Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Про-/антиоксидантный метаболизм растений (обзор литературы) 10
1.1. Активные формы кислорода: образование и функции 10
1.2. Антиоксидантная система растений: низкомолекулярные и ферментные антиоксиданты 21
1.3. Влияние экологических факторов на функционирование антиоксидантной системы 31
Глава 2. Объекты и методы исследования 45
2.1. Характеристика объектов исследования 45
2.2. Условия проведения экспериментов 46
2.3. Характеристика почвенно-климатических и погодных условий в районах проведения исследований с дикорастущими растениями Plantago media и Hylotelephium triphyllum 49
2.4. Методы исследования 54
Глава 3. Результаты исследования 60
3.1. Функционирование антиоксидантной системы в листьях светового и теневого фенотипа Plantago media 60
3.1.1. Микроклиматические условия произрастания растений Plantago media на Южном Тимане 60
3.1.2. Влияние условий местообитания на интенсивность перекисного окисления липидов и образование активных форм кислорода в листьях Plantago media 62
3.1.3. Активность супероксиддисмутазы, гваяколовой пероксидазы и каталазы в листьях светового и теневого фенотипов Plantago media 66
3.1.4. Микроклиматические условия произрастания растений Plantago media на пойменном лугу в нижнем течении р. Вымь 72
3.1.5. Характеристика про-/антиоксидантной системы листьев растений Plantago media, произрастающих на пойменном лугу 74
3.1.6. Активность аскорбат-глутатионового цикла в листьях растений Plantago media, обитающих на пойменном лугу 82
3.1.7. Показатели про-/антиоксидантного статуса различных тканей листа растений Plantago media 87
3.1.8. Влияние УФ-радиации на активность антиоксидантных ферментов в листьях световых и теневых растений Plantago media 89
3.2. Функционирование про-/антиоксидантной системы листьев факультативного САМ растения Hylotelephium triphyllum в природных условиях 90
3.2.1. Условия произрастания растений Hylotelephium triphyllum 91
3.2.2. Уровень липопероксидации, содержание пероксида водорода и активность супероксиддисмутазы в листьях Hylotelephium triphyllum 93
3.3. Антиоксидантная защита клеток листа в процессе зеленения (на примере первого листа проростков Triticum aestivum) 97
3.3.1. Динамика содержания активных форм кислорода и накопление продуктов перекисного окисления липидов 98
3.3.2. Активность ключевых ферментов антиоксидантной системы 99
3.3.3. Динамика активности аскорбат-глутатионового цикла 101
Глава 4. Про-/антиоксидантный метаболизм и функционирование антиоксидантной системы при адаптации растений к условиям обитания и зеленении (обсуждение результатов) 105
4.1. Особенности функционирования про-/антиоксидантной системы дикорастущих растений в природных условиях 105
4.2. Динамика изменения активности ключевых компонентов антиоксидантной системы в процессе деэтиоляции проростков 121
Заключение 126
Выводы 128
Список литературы 130
- Активные формы кислорода: образование и функции
- Характеристика почвенно-климатических и погодных условий в районах проведения исследований с дикорастущими растениями Plantago media и Hylotelephium triphyllum
- Активность аскорбат-глутатионового цикла в листьях растений Plantago media, обитающих на пойменном лугу
- Динамика изменения активности ключевых компонентов антиоксидантной системы в процессе деэтиоляции проростков
Активные формы кислорода: образование и функции
Два фундаментальных процесса – фотосинтез и дыхание, обеспечивают клетки живых организмов энергией. При этом оба связаны с окислительно-восстановительными превращениями молекулярного кислорода (О2). В процессе фотосинтеза растения окисляют воду с образованием О2. Затем кислород используется живыми организмами в процессе дыхания. Участие кислорода как сильного окислителя в метаболизме возможно благодаря тому, что в своем основном состоянии он абсолютно безвреден, поскольку имеет одинаковое квантовое число спинов. Следовательно О2 не может прямо участвовать в реакциях с органическими молекулами (Halliwell, 2006). Однако кислород является источником потенциально опасных активных форм кислорода (Apel, Hirt, 2004).
