Введение к работе
Актуальность проблемы. Своеобразие вторичного метаболизма растений семейства Аралиевых заключается в образовании значительных количеств тритерпеновых гликозидов различной структуры (Еляков, Оводов, 1972; Журавлев, Коляда, 1996). В настоящее время эти соединения обнаружены у представителей 24 родов Araliaceae (Гришковец, 2004), что составляет около трети от общего числа родов в семействе. В качестве агликонов гликозидов аралиевых выступают тритерпеноиды более десяти различных структурных типов (Vincken et al., 2007; Dinda et al., 2010), однако наибольший интерес представляют две основные группы соединений — производные пентациклического тритерпеноида /?-амирина и тетрациклинеского тритерпеноида П-даммарендиола. Важно, что гликозиды с агликонами этих типов неравномерно распределены среди растений семейства (Christensen, 2008): производные /?-амирина обнаружены у всех исследованных аралиевых, тогда как гликозиды с агликонами даммаранового ряда встречаются, за редкими исключениями, только в различных видах женьшеня (род PanaxL.).
Систематическое исследование химического состава представителей Araliaceae было начато более полувека назад. За прошедшее время показано, что в каждом изученном объекте тритерпеновые гликозиды представлены в виде сложных смесей, структурное многообразие компонентов которых поражает воображение исследователей. Ярким примером этого являются результаты изучения рода Panax spp., из различных видов которого в настоящее время выделено более 300 индивидуальных гликозидов (Qi et al., 2011).
Работы по получению и исследованию культур клеток растений Araliaceae
стартовали одновременно с первыми успехами выяснения полной структуры
тритерпеновых гликозидов аралиевых. Первые каллусные и суспензионные культуры
клеток ряда видов Panax spp. и Polyscias spp. были получены в середине прошлого
столетия (Бутенко, 1964; Слепян и др., 1975). К настоящему времени получены
десятки культур клеток видов семейства. В то же время, исследования тритерпеновых
гликозидов в полученных культурах, как правило, носят схематичный характер и
сводятся к качественному и количественному анализу только тех компонентов, для
которых доступны коммерческие стандартные образцы. Например, для культур клеток
и тканей различных видов женьшеня обычно определяют содержание семи
нейтральных гинзенозидов (Rgi, Re, Rf, Rbb Re, Rb2, Rd) — основных тритерпеновых гликозидов корня настоящего женьшеня (Wu, Zhong, 1999). Очевидно, что результаты подобных исследований не дают представления о возможности образования в клетках in vitro сложного паттерна тритерпеновых гликозидов, характерного для растений семейства Araliaceae in vivo. Таким образом, можно заключить, что детальное изучение путей формирования и особенностей многообразия тритерпеновых гликозидов в культурах клеток и тканей аралиевых является весьма актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы: изучить особенности качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в культурах клеток представителей семейства Araliaceae (на примере Panax spp. и Polyscias spp.) и выяснить закономерности его изменения в процессе роста клеток in vitro.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Провести фитохимический анализ культур клеток двух видов полисциаса (Polyscias filicifolia, P. fruticosa) и двух видов женьшеня (Panax japonicus var. repens и P. ginseng);
Провести препаративное выделение и структурную идентификацию основных тритерпеновых гликозидов культур клеток Polyscias spp. и Panax japonicus var. repens;
Изучить изменение качественного и количественного состава тритерпеновых гликозидов в процессе выращивания исследуемых культур клеток.
Научная новизна работы. Впервые дана комплексная характеристика состава тритерпеновых гликозидов культур клеток двух видов полисциаса. Впервые доказано образование в культуре клеток in vitro женьшеня японского (Panax japonicus var. repens) неполярных минорных гинзенозидов (гипенозид XVII) и малонильных производных гинзенозидов. Выдвинуто предположение о механизмах формирования и поддержания многообразия гинзенозидов в культуре клеток Panax japonicus var. repens. Полученные результаты расширяют сложившиеся представления о биосинтетическом потенциале клеток представителей семейства Araliaceae, культивируемых in vitro.
Практическая значимость работы. Полученные в работе результаты вносят вклад в понимание процессов образования тритерпеновых гликозидов в культурах клеток ценных лекарственных растений семейства Araliaceae: Polyscias filicifolia, P.
fruticosa, Panax japonicus var. repens. Результаты исследования позволяют сформулировать четкие критерии оптимизации условий выращивания данных культур клеток и могут быть основой для создания «умных биотехнологий», направленных на получение растительного сырья, близкого к природному по своим терапевтическим свойствам.
Экспериментальные результаты и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учебном процессе при чтении в ВУЗах курсов лекций по биохимии и физиологии вторичного метаболизма растений.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на Международной конференции «Перспективы фитобиотехнологии для улучшения качества жизни на Севере» (Якутск, 2010); на XVIII Международной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011); на 5-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование» (Владивосток, 2011); на XV Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология-наука XXI века" (Пушино, 2011); на 4-м Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-Россия" (Воронеж, 2011); а также на заседаниях кафедры физиологии растений Биологического факультета МГУ и Отдела биологии клетки и биотехнологии ПФР РАН. Оформлена заявка на патент РФ (№ 2011134609).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи в рецензируемых изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста. Содержит 6 таблиц и 38 рисунков. Список цитируемой литературы включает 275 наименований, в том числе 202 на иностранном языке.
