Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕКИСЛОТЫ 7
СЕМЕЙСТВА КАРБОАНГИДРA3 8
а-семейство карбоангидраз 9
/3-семейство карбоангидраз. 11
у-семейство карбоангидраз 13
5- и е- семейства карбоангидраз 14
2.3. ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМА КАТАЛИЗА ОБРАТИМОЙ
РЕАКЦИИ ГИДРАТАЦИИ С02 КАРБОАНГИДР АЗАМИ РАЗНЫХ
СЕМЕЙСТВ 15
Механизм действия а-КА 16
fi-KA. Предположительная модель катализа 18
у-карбоангидраза. Особенности каталитической реакции 19
МЕХАНИЗМ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ КАРБОАНГИДРАЗ 20
ЗАМЕЩЕНИЕ ЦИНКА НА ДРУГИЕ МЕТАЛЛЫ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ КАРБОАНГИДРАЗ 23
РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РОЛЬ КАРБОАНГИДРАЗ 25
Прокариоты 25
Эукариоты. Животные. 26
Водоросли 29
Высшие СЗрастения 32
С4растения 34
2.7. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ЭНЕРГИИ В ТИЛАКОИДНОЙ МЕМБРАНЕ 35
Организация фотосинтетического аппарата высших растений... 35
Роль протонов и неорганического углерода в регуляции энергопреобразования 37
2.8. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН 38
Тилакоидная карбоангидраза водорослей 38
Карбоангидраз} іая активность тилакоидов высших растений... Ad
3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
ВЫДЕЛЕНИЕ ТИЛАКОИДОВ 43
ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ТИЛАКОИДНЫХ МЕМБРАН, ОБОГАЩЕННЫХ ФОТОСИСТЕМОЙ 1 ИЛИ 2 (ФС1-МЕМБРАН И ФС2-МЕМБРАН) 44
ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТА РАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ ГОРОХА 49
ИЗМЕРЕНИЕ КА АКТИВНОСТИ 49
3.5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПРЕПАРАТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ
ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА 50
Условия проведения электрофореза 50
Определение КА активности в ПАЛГ. 51
Анализ гелей на присутствие белка 51
Подбор условий разрешения пигмент-белковых комплексов в ПААГ. 52
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХЛОРОФИЛЛА В ПИГМЕНТ-БЕЛКОВЫХ ПОЛОСАХ В ГЕЛЕ 57
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЗЕЛЁНЫХ ПОЛОС 57
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА 58
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ, ПЕРЕХОДЯЩИХ В РАСТВОР ПРИ ИНКУБАЦИИ ТИЛАКОИДОВ С ТРИТОНОМ ПРИ ОТНОШЕНИИ ТРИТОН/ХЛОРОФИЛЛ, РАВНОМ 1 58
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 63
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ КА АКТИВНОСТИ В ТИЛАКОИДАХ 63
ХАРАКТЕРИСТИКИ ФС1-МЕМБРАН И ФС2-МЕМБРАН 68
КА АКТИВНОСТЬ ФС1-МЕМБРАН 71
Характеристики КА активности ФС1-мембран 71
Карбоангидразная активность ФС1-мембран в ПААГ. 72
Влияние ингибиторов на КА активность ФС1-мембран 72
4.4. КАРБОАНГИДРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ФС2-МЕМБРАН 75
Характеристики карбоангидразной активности ФС2-мембран 75
Карбоангидразная активность ФС2-мембран в ПААГ. 76
Влияние ингибиторов на карбоангидразную активность ФС2-мембран 77
СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРИСУТСТВИЯ В ПРЕПАРАТАХ МЕМБРАН, ОБОГАЩЕННЫХ ФС1 И ОБОГАЩЕННЫХ ФС2, РАЗНЫХ НОСИТЕЛЕЙ КА АКТИВНОСТИ 80
СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРИСУТСТВИЯ В ТИЛАКОИДАХ РАСТВОРИМОГО НОСИТЕЛЯ КАРБОАНГИДРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ 82
Карбоангидразная активность тритоновых экстрактов тнлакоидов 82
Карбоангидразная активность белков супернатанта 12 90
ОБСУЖДЕНИЕ 92
ВЫВОДЫ 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
АА - ацетазоламид (5-ацетиламино-1,3,4-тиадиазол-2-сульфонамид)
АДФ - аденозиндифосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
ВОК - водоокисляющий комплекс
ДТТ - дитиотреитол (трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан)
ДМ - додецилмальтозид
КА - карбоангидраза
ОГ - октилглюкозид
тКА - карбоангидраза тилакоидов
НАДФ+ - окисленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат
НАДФН - восстановленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат
ПААГ - полиакриламидный гель
Рубиско - рибулозобисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа
Снеорг- - неорганический углерод
ССК - светособирающий комплекс
Тритон/хл - тритон/хлорофилл
ФС1 -фотосистема 1
ФС2 - фотосистема 2
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель
Хл - хлорофилл
ЭА - этоксизоламид (6-этокси-2-бензотиазолсульфонамид)
Р680 - первичный донор электронов РЦ ФС1
Р700 - первичный донор электронов РЦ ФС2
ДА - фотоиндуцированные изменения поглощения
Введение к работе
Карбоангидраза-фермент, присутствующий во всех живых организмах,
' осуществляет катализ реакции:
С02 + Н20 ** НСОз" + Н+.