Термин активные формы кислорода обозначает совокупность коротко живущих и относительно реакционноспособных форм кислорода, возникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений (Sharma et al., 2012). Среди них выделяют производные кислорода радикальной природы – супероксидный анион-радикал (О2-), гидропероксил радикал (НО2), гидроксил радикал (HО), а также производные нерадикальной природы – пероксид водорода (Н2О2) и синглетный кислород (1О2). Все они представляют собой продукты неполного восстановления О2 до воды одним, двумя, или тремя электронами (рис. 1). Изучению образования и метаболизма АФК посвящено множество экспериментальных и обзорных работ (Foyer et al., 1994; Mittler, 2002, 2017; Apel, Hirt, 2004; Asada, 2006; Креславский и др., 2007, 2012; Kreslavski et al., 2012; Иванов и др., 2013; Lukatkin et al., 2014; Noctor et al., 2015; Pospisil, 2016; Foyer, 2018; Mhamdi, Breusegem, 2018; Jank et al., 2019 и др.).
Активация кислорода может происходить по двум разным механизмам. Первый механизм связан с поглощением достаточной энергии, чтобы обратить спин, второй – со ступенчатым моновалентным восстановлением. В первом случае образуется синглетный кислород, во втором – супероксидный радикал и его производные (Noctor et al., 2015).
АФК постоянно образуются в клетках растений и животных. У растений АФК генерируются в результате неизбежной утечки электронов на молекулярный кислород в результате функционирования ЭТЦ хлоропластов, митохондрий и плазматической мембраны, или как побочный продукт различных метаболических путей, локализованных в разных клеточных компартментах (Mitller, 2002; Sharma et al., 2012; Jank et al., 2019).
В оптимальных условиях содержание активированного кислорода поддерживается на низком уровне благодаря функционированию антиоксидантной системы (Halliwell, 2006). В низких контролируемых количествах АФК служат сигнальными молекулами, которые участвуют в контроле процессов роста и развития растений, а также стимулируют ответные реакции на стрессовые воздействия (Mittler, 2017; Mhamdi, Breusegem, 2018). Однако в неблагоприятных, стрессовых для организма условиях, пул АФК быстро увеличивается и развивается окислительный стресс. Взаимодействия АФК с биомолекулами приводит к их повреждению и гибели клетки (Mller et al., 2007; Sharma et al., 2012; Noctor et al., 2015).
Синглетный кислород. Синглетный кислород (1O2, Singlet Oxygen s) представляет собой электронно-возбужденное состояние молекулярного кислорода. В растениях 1O2 вырабатывается в основном хлорофиллом (Хл) и его тетрапиррольными метаболическими интермедиатами в присутствии света (Apel, Hirt, 2004; Pospisil, 2016). Синглетный кислород является мощным окислителем, быстро реагирующим с макромолекулами в непосредственной близости от места его образования, что приводит к окислению, часто называемому «повреждением». Оценка времени жизни 1O2 в клетке составляет от 0.2 до 3.9 мкс (Иванов и др., 2013). Радиус распространения варьирует от 30 нм до 190 нм (Skovsen et al., 2005). На основе данных, полученных на клетках микроводоросли Chlamydomonas reindhardtii, предположили, что молекулы 1О2 могут выходить в цитозоль и достигать ядра (Krieger-Liszkay, 2005).
Нейтрализация 1О2 осуществляется двумя механизмами. Первый и основной механизм – физическое тушение. В качестве нейтрализующего агента выступают липофильные вещества – каротиноиды, токоферолы (Sharma et al., 2012). Из каротиноидов, встречающихся в растительных клетках, -каротин является функционально наиболее важным (Gruszeski et al., 2014). Второй механизм – химическое тушение. Его вклад от общей элиминации 1О2 в клетке составляет 1-2%. В этой реакции участвуют гидрофильные вещества, например, аскорбат, глутатион (Krieger-Liszkay, Trebst, 2006).
Супероксидный анион-радикал. Супероксидный анион-радикал (О2 , Superoxide anion radical) - продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. ФСI обычно рассматривают как главного участника редукции О2 (Рис. 2). В работе Redmer и Ollinger (1980) было показано, что в клетках мутантов зеленой водоросли Scenedesmus, полностью лишенных ФСI, при действии света образование О2 практически отсутствовало. Благодаря низким величинам окислительно-восстановительного потенциала (ниже -160 В) восстанавливать кислород до О2 способны все переносчики фотосинтетической ЭТЦ, расположенные в акцепторной части ФСI. Образование О2 на уровне ФС получило название « реакция Меллера» (Asada, 2006).
