Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава I. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:
Вакуолярная и перибактероидная мембраны ограничивают в растительных клетках компартменты, которые сходны друг с другом по некоторым характеристикам биогенеза и функциональной активности, что, возможно, отражается и в ион-транспортирующих свойствах этих мембран
1. Функции вакуоли, транспорт ионов через тонопласт и его регуляция в клет
ках высших растений 9
Транспорт К+ и Са2+ через тонопласт 10
Регуляторные аспекты транспорта ионов через тонопласт 16
1.2.1 Участие кальмодулина в регуляции транспорта ионов через мембраны
растительных клеток 17
Потенциальная роль адениновых нуклеотидов в регуляции транспорта ионов через тонопласт 22
Модуляция транспорта ионов через тонопласт при осморегуляции растительных клеток 24
Транспорт ионов через ПБМ симбиосом корневых клубеньков бобовых... 25
Общие характеристики становления эндосимбиоза, связанного с формирова-
нием в эукариотических клетках-хозяина вакуолеподобного компартмента
при инфицировании их микроорганизмами 27
4. Общие характеристики биогенеза вакуолярной и симбиосомальной мемб
ран 33
5. Роль Са2т в процессах бобово-ризобиального эндосимбиоза, связанных с
инфицированием клеток корневых волосков ризобиями, формированием,
созреванием и функционированием симбиосом 35
з
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 41
Глава П.
ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение вакуолей и получение из них везикул тонопласта 47
Выделение симбиосом и получение из них везикул ПБМ 48
Определение АТФ-гидролазной активности препаратов вакуолярных и симби-
осомальных мембран 49
Регистрация мембранного потенциала на мембране выделенных вакуолей, си
мбиосом и полученных из них везикул тонопласта и ПБМ 50
Регистрация трансмембранного градиента рН на мембране выделенных орга-
нелл и полученных из них везикулярных мембранах (тонопласте и ПБМ) 51
Цитохимическая визуализация кальция в симбиосомах in vivo и in vitro и выя
вление в них Са-депо 51
Регистрация поглощения кальция симбиосомами и везикулами ПБМ, изолиро
ванными из корневых клубеньков бобовых 52
Регистрация осмотически-индуцированных изменений объема симбиосом....53
Глава III.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Функциональная идентификация, характеристика и некоторые факторы контроля активности ион-транспортирующих систем в вакуоляр-ной мембране растений.
Барьерные свойства тонопласта выделенных вакуолей для ряда основных физиологически важных ионов и функциональная идентификация в этой мембране АТФ- и пирофосфат-зависимого протонных насосов 54
Са"7п1-Г-антипортер на тонопласте и его регуляция кальмодулином 67
Функциональная идентификация в тонопласте анион-транспортирующей системы как сенсора, определяющего чувствительность МАТФ-зависи-мой генерации трансмембранного градиента рН к осмотическому сжатию вакуолярной мембраны 74
Выявление в тонопласте анион-транспортирующей системы, аллостериче-ски активируемой адениновыми нуклеотидами 81
2. Идентификация и характеристика ион-транспортирующих систем в пе-рибактероидной мембране симбиосом - азотфиксирующих компарт-ментов в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых
Функциональная идентификация электрогенной Н+-АТФазы Р-типа в пери-бактероидной мембране симбиосом и ингибирование ее активности ионами Са"+ 91
Поведение симбиосом как Са-запасающих компартментов в инфицированных клетках корневых клубеньков бобовых 99
Механизмы транспорта Са2+ через ПБМ 105
2.4 Пассивный транспорт К+ через ПБМ 118
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 127
ВЫВОДЫ 139
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 142
БЛАГОДАРНОСТИ 171
Введение к работе
Одна из фундаментальных проблем современной биологии состоит в выяснении механизмов, ответственных за поддержание ионного гомеостаза животных и растительных клеток. Действие этих механизмов во многом определяется активностью ион-транслоцирующих систем, локализованных в клеточных мембранах, в том числе в эндомембранах, ограничивающих определенные внутриклеточные органеллы.
В растительных клетках в гомеостатической регуляции ионного состава их цитозоля очень важную роль играет вакуоль - уникальная мультифунк-циональная органелла, активность которой тесно интегрирована с активностями остальной части клетки. К настоящему времени установлено, что ва-куолеподобный компартмент часто образуется и в ходе взаимодействия микроорганизмов с эукариотами, в частности, при заражении ряда животных клеток патогенами, что приводит к установлению симбиотических взаимоотношений между ними. Этот внутриклеточный компартмент является для микросимбионта местом его обитания, роста и размножения. Согласно данным, имеющимся в настоящее время в литературе, в растениях примером вакуоле-подобного компартмента рассматриваемого типа могут быть присутствующие в клетках корневых клубеньков бобовых симбиосомы, которые содержат бактероиды и ответственны за симбиотическую фиксацию атмосферного азота. Вместе с тем роль симбиосом в клетках, инфицированных почвенными бактериями - ризобиями, вероятно не ограничивается только этой функцией
и скорее всего включает в себя и другие, свойственные вакуолям обычных растительных клеток. До недавнего времени данные в пользу этой гипотезы были представлены лишь сообщениями о литическом характере перибактеро-идного пространства (ПБП) симбиосом, и она не имела каких-либо убедительных экспериментальных подтверждений, в том числе основанных на характеристиках обмена ионами между макро- и микросимбионтом.
В этой связи в настоящей работе проведена проверка справедливости рассматриваемой гипотезы на основе исследований механизмов транспорта основных физиологически важных ионов (Н+, К+, Са2+) через вакуолярную и симбиосомальную (перибактероидную (ПБМ)) мембраны. Был проведен сравнительный анализ барьерных свойств исследуемых мембран по отношению к указанным ионам, а также изучены характер, транспортные активности и способы регуляции первично- и вторично-энергизованных ион-транслоциру-ющих систем, локализованных в этих мембранах. Необходимость выполнения настоящей работы определялась и ограниченностью информации, особенно в самом начале наших исследований, о механизмах и способах регуляции транспорта ионов через вакуолярную мембрану растительных клеток.
Полученные в работе результаты вносят заметный вклад в понимание механизмов действия, а также особенностей функционирования и способов регуляции активности ионных транспортеров, идентифицированных в мембране органелл того или иного типа. Выявленные характеристики ионного обмена через ПБМ симбиосом во многом указывают на поведение их как функционального аналога вакуолей. В свою очередь это может свидетельствовать
7 о мультифункциональности симбиосом и их потенциальной роли в регуляции
ионного состава цитозоля и осморегуляции инфицированных клеток корневых клубеньков бобовых. Иначе говоря, подобно вакуолям симбиосомы вероятно активно включаются в регуляцию метаболизма инфицированных клеток клубенька и их активности тесно интегрированы с активностями остальной части таких клеток. Очевидно, что наиболее активное метаболическое взаимодействие между симбиотическими партнерами реализуется в случае эффективного симбиоза. На основании результатов, полученных в настоящей работе, предполагается, что эффективность такого взаимодействия существенным образом зависит от функционирования ион-транслоцирующих систем, локализованных в ПБМ симбиосом.