Неорганический углерод (С„еорг.), субстрат этой реакции, вовлечён во многие биологические процессы: р-карбоксилирующий глюкогенез, образование мочевины и синтез жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот, регулирование рН и ионного обмена.
Ни один метаболический путь не происходит без участия ионов водорода, другого субстрата карбоангидразной реакции. В процессе фотосинтеза они освобождаются при окислении воды, участвуют в образовании трансмембранного протонного градиента. В контексте данной работы особенно важна роль реакции дегидратации бикарбоната в хлоропластах как путь образования СОг - субстрата ключевой реакции цикла Кальвина, карбоксилирования рибулозо-1,5-бисфосфата, основного процесса т.н. «темновой» стадии фотосинтеза, в которой происходит синтез углеводородов.
Фотосинтез, помимо темновой стадии, включает также "световую стадию", процесс
* поглощения и преобразования энергии света в тилакоидной мембране. Неорганический
углерод вовлечён не только в реакции "темпового метаболизма", но и взаимодействует с участниками "световой стадии", обусловливая, так называемый, "бикарбонатный эффект" -влияние НСОз" (или СОг) на перенос электронов как на донорной, так и на акцепторной сторонах Фотосистемы 2 (Allakhverdiev, 1997; Klimov & Baranov, 2001; van Rensen, 1988). По-видимому, бикарбонатный эффект может рассматриваться как механизм непосредственного взаимодействия двух стадий фотосинтеза, помимо их взаиморегуляции через энергетические и восстановительные эквиваленты, АТФ/АДФ и НАДФН/НАДФ+.
Биологические системы, требующие для метаболизма больших потоков неорганического углерода, обладают цитоплазматическими, митохондриальными, периплазматическими, хлоропластными карбоангидразами. Активность и количество карбоангидраз коррелируют со скоростью потока неорганического углерода (Smith R.G., 1988). Считается, что в строме хлоропласта реакция превращения бикарбоната в СОг осуществляется каталитически, при участии растворимой карбоангидразы, однако эта реакция может осуществляться при участии карбоангидраз ы, связанной с тилакоидной мембраной при условии, что активный центр этого фермента направлен в сторону стромы.
Данные о присутствии карбоангидразы в тилакоидах высших растений были получены ещё в 1982 г. (Vaklinova et al.), однако существование карбоангидразы в
>
тилакоидах высших растений долгое время не признавалось. С каждым годом открьюается всё большее количество карбоангидраз при анализе геномов различных организмов и всё больше накапливается свидетельств присутствия карбоангидраз в тилакоидах высших растений (Пронина с гр,, 2002; Lu & Stemler, 2002). Недавно были получены убедительные доказательства того, что Мп-стабилизирующий 33 кД белок ФС2 высших растений, ОЕСЗЗ, обладает карбоангидразной активностью (Lu et al,, 2005) и> вероятнее всего* это - не единственная карбоангидраза, присутствующая в тилакоидах.
Целью работы было изучение носителей КА активности тилакоидов высших растений: определение их количества, свойств, характера связи с тилакоидной мембраной и возможного расположения в тилакоидах.
2. Обзор литературы
Похожие диссертации на Гетерогенность карбоангидразной активности тилакоидов гороха