Продукция О2- возможна также на уровне ФС, при этом донором электронов в ФСІІ рассматривают феофетин и хиноновые акцепторы – первичный и вторичный QА и QВ (рис. 2) (Pospisil, 2016). Стоит отметить, что О2- в ФС II in vivo не образуется на свету в заметных количествах. Однако при нарушении работы водоокисляющего комплекса скорость образования О2- существенно возрастает (Schmitt et al., 2014). Наблюдаемые изменения скорости восстановления кислорода до О2- в препаратах ФСII являются следствием нарушения целостности этих комплексов при выделении. Такие нарушения могут происходить и при стрессе (Иванов и др., 2013).
Супероксидный анион-радикал генерируется не только в тилакоидной мембране, но и в строме хлоропластов. Предполагается, что не связанный с мембраной ферредоксин играет основную роль в этом процессе. В работе Kozuleva и Ivanov (2010) было показано, что in vivo в хлоропластах в присутствии достаточного количества NADP+ генерация О2- в строме мала, 1-10% всего восстановленного кислорода. Однако при разных стрессах, которые приводят, например, к закрытию устьиц, наблюдается дефицит окисленного NADP+, что приводит к увеличению восстановления кислорода ферредоксином в строме.
Продукция О2- в митохондриях связана с функционированием электрон-транспортной цепи. Диапазон окислительно-восстановительных потенциалов переносчиков митохондриальной ЭТЦ составляет от -0.320 В до +0.390 В, а восстановительный потенциал конверсии О2/О2- равен -0.160 В, поэтому случайное взаимодействие данных переносчиков с О2 может привести к продукции О2- (Mller, 2001). Основными сайтами продукции О2- считаются комплексы І и ІІІ дыхательной цепи (Mller, 2001; Brand et al., 2004; Sharma et al., 2012) (Рис. 3).
Характеристика почвенно-климатических и погодных условий в районах проведения исследований с дикорастущими растениями Plantago media и Hylotelephium triphyllum
Полевые исследования проводили в период с 2012 по 2018 гг. в двух географически удаленных районах Республики Коми. Южный Тиман расположен в подзонах глеево-подзолистых и подзолистых почв бореального пояса, имеются многочисленные крутые скальные обнажения, огромные выходы известняков карбона и пермо-карбона (Атлас почв …, 2010). Район характеризуется умеренно-континентальным климатом с продолжительной зимой, коротким и умеренно теплым летом. Среднегодовая температура составляет -1.5 C, средняя температура самого теплого месяца – июля около +15 C. Сумма осадков за вегетационный период варьирует от 315 до 365 мм. Продолжительность безморозного периода составляет 76 дней (Леса Республики Коми, 1992). По геоботаническому районированию территория относится к подзоне средней тайги.
Сведения об условиях вегетации в годы проведения исследований (2012 – 2014 гг.) на Ю.Тимане представлены в таблице 2. Вегетация растений начиналась в середине мая. Основная часть исследований была проведена в первой декаде июля, когда растения P. media находились в фазе цветения. Май 2012 г., особенно вторая его половина, выдался довольно теплым. Максимальная температура воздуха достигала +26 C, минимальная составляла -2 C. Число часов солнечного сияния за месяц составило 96 при норме 68-94 ч. Количество осадков в среднем было чуть ниже нормы. В июне преобладала теплая, с осадками погода, на фоне которой наблюдались короткие, незначительные похолодания. Среднемесячная температура воздуха составила +16 C, что на 3 C выше нормы. Максимальная температура повышалась до +29 C, минимальная опускалась до +4 C. Осадки выпадали ливневого характера, за первую декаду сумма осадков существенно превысила норму, во вторую была в пределах обычных значений, а в третью декаду осадки отсутствовали. В июле преобладала теплая, временами дождливая погода. Среднемесячная температура воздуха составила +17.4 C, что на 1-2 C выше нормы. Наиболее теплой была вторая декада июля, когда максимальная температура воздуха повышалась до +31 C. Первая декада июля была преимущественно без осадков, во вторую – осадков было выше нормы. В мае 2013 г. преобладала неустойчивая погода с недобором осадков. Среднемесячная температура воздуха составила +6 C, что близко к среднемноголетним значениям. Особенно тепло было в конце месяца, когда максимальная температура воздуха повышалась до +24 C. В июне преобладала теплая с недобором осадков погода. Среднемесячная температура воздуха составила +15.4 C что на 2.4 C выше нормы. Наиболее жаркий период наблюдался в третьей декаде июня, когда температура воздуха в отдельные дни поднималась до +34 C. Осадки распределялись неравномерно, их основное количество пришлось на вторую декаду июня. Июль характеризовался жаркой, с недобором осадков погодой.
