Введение к работе
Актуальность. К наиболее широко распространенным в мире повреждающим факторам среды, приводящим к обезвоживанию, существенному торможению ростовых процессов растений и потере урожая, относятся засуха, гипотермия, засоление, а в связи с ростом техногенного загрязнения окружающей среды также воздействие избыточных концентраций солей тяжелых металлов (ТМ). Известно, что эти стрессы часто взаимосвязаны и индуцируют общие сигнальные пути регуляции клеточных ответов, направленных на адаптацию, и вызывают в растениях сходные морфологические, физиоло-биохимические, молекулярно-генетические изменения (DalCorso et al., 2008; Potters et al., 2009; Winfield et al., 2010; Shakirova et al., 2010; 2012).
К числу универсальных реакций растений в ответ на эти стрессовые воздействия, вызывающие обезвоживание, относится усиление биосинтеза АБК и её накопление (Rock et al., 2010). В основе реализации регуляторного действия АБК в формировании стресс-устойчивости растений лежит индукция экспрессии АБК-чувствительных генов. О ключевой роли АБК в регуляции защитных реакций к неблагоприятным факторам, приводящим к нарушению водного режима, свидетельствуют данные о том, что из почти двух тысяч индуцируемых засухой генов в Arabidopsis taliana около 1300 находятся под контролем АБК (Huang et al., 2008). К таковым, в частности, относятся гены белков дегидринов, присущих всем таксономическим группам царства растений (Close, 1997; Аллагулова и др., 2003; Kosov et al., 2010; Hanin et al., 2011). Массированная аккумуляция дегидринов наблюдается в зародышах семян в период их обезвоживания, однако резкое усиление экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов регистрируется в тканях вегетирующих растений, подвергнутых обезвоживанию, а среди индуцируемых в этих условиях стрессовых белков дегидрины наиболее многочисленны (Аллагулова и др., 2003; Hara, 2010; Hanin et al., 2011). Физико-химические свойства дегидринов, особенности строения, в том числе обязательное наличие 15-аминокислотного К-сегмента, способного к формированию вторичной амфифильной -спирали, свидетельствуют в пользу их участия в защите биополимеров от денатурации, в сохранении целостности клеточных структур и стабилизации мембран в условиях обезвоживания (Аллагулова и др., 2003; Kosov et al., 2010; Hara, 2010). Индукция экспрессии генов дегидринов и накопление их белковых продуктов происходит в растениях и в нормальных условиях при обработке АБК (Close, 1997; Шакирова и др., 2005; Аллагулова и др., 2007). Чувствительность генов дегидринов к АБК и стрессовым факторам определяется наличием в их промоторах различных взаимодействующих друг с другом комбинаций цис-регуляторных элементов, взаимодействующих с АБК-индуцируемыми транс-факторами (Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2007; Chung, Parish, 2008; Hanin et al., 2011). Вместе с тем, сведения об активации транскрипции TADHN гена дегидрина в проростках пшеницы в ответ на обработку 24-эпибрассинолидом (ЭБ) на фоне отсутствия изменений в концентрации АБК (Аллагулова и др., 2007) свидетельствуют о реализации независимых от эндогенной АБК путях гормональной регуляции уровня дегидринов в растениях. Эти данные дают основание предполагать участие и других фитогормонов, сочетающих в себе ярко выраженные свойства стимуляторов ростовых процессов и индукторов устойчивости к стрессовым факторам, вызывающим обезвоживание, в регуляции транскрипции генов и количественного уровня дегидринов и важном вкладе этих белков в реализацию их протекторного действия на растения.
Цель и задачи исследований. Цель работы заключалась в изучении механизмов гормональной регуляции уровня дегидринов в растениях пшеницы, подвергнутых воздействию стрессовых факторов, вызывающих дефицит влаги. Для решения цели были поставлены следующие задачи:
1) для оценки вовлечения дегидринов в реализацию предадаптирующего действия цитокинина 6-бензиламинопурина (БАП) и салициловой кислоты (СК) провести анализ влияния этих гормонов на активность транскрипции TADHN гена дегидрина пшеницы в проростках в присутствии или отсутствие ингибитора синтеза АБК флуридона;
2) исследовать динамику транскрипции гена TADHN дегидрина в растениях в ходе воздействия гипотермии и кадмиевого стресса и оценить вклад эндогенной АБК в регуляцию этого процесса;
3) с использованием антител, полученных к К-сегменту дегидринов, исследовать спектр иммунореактивных белков в корнях и побегах предобработанных и необработанных флуридоном проростков пшеницы в условиях низкотемпературного стресса;
4) с использованием вестерн-блот-анализа провести оценку количественного уровня дегидринов в предобработанных и необработанных флуридоном растениях, подвергнутых воздействию ацетата кадмия;
5) методом иммуноблоттинга провести анализ уровня дегидринов в предобработанных СК и ЭБ в присутствии или отсутствие флуридона проростках пшеницы в условиях кадмиевого стресса.
Научная новизна. С использованием ингибитора синтеза АБК флуридона получены приоритетные данные о реализации как зависимых, так и независимых от эндогенной АБК путей регуляции активации транскрипции TADHN гена дегидрина в растениях пшеницы, обработанных СК или БАП в разных концентрациях. Впервые на растениях пшеницы показано сочетание АБК- и холод-индуцируемых путей регуляции экспрессии гена TADHN дегидрина и накопления дегидриновых белков в растениях пшеницы при гипотермии. Выявлен важный вклад дегидринов в проявление протекторного эффекта СК и ЭБ на растения пшеницы в условиях кадмиевого стресса, при этом реализация их регуляторного действия на уровень дегидринов различается: ЭБ, в отличие от СК, проявляет независимую от эндогенной АБК способность к индукции накопления дегидринов.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных в работе исследований расширяют знания о молекулярных механизмах защиты пшеницы к гипотермии и кадмиевому стрессу и важной роли фитогормонов, сочетающих в себе свойства стимуляторов роста и индукторов устойчивости, таких как цитокинины, ЭБ и СК, в их регуляции. Вовлечение уникальной группы стрессовых белков дегидринов в спектр действия СК и ЭБ на проростки пшеницы в нормальных и стрессовых условиях может служить важным критерием развития под их влиянием предадаптирующего и протекторного эффектов на растения. Совокупность полученных данных раскрывает пути эффективного управления стресс-устойчивостью пшеницы с применением исследованных в работе фитогормонов, повышения урожая основной хлебной культуры России и улучшения его качества.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ–2010» (Москва, 2010), международных школах-конференциях молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2011) и «Биомика» (Уфа, 2011, 2012), XVII и XVIII конгрессах FESPB (Valencia, Spain, 2010, Freiburg, Germany, 2012), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), 38-м конгрессе FEBS (Санкт-Петербург, 2013), 25-м конгрессе SPPS (Helsingr, Denmark, 2013).
Конкурсная поддержка работы. Исследования поддержаны грантами РФФИ № 08-04-01563а, № 11-04-01642-а и РФФИ-Поволжье № 11-04-97051.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы изложения методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 134 страницах и иллюстрирована 22 рисунками и 1 таблицей. Список литературы включает 273 наименования.
