1.6 мМ Н3ВО3 (рН 6.83). После этого пыльцевые зерна помещали на 15 мин в среду загрузки, содержащую 0.3 М сахарозу, 0.25 мМ Mes-Трис (рН 6.9) и 5 мкМ рН-индикатор, отмывали от красителя и помещали в 1 мл буферной среды того же состава. Измерения флуоресценции проводили на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi (Япония). В экспериментах, тестирующих эффекты экзогенных гормонов на величину рНс мужского гаметофита, использовали водные растворы соответствующих гормонов: гиббереллина Аз, АБК, ИУК, синтетического цитокинина 6-БАП в концентрации 5мкМ. Все эксперименты проводили в трех биологических и пяти аналитических повторностях.
Свежесобранную пыльцу (10 мг) проращивали в течение 6-ти часов при 25-26С на среде, содержащей 0.4 М сахарозу и 1.6 мМ Н3ВОз, затем промывали дистиллированной водой и фиксировали 70% этанолом (1 час, перемешивая на качалке). Навеску 50-150 мг свежесобранного материала (пыльников, пыльцевых зерен, пестиков, а также рылец, столбиков и завязей) растирали в ступке и подвергали экстракции 70% этанолом (перемешивая на качалке в течение 1 часа). Полученный этанольный экстракт отфильтровывали, и в нем спектрофотометрическим методом определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений с реактивом Фолина-Дениса (поглощение при 725 нм) (Запрометов, 1971). Содержание флавонолов определяли с 0.5%-ным водным раствором хлористого алюминия (поглощение при 415 нм) (Gage and Wendei, 1950). Калибровочные кривые в обоих случаях строили по рутину. На графиках представлены средние арифметические из 3-5 определений и их стандартные отклонения. Разница между средними величинами опыта и контроля была достоверна при 5% уровне значимости (Р 0.05).
Эффекты экзогенных фитогормонов и их ингибиторов на in vitro прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок петунии самонесовместимого клона
Экзогенные фитогормоны (ГА3, АБК и ИУК) стимулировали прорастание пыльцы петунии самонесовместимого клона в меньшей степени, чем самосовместимого, но ГА3 оказал максимальный эффект на рост пыльцевых трубок (их длина составляла 600}ш) (Приложение 1. Рис. 33-38). Флуридон (ингибитор синтеза АБК), паклобутразол (ингибитор синтеза гиббереллинов), 2,4-хлорфенокси-2-метилпропионовая кислота (ингибитор транспорта ИУК) ингибировали прорастание и рост пыльцевых трубок самонесовместимого клона, также как и в случае самосовместимого клона. В отличие от ГАз, АБК и ИУК, при внесении в среду культивирования пыльцевых зерен петунии синтетического цитокинина 6-БАП в концентрациях 10" М-10 М (рис. 17) мы наблюдали ингибирование прорастания пыльцы (как на среде А, так и на среде Б). При использовании концентрации 10 М мы наблюдали 100% ингибирование прорастания и роста пыльцевых трубок. Если принять за 100% интенсивность прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии на среде без гормона, то эффект 6-БАП можно выразить в % к контролю (табл.8 и 9). 6-БАП ингибировал прорастание и рост пыльцевых трубок самосовместимого клона в течение 6-ти часов В прорастающих in vitro мужских гаметофитах петунии двух клонов выявлены резкие различия в содержании цитокининов, в отличие от ГА3, АБК и ИУК, содержание которых незначительно различались между клонами. Если прорастание и рост пыльцевых трубок самосовместимого клона проходило при приблизительно постоянном уровне цитокининов (40±6.84 нг/г сырой массы), то рост пыльцевых трубок самонесовместимого клона в течение 2-6 часов сопровождался постепенным подъемом уровня цитокининов и достигал 255±8.2 нг/г сырой массы. Ранее Захаровой было установлено 5-кратное повышение содержания цитокининов в опыленных пестиках самонесовместимого клона петунии (Kovaleva & Zakharova, 2003). Все вышеизложенное позволило связать повышенный уровень цитокининов в in vitro прорастающей пыльце самонесовместимого клона с функционированием механизма гаметофитной самонесовместимости, характерным для этого клона петунии. Введение фитогормонов (ГАз, АБК и ИУК) в развивающиеся бутоны петунии самосовместимого клона (за 1-2 суток до их раскрывания) стимулировало прорастание и рост in vivo пыльцевых трубок, о чем мы судили по числу завязавшихся семян (табл.10). Введение синтетического цитокинина 6-БАП в развивающиеся бутоны петунии самосовместимого клона привело к незначительному снижению числа завязавшихся семян (табл. 10). Таблица 10. Таким образом, установлено, что фитогормоны способны включаться в регуляцию как in vitro, так in vivo прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии.
Экзогенные ИУК, АБК и гиббереллин А3 стимулировали прорастание и рост петунии двух клонов. АБК и гиббереллин А3 стимулировали прорастание, а рост пыльцевых трубок стимулировал только гиббереллин Аз. Максимальный стимуляторный эффект наблюдали в концентрации 10 М для всех трех фитогормонов. Синтетический цитокинин 6-БАП, напротив, ингибировал как прорастание , так и рост мужского гаметофита. Максимальный ингибиторный эффект 6-БАП проявлял в концентрации 10 3М. Мужской гаметофит самонесовместимого клона характеризовался более высоким эндогенным уровнем цитокининов. Вопрос о том, каким образом фитогормоны контролируют процессы прорастания и роста мужского гаметофита, остается неясным. В следующем разделе будут представлены результаты, полученные при изучении эффектов экзогенных фитогормонов на внутриклеточный рН (рНс) прорастающего in vitro мужского гаметофита петунии. Результаты, полученные в ходе изучения молекулярных механизмов восприятия и проведения сигналов в системе пыльца-пестик демонстрируют важную роль транспорта основных физиологически важных ионов через плазмалемму клеток пыльцевого зерна в регуляции прорастания мужского гаметофита (Feijo et al., 1995; Holdaway-Clarke & Hepler, 2003). Кроме того, они дают основание полагать, что механизмы трансдукции сигналов в такой системе могут базироваться на транзиторных сдвигах тех или иных параметров ионного гомеостаза клеток пыльцевого зерна, таких как, например, их цитозольный рНс.