Погода в мае 2014 г. была типичной для региона, среднемесячная температура воздуха составила +8 C, что близко к норме. Во второй половине месяца максимальная температура воздуха повышалась до +30 C. На фоне теплой погоды наблюдались кратковременные похолодания до -3 С в ночные часы. Среднемесячная температура воздуха в июне составила +13.1 C, что в пределах нормы. Максимальная температура повышалась до +27 C. Во второй половине месяца преобладала холодная, дождливая погода, сумма осадков за месяц превысила норму. Июль выдался холодным, с недобором осадков. Среднемесячная температура воздуха составила +12.8 C, что на 3 C ниже среднемноголетних значений. На фоне холодной погоды наблюдались отдельные теплые дни, когда температура воздуха повышалась до +23-27 C.
Таким образом, погодные условия в районе исследований на Южном Тимане в целом соответствовали климату, и судя по отклонениям от среднемноголетних значений температуры воздуха, в отдельные периоды были даже выше среднемноголетних величин.
Район нижнего течения р. Вымь относится к атлантико-континентальной климатической области (Алисов, 1969). Климат умеренно-континентальный, с продолжительной достаточно суровой зимой и коротким умеренно теплым летом. Среднегодовая температура +0.3 C, средняя температура января -15 C, температура июля +16-17 C. Период с температурами больше +5 C длится 150 дней. Сумма осадков за вегетационный сезон составляет порядка 340 мм (Агроклиматические …, 1973). По почвенно-географическому районированию район расположен в подзоне подзолистых, болотно-подзолистых и торфяно-подзолистых почв. По геоботаническому районированию относится к подзоне средней тайги.
Характеристика погодных условий вегетационных сезонов 2017 и 2018 гг. представлена в таблице 3. Вегетационный период 2017 г. был довольно прохладным. В мае преобладала холодная погода, эффективное тепло накапливалось медленно и было ниже нормы. Сумма осадков за месяц в пределах нормы. В июне среднемесячная температура воздуха составила +12 С, что ниже нормы. На фоне прохладной погоды были теплые дни, когда максимальная температура воздуха повышалась до +27 C. Сумма осадков за месяц существенно превысила норму. В июле преобладала теплая с недобором осадков погода. Среднемесячная температура июля составила +18.2 C, что на 2 C выше среднемноголетних значений. Максимальная температура воздуха повышалась до +30 C. В первой половине августа преобладала теплая погода. Среднемесячная температура была на 1 C выше нормы.
В мае 2018 г. преобладала теплая погода. Среднемесячная температура воздуха составила +8.5 C, что почти на 2 C выше среднемноголетних значений. Максимальная температура воздуха повышалась до +26 C. Теплая погода способствовала интенсивному накоплению эффективного тепла. Осадки распределялись неравномерно, но в целом за месяц их выпало больше нормы. В июне преобладала холодная погода, лишь к концу месяца установилась сравнительно теплая и сухая погода. В отдельные дни температура воздуха достигала +26 С. Количество выпавших за месяц осадков было близко к среднемноголетнему. В июле преобладала жаркая, с неравномерным распределением осадков погода, на фоне которой наблюдались кратковременные похолодания. Среднемесячная температура воздуха составила +19 C, что на 2.7 C выше нормы. Максимальная температура воздуха достигала +30 С. На фоне в основном жаркой погоды июля, наблюдались и похолодания, когда минимальная температура воздуха понижалась до +7 C. Осадки в июле выпадали неравномерно, их основная часть пришлась на первую половину месяца. В первой декаде августа преобладала прохладная, с осадками погода. Среднемесячная температура воздуха составила +14.2 C, что в пределах среднемноголетних значений.
Таким образом, анализ показывает, что погодные условия в данном районе исследований в целом соответствовали среднемноголетним значениям климата, и отклонения показателей были малозначительны.
Активность аскорбат-глутатионового цикла в листьях растений Plantago media, обитающих на пойменном лугу
Аскорбат-глутатионовый цикл (АГЦ) – важный метаболический путь детоксикации пероксида водорода. Он функционирует в цитозоле, митохондриях, пластидах и пероксисомах. В цикле участвуют аскорбат (Asc), глутатион (GSH), NADPH и ферменты, связывающие эти метаболиты. Аскорбат и глутатион – мощные низкомолекулярные антиоксиданты, участники редокс-сигналинга и разных биосинтетических путей (Foyer, Noctor, 2011).
