Введение к работе
Актуальность проблемы.
Процессы морфогенеза у растении, как правило, сопровождаются резкими и специфическими изменениями характера г еточ-ных делений. Подобные изменения были детально описаны при изучении соматического эмбриогенеза в культуре клеток моркови: на ранних этапах этого процесса деления в клеточном агрегате резко ускоряются на одном из полюсов зародыша, напоминая деления дробления у животного зародыша (Fujimura and Komaraine,1980). Вопрос о регуляции характера клеточных делений при морфогенеза до сих пор остается одним из наиболее неясних в биологии растительной клетки. Эта проблема приобретает особое значение при изучении морфогенеза у растительных клеток, культивируемых in vitro, так как многие неудачи при индукции этого процесса могут объясняться недостаточным знанием способов экспериментально воздействовать на способность клеток пенять скорость или направление делений (Бутенко, 1975) .
В качестве модельной системы для изучения морфогенеза у растений широко используются суспензионные культуры клеток моркови (Sung et al., 1984; Моисеева и др., 1987). В одной из работ, проведенной в лаборатории Р.Сайг в Калифорнийском У\..-верситете, были получены моноклональные антитела, реагирующие с антигеном, присутствующим в энбриогепной суспензии моркови (J.Smith et al., 1985) . По номеру гибридомы, продуцирующей эти мнЛТ, антиген был назван 21Д7. У моркови этот антиген имел молекулярный вес около 45 кДа, и паблюдался только в активно делящихся клетках, например, п меристемах корня и стебля, в растущей суспепзпоппой культуре, в незрелых зарг -,ышах. Непрямой метод иммунофлуоресцеиции показал, что 21Д7 антиген локализован в ядрах интерфазных клеток, наиболее часто он заметен в ядрышках (J.Smith et al., 1988). Р.Сайг и Да. Смит великодушно предоставили ионоклоналыще антитела 21Д7 нескольким лаг бораториям мира,
Чтобы попытаться выделить ген, кодирующий 21Д7 антиген, и выяснить возможную РС/іь 21Д7 антигена в процессе деления клеток, нами было предложено использовать более простую экспе-
рііментальную систему, в которой морфогенез не наблюдается, -неорганизованно растущие в суспензиоішой культуре клетки барвинка розового - Catharanthus roseus (1.) G.Don. В лаборатории профессора А. Комамине в университете Тохоку (г.Сендай, Япония) были разработаны иетоды синхронизации клеточиих делений в этой системе (Amino ot al.,1983; Kodaea et al., 1989);
Рель и задачи исследования' Цель» нашей работы явилрсь выделение последовательности кДНК, соответствующей 21Д7- антит-гену, и изучение ее экспрессии на уровне иРЛК в различных растительных системах. Ни назвали предполагаемый геи, кодирующий 21Д7 антиген, cpd 21D7 .(сокращенно от ?cell proliferation dependent" - "связанный с клеточный делением").
Были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Создать экспрессионнуг библиотеку кДНК моркови и выделить последовательность кДНК, при экспрессии которой в бактериальных клетках образуется полипептнд, способный реагировать с инАТ 21Д7 .
-
Доказать, что выделенная последовательность кДІІК кодирует в растительных клетках антиген 21Д7.
-
Изучить экспрессию выделенного гена на уровне ыРНК в различных тканях и клетках моркови, чтобы выявить ее специфический характер.
-
Исследовать связь мевду экспрессией гена и клеточный делением в неорганизованно растущих культурах С. roseus при синхронизации клеточного цикла разиымц способами.
Научная новизна и практическая ценность. Выделены кДІІК моркови и С.roseus, соответствующие ранее неизвестному гену, который кодирует 21Д7 антиген, связанный с делением клеток. Обнаружено сходство этого растительного гена с мутантним животным геном, кодирующий turn- трансплантационный опухолевый антиген Р91А, экспрессия которого в раковых клетках кыши приводит к потере ими способности образовывать опухоли In vivo і (Lirquin et al., 1989).
Использование фрагментов выделенной последовательности кДіїК в качестве зондов позволило изучить экспрессию гена на уровне мРНК в различных растительных системах. Показано резкое усиление экш/.ессни гена при активизации клеточного деления,
доказан фазоспецпфическпй характер экспрессии при прохождении клеточного Цикла, полученные данные свидетельствуют о регуляции активности дашюго гена па уровне транскрипции. Выделенный геи кодирует ядерный белок, поэтому дальнейшее исследование работы этого гена может помочь в изучении механизма регуляции клеточных делений при различных процессах в культурах клеток растений и животник, что практически важно для разработки эффективных клеточных технологий.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации били доложены на 5-й Межд. конгрессе "Биология клетки в культуро it биотехнология", Новосибирск, 2-6 августа 1988 г; 11-м Кежд. симпозиуме "Эмбриология п семенное размножение", Ленинг-. рад, 3-7 ноля 1990 г.; секции ВОФР "Биология культивируемых клеток к клеточная иикекерня", 16 мая 1991 г.; семинаре лаб. физиологии растений Университета Тохоку, Сендай, Япония; 1-м Всесопз. симпозиуме "ііоецє-методы биотехнологии растений", Пу-щішо, 22 поября 1991 г.
По результатам исследования бнло опубликовано 8 работ.
Структура диссертации.