Введение к работе
Актуальность проблемы. Величина pH в цитозоле (рНс) является важным параметром клетки. Представления о детерминирующей роли рНс в разнообразных клеточных процессах и необходимости его строгого регулирования основаны на том, что малые отклонения в стационарном значении этого параметра могут приводить к специфическим изменениям в метаболизме и даже менять его направление [Busa.Nuccitelli, 1984]. Поддержание постоянства рН в цитозоле является важным условием сохранения в клетке координированной активности различных энэиматических систем и гомеостаза в целом. Для растений, не обладающих фактороста-том на органиэменном уровне, рассматривается существование двух основных способов рН-статирования: биохимической рН-регуляции и транспортных процессов, активно обменивающих протоны между цитозолем, средой и органеллами [Smith, Raven, 1979]. Поскольку изучение механизмов рН-статирования сопряжено с необходимостью кинетических измерений рН в цитозоле in vivo, а экспериментальные возможности для такой регистрации в растительной клетке появились в последнее время, проблема далека от разрешения.
Локализованные в мембранах ион-транспортные системы растений достаточно хорошо охарактеризованы in vitro, однако не всегда понятно их физиологическое значение и, в частности, в рН-стате. Особая роль, по-видимому, должна принадлежать плазмалемме, через которую растительная клетка взаимодействует со средой, регулируя потоки ионов и метаболитов, а также акцептируя внешние стимулы. Кратковременные и обратимые изменения рП в цитозоле, наблюдаемые в растительной клетке при воздействии гормонов и элиситоров, фотосинтезе, стрессе и других событиях, наиболее вероятно осуществляются через модуляцию активности участвующих в рН-стате ион-транспортных систем.
Перечисленные проблеиы определили актуальность исследования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось выяснение роли ион-транспортных систем плазмалеммы в процессах регулирования рНс. Были поставлены следующие задачи:
-
Адаптировать метод измерения внутриклеточного рН с помощью "захваченных" флуоресцентных рН-индикаторов для суспензии растительных протопластов
-
Показать, что растительные протопласты способны регулировать рН в цитозоле.
-
Выяснить конкретные ион-транспортные механизмы, участвующие в быстродействующем рН-стате растительных протопластов.
Научная новизна. Применение оптического метода измерения внутри-риклеточного рН с помощью "захваченных" флуоресцентных рН-зондов позволило кинетически регистрировать изменения этого параметра в суспензии протопластов,. изолированных из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы.
Показано, что растительные протопласты регулируют рН в цитозоле после искусственного импульсного ацидоза, что проявляется в быстром восстановлении этого параметра к исходному стационарному уровню. Это связано с существованием быстродействующего рН-стата, базирующегося на ион-транспортных процессах, основной чертой которого является -многокомпонентность. Это существенно для растительных клеток, функционирующих в,нестабильных условиях окружения, так как способствует их лабильности и устойчивости к стрессу.
Для изолированных протопластов из суспензионной культуры сахарной свеклы быстродействующий рН-стат исчерпывается участием трех систем, локализованных в плазмалемме: Н*-А7азь, пСй^~/'Сі~ и Jw'ii'*" обменов. Эти ион-транспортные механизмы, из которых два последних являются вторично-энергизованными, работают независимо и обеспечивают возможности быстрого регулирования рНс.
Теоретическая и практическая ценность. Разработанные методики введения флуоресцентных зондов в цитозоль растительных протопластов и создания условий кратковременного искусственного ацидоза могут быть рекомендованы для проведения исследований, связанных с определением кинетических изменений рН цитозоля и функционированием мембранных систем как рН-статирующих механизмов клетки.
Полученные данные подтверждают способность растительных клеток к регулированию рН в цитозоле. Результаты работы и использованные методические приемы могут быть полезны для исследования роли этого параметра в процессах, происходящих в растительной клетке при акцептировании внешних стимулов и стрессовых воздействиях.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на Сабининском семинаре "Ионный обмен и физиология корня" (Москва, 1988); на VI Конгрессе Европейской Федерации Обществ Физиологов растений (Сплит, 1988); на II съезде Всесоюзного Общества физиологов растений (Минск, 1990). В законченном виде работа доложена и обсуж-. дена на межлабораторном семинаре Института физиологии растений РАН имени К.А.Тимирязева (1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения получен-