Аскорбатпероксидазная реакция является первым звеном АГЦ. Фермент катализирует реакцию нейтрализации H2O2 до Н2О, используя в качестве донора электронов восстановленный Asc. Нами установлено, что активность АPX в среднем была в 1.2 и 1.4 раза выше в листьях световых растений, чем теневых в фазу бутонизации и массового цветения соответственно (рис. 25, табл. 10). Суточная динамика данного показателя хорошо выражена в оба срока проведения исследования. Максимум активности АРХ отмечали в полуденное время.
Для функционирования АPX необходимо достаточное количество аскорбата. Независимо от фазы развития растений, световые листья содержали в 2 раза больше общего аскорбата, чем теневые (табл. 11). Основная доля аскорбата (70-90%) была представлена его восстановленной формой. Содержание окисленной формы аскорбата – дегидроаскорбата (DHA) в листьях световых растений в 1.5 раза выше, по сравнению с теневыми. При этом пул DHA увеличивался во второй половине дня в листьях световых растений, тогда как в листьях теневых растений содержание DHA сохранялось на постоянном уровне в течение дня.
Содержание общего аскорбата зависело от фазы развития растений. В фазу массового цветения концентрация общего аскорбата в листьях световых и теневых растений была соответственно на 40 и 26% больше, чем в фазу бутонизации. При этом пул DHA в листьях световых растений в фазу цветения достоверно увеличивался, тогда, как у теневых практически не изменялся.
Активность дегидроаскорбатредуктазы (DHAR), отвечающей за восстановление DHA, была выше в листьях световых растений (рис. 26, табл. 10), особенно в полуденные часы, что свидетельствует о необходимости поддержания высокого уровня функционально активной формы Asc в период максимальной освещенности. Стоит отметить, что активность фермента в конце июля, когда наблюдали максимальные значения восстановленного Asc, в среднем была на 25% выше в листьях световых и на 14% в листьях теневых растений.
Глутатион является донором электронов для функционирования DHAR. Кроме того, он выполняет и другие важные функции в клетках растений. Листья световых растений накапливали в 2 раза больше глутатиона по сравнению с теневыми (табл. 12). Общий пул глутатиона световых растений был представлен в основном восстановленной формой. Заметное количество окисленной формы глутатиона (GSSG) появлялось в листьях ближе к ночи. Причем накопление GSSG было сильнее выражено у теневых растений, что возможно связано со снижением активности глутатионредуктазы (GR) – фермента восстанавливающего GSSG (рис. 27). Как и в случае с аскорбатом, общее содержание глутатиона в фазу массового цветения было существенно больше, чем в фазу бутонизации, в листьях световых растений – в 5 раз, теневых – в 8 раз.
Таким образом, наши результаты показывают, что функционирование аскорбат – глутатионового цикла в листьях растений P. media зависело от внутренних и внешних факторов. На активность ферментов и содержание метаболитов АГЦ в листьях P. media влияние оказывала фаза развития растений и условия местообитания. Выявлено достоверное повышение активности ферментов АГЦ в полуденные часы, более выраженное у растений, обитающих на открытом, хорошо освещаемом участке.
Динамика изменения активности ключевых компонентов антиоксидантной системы в процессе деэтиоляции проростков
Деэтиоляция – светоиндуцируемый процесс перехода растения с роста в темноте к росту на свету, включающий целый комплекс анатомо-морфологических и физиолого-биохимических изменений. Стартовым механизмом структурно функциональных преобразований является рецепция света светозависимой протохлорфиллидокисредуктазой, катализирующей восстановление протохлорофиллида (Pchlide) до хлорофиллида (Chlide). Запускаемый светом процесс деэтиоляции заключается в трансформации этиопластов в хлоропласты и формировании функционально компетентных фотосинтетических комплексов, что, в конечном итоге, позволяет растению переключиться с гетеротрофного на автотрофный тип питания (Solymosi, Schoefs, 2010; Garmash et al., 2013; Кузнецов и др., 2020).
В гетеротрофных тканях и органах растений основным источником АФК являются митохондрии (Mller, 2001), а также апопластная система генерации свободных радикалов (Mhamdi, Van Breusegem, 2018). На начальных этапах зеленения образование АФК на свету может быть связано с формирующимся в этиохлоропластах фотосинтетическим аппаратом (Asada, 2006; Leonowicz et al., 2018).
Мы выявили закономерности изменения активности антиоксидантной системы 5–суточных этиолированных проростков пшеницы, которые экспонировали на непрерывном свету при интенсивности ФАР 190 мкмоль квантов/м2с. В этом возрасте этиолированные проростки имеют потенциально высокую способность к деэтиоляции и накоплению хлорофилла на свету (Kravtsov et al., 2011). С увеличением возраста наблюдается снижение транскрипции пластидных генов, влияющих на скорость накопления этиолированными проростками хлорофилла при переносе на свет.
Согласно нашим данным (табл. 17), этиолированные проростки пшеницы характеризовались высоким содержанием О2-, Н2О2 и ТБК-РП. Отмечали также превалирующее содержание DHA и относительно низкую активность антиоксидантных ферментов. Это свидетельствует о развитии окислительного стресса в условиях темноты. Наши результаты согласуются с имеющимися в литературе данными. Так, в работе Aleksandrushkina с соавт. (2004) сравнили 7–суточные проростки пшеницы, выращенные в оптимальных световых условиях и в условиях темноты. Этиолированные проростки содержали в 3 раза больше О2- и Н2О2, чем выращенные на свету. Добавление в питательную среду экзогенных фенольных соединений, значительно снижало накопление АФК у этиолированных проростков. Авторы пришли к выводу, что высокое содержание АФК является необходимым условием для активации процессов программированной клеточной гибели (ПГК) при отсутствии света. В работе Корсуковой с соавт. (2013) выявлено двукратное повышение АФК на шестые и восьмые сутки роста проростков озимой пшеницы в темноте, что сопровождалось гибелью клеток колеоптиля по типу ПГК. При этом отмечалось, что митохондрии являются важными участниками АФК–опосредованной ПГК. Программируемая гибель клеток – это активный, генетически контролируемый процесс, при котором клетки селективно удаляются высоко скоординированным, многоступенчатым способом с участием специфических протеаз и нуклеаз (Petrov et al., 2015). Потенциальным индуктором ПГК у растений в условиях отсутствия света может выступать Н2О2. В работе Замятиной с соавт. (2002) сообщалось, что экзогенная Н2О2 в концентрации 10 мМ активировала гибель клеток колеоптиля пшеницы уже на пятые сутки роста в темноте. Окислительный стресс, вызываемый обработкой Н2О2, служил причиной ПГК в культуре клеток сои (Amor et al., 2000), табака (Houot et al., 2001), арабидопсиса (Tiwari et al., 2002) и колеоптилей пшеницы (Корсукова и др., 2013).
При переносе 5-суточных этиолированных проростков пшеницы на свет мы отмечали некоторое снижение содержания АФК и ТБК-РП. Далее в процессе деэтиоляции динамика накопления О2- и Н2О2 менялась не столь значительно как ожидалось. Тем не менее, в период развития тилакоидной системы, наблюдали увеличение процессов ПОЛ (табл. 17). Вероятно, это связано с повышением образования 1О2. Известно, что при действии света промежуточные звенья биосинтеза хлорофилла, то есть Pchlide и Chlide являются мощными фотосенсибилизаторами и вырабатывают 1О2 в растениях, инициируя окислительные повреждения (Tripathy, Oelmller, 2012). Эффективным механизмом предотвращения избыточной генерации 1О2 в растениях служит нефотохимическое тушение (NPQ). Большой вклад в реализацию процессов NPQ вносит функционирование виолаксантинового цикла (Demmig-Adams, 1996; Latowski et al., 2014; Дымова, 2011). Согласно данным работы (Garmash et al., 2013), наиболее высокие скорости индукции и релаксации NPQ отмечали в период с 4 до 12 часов зеленения проростков. При этом конверсия пигментов ВКЦ была максимальной, что возможно привело к снижению процессов липопероксидации и внесло вклад в стабилизацию редокс-состояния клеток.
Относительно стабильному уровню О2- и Н2О2 способствовала также активация антиоксидантной системы. Нами установлено, что общая активность SOD повышалась в период с 2 до 12 ч зеленения (рис. 34), когда наблюдается активное формирование фотосинтетического аппарата (Garmash et al., 2017). Анализ белковых профилей выявил наличие одной изоформы Мn-SOD и двух Cu/Zn-SOD в этиолированных и зеленеющих проростках пшеницы (рис. 35). Это означает, что переход к зеленению не вызывает появления дополнительных форм SOD. Изоформы Fe-SOD не были идентифицированы. Это согласуется с данными других авторов (Leonowicz et al., 2018) и подтверждает вывод, что изоформы Fe-SOD находятся в функционально зрелых хлоропластах, но не в этиопластах и развивающихся хлоропластах (Garmash et al., 2017).
Согласно полученным нами данным, наиболее активной в течение всего эксперимента была Cu/Zn-SOD, которая как отмечалось ранее присутствует в разных клеточных компартментах. Увеличение активности митохондриальной Мn-SOD наблюдали в период с 4 до 12 ч освещения, когда дыхание проростков было максимальным. Полученные данные согласуются с динамикой экспрессии генов разных изоформ SOD в процессе деэтиоляции проростков пшеницы, описанной в работе (Garmash et al., 2017).
Растения содержат несколько типов ферментов, способных метаболизировать Н2О2, которые включают каталазы, пероксидазы, различные типы пероксиредоксинов (PRX) и глутатион-S-трансферазы (Sharma et al., 2012). В наших экспериментах общая активность аскорбатпероксидазы и гваяколпероксидазы увеличивалась сразу после экспозиции этиолированных проростков к свету, и значительно снижалась через 24 ч освещения (рис. 36 и 37). В то же время наблюдали снижение содержания H2O2 в экстрактах листьев. Вполне вероятно, что в этот период снижению накопления H2O2 способствовала достаточно высокая активность каталаз (рис. 36), хотя их сродство к H2O2 ниже, чем у пероксидаз (Anjum et al., 2016). О том, что CAT вносила свой вклад в нейтрализацию Н2О2, свидетельствует ее высокая активность после суток освещения и снижение пула Н2О2 в это же время на фоне низкой активности пероксидаз. Сходные результаты были ранее представлены в работе Mattagajasingh и Kar (1988). При деэтиоляции этиолированных проростков пшеницы авторы наблюдали увеличение активности АРХ и САТ.
Таким образом, изменения активности SOD, пероксидазы и каталазы в первом листе пшеницы в процессе деэтиоляции направлены на усиление защиты от избыточного накопления АФК и стабилизацию редокс–состояния фототрофных тканей в период важнейших событий, связанных с развитием фотосинтетического аппарата и переходом проростков на фототрофный тип питания. В целом, изменения активности антиоксидантных ферментов комплементарны динамике изменения содержания АФК и продуктов липопероксидации.
Как уже неоднократно отмечалось, аскорбат-глутатионовый цикл (АГЦ) является важным компонентом антиоксидантной системы, который осуществляет детоксикацию H2O2 в растениях. АГЦ работает в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах, цитозоле и апопласте (Foyer, Noctor, 2011). В наших экспериментах этиолированные проростки характеризовались наименьшим пулом восстановленного аскорбата и достаточно высоким содержанием его окисленной формы (табл. 18), что свидетельствует о высокой активности окислительных процессов в проростках в условиях темноты. В ходе зеленения пул общего и восстановленного Asc возрастал и увеличивался почти вдвое спустя сутки экспозиции проростков на свету. Высокий уровень Asc в зрелой фотосинтезирующей ткани согласуется с представлениями о роли этого метаболита в защите фотосинтетического аппарата от фотодеструкции (Foyer, Noctor, 2011). Кроме того синтез аскорбата связан со светозависимой индукцией экспрессии генов ферментов, участвующих в его синтезе.
Изменения пула и соотношения разных форм аскорбата зависели от активности ферментов АГЦ. Нами установлено, что активность аскорбатпероксидазы, монодегидроаскорбатредуктазы, дегидроаскорбатредуктазы и глутатионредуктазы была существенно выше в течение первых 24 ч после переноса на свет (рис. 37). Это свидетельствует об участии АГЦ в поддержании про-/антиоксидантного баланса клетки в процессе развития тилакоидной системы и ФСА в целом.
Активность APX увеличилась сразу после экспозиции этиолированных проростков к свету, указывая на светозависимую активацию фермента. Далее активность APX снизилась и оставалась стабильной. Пополнению пула восстановленного Asc в этот период, помимо синтеза de novo, по-видимому, способствовала активация дегидроаскорбатредуктазы. Активность DHAR увеличивалась к 6-часовому периоду зеленения после некоторого снижения в первые часы.