Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Павленчева Наталия Владимировна

Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна
<
Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Павленчева Наталия Владимировна. Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.12 : Казань, 2004 104 c. РГБ ОД, 61:04-3/699

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Обзор литературы 8

1.1. Растительные волокна 8

1.2. Льняное лубяное волокно 19

1.3. Тканеспецифичный галактан лубяных волокон льна 24

1.4. Клеточная стенка растений и проблемы в ее изучении 29

Глава 2. Материалы и методы исследований 42

2.1. Объект исследования 42

2.2. Выделение клеточной стенки и буферрастворимых полимеров 43

2.3. Гель - хроматография буферрастворимых полимеров 43

2.4. Эксперименты по изучению метаболизма галактана с 14С02 44

2.5. Приготовление гистологических срезов 45

Глава 3. Результаты исследований 46

3.1. Положение точки слома на стебле льна в онтогенезе 46

3.2. Гель-проникающая хроматография буферрастворимых полимеров участков стебля льна, зафиксированных на различных стадиях развития растения 47

3.3. Характеристика тканеспецифичного галактана в различных сортах льна

3.4. Оценка содержания галактана 55

3.5. Анализ буферрастворимых полимеров на участках стебля, находящихся вблизи точки слома

3.6. Анализ метаболизма высокомолекулярного галактана в экспериментах по перераспределению метки из 4СОг

3.7. Анализ количества волокон на поперечных срезах стебля льна-долгунца

3.8. Влияние почвенной засухи на удлинение волокон и содержание галактана

Глава 4. Обсуждение результатов 78

4.1. Представления о характере формирования флоэмных волокон стебля льна

4.2. Возможные функции тканеспецифичного галактана флоэмных волокон стебля льна

Заключение 86

Выводы 87

Список литературы 89

Введение к работе

Постановка проблемы и ее актуальность. Дифференциация клетки и формирование специализированных тканей — основополагающий процесс индивидуаль-ного развития организма. В высших растениях к числу высокоспециализированных клеток принадлежат склеренхимные волокна, которые присутствуют в различных органах растения и, в частности, обеспечивают прочность стебля. К ним относятся флоэмные волокна, которые составляют основу урожая технических волокнистых культур, таких как лен и конопля. Отличительной особенностью склеренхимных волокон являются толстые клеточные стенки и необычная длина индивидуальных клеток, достигающая нескольких сантиметров. Развитие этих уникальных клеток - интригующий процесс, важнейшим этапом в характеристике которого является выявление отдельных стадий, их временная и пространственная локализация. Без них невозможны ни" понимание хода морфогенеза, ни изучение биохимических процессов, с помощью которых он реализуется. С другой стороны, особый интерес представляет выявление и изучение тканеспецифичных процессов.

В стебле льна существует так называемая точка слома (Gorshkova et al., 1996; Salnikov et al., 1998), где волокнистая часть стебля резко меняет свои механические свойства, становясь более прочной. Считается, что склеренхимные волокна формируются путем длительного апикального роста, совмещенного с отложением вторичной клеточной стенки в срединной части клетки (Эзау, 1980; Fahn, 1990), что не объясняет скачкообразного изменения механических свойств. Отмеченное противоречие побудило нас пересмотреть представления о характере формирования волокон склеренхимы.

Растения льна содержат достаточно редкий полисахарид клеточной стенки, который является тканеспецифичным полимером и присутствует только в клетках флоэмных волокон (Gorshkova et al., 1996; Gorshkova et al.,

2003). Этот полимер - р-(1-»4)-галактан, который является высокомолекулярным соединением (степень полимеризации сравнима с таковой у целлюлозы), но растворяется в воде и достаточно легко выделяется с помощью гель-фильтрации. Это отличает его от большинства других полисахаридов матрикса клеточной стенки, которые обычно находятся в сложном взаимодействии друг с другом и с целлюлозными микрофибриллами, так что полностью извлечь какой-то один из них, не нарушая его структуры, крайне сложно. Тканеспецифичность и доступность для выделения |3-(1-»4)-галактана стебля льна предоставляет редкую возможность исследования на интактных растениях метаболизма индивидуального полимера клеточной стенки и его сопряженности со стадиями формирования клетки.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы являлась характеристика метаболизма тканеспецифичного галактана и его связи с развитием флоэмных волокон льна. Были поставлены следующие задачи:

Оценить содержание галактана в различных участках стебля и на различных стадиях развития растений льна.

Изучить метаболизм тканеспецифичного галактана в экспериментах с экзогенным меченым субстратом — ССЬ.

Охарактеризовать локализацию в стебле и продолжительность отдельных стадий развития льняного волокна.

Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что интрузивный рост флоэмных волокон льна ограничен во времени до 3-5 дней (скорость удлинения клетки составляет примерно 1 см в сутки), что заставляет пересмотреть существовавшие представления о формировании волокон склеренхимы. Установлено, что точка слома на стебле льна является индикатором, разграничивающим отдельные стадии развития флоэмных волокон: удлинение первичных флоэмньтх волокон происходит только на участке стебля выше точки слома, ниже ее клеточная стенка лишь утолщается.

Впервые обнаружено, что буферрастворимый Р-(1->4)-галактан отсутствует в ходе удлинения волокон и появляется только после завершения интрузивного роста на стадии утолщения клеточной стенки, то есть представляет собой редкий полисахарид клеточной стенки, синтезируемый только на определенной стадии развития клетки. Показано, что тканеспецифичный галактан подвергается постсинтетической модификации. Оценено время его полужизни в системе интактного растения.

Практическая ценность работы. Охарактеризован легко идентифицируемый индикатор (точка слома) окончания интрузивного роста флоэмных волокон и начала синтеза тканеспецифичного полимера клеточной стенки. Наличие такого индикатора делает растения льна удобной моделью для функциональной геномики формирования растительного волокна, изучения механизмов формирования полисахаридов клеточной стенки и роста растительных клеток.

Выявлены существенные сортовые различия в содержании и распределении молекулярной массы тканеспецифичного галактана флоэмных волокон льна, что позволяет приступить к разработке новых генетических маркеров для использования в селекции льна-долгунца. Показано, что воздействие неблагоприятного фактора в период быстрого роста растений льна приводит к невосполнимым впоследствии потерям качества урожая, связанным с неоднородностью длины волокон в различных участках стебля.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на IX международной конференции по клеточной стенке (Тулуза, Франция, 2001), на конференции по растительным биополимерам (Нант, Франция, 2001), II Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), V съезде Общества физиологов растений России (Пенза,

2003) и на итоговых конференциях и семинарах КИББ КазНЦ РАН (2001, 2002,2003).

Благодарности. Глубокую признательность выражаю моему научному руководителю, заведующему лабораторией механизмов роста растительных клеток, д.б.н. Татьяне Анатольевне Горшковой за всестороннюю поддержку, терпение и неоценимую помощь в работе. Особую признательность приношу * с.н.с, к.б.н Светлане Борисовне Чемикосовой и н.с, к.б.н Марине

Вячеславовне Агеевой, а также с.н.с, к.б.н Вадиму Владимировичу Сальникову за бесценные советы, понимание и плодотворное обсуждение полученных данных. Отдельную благодарность хочу выразить моей семье за посильный вклад и искреннее участие, а также благодарю моих близких друзей за техническую поддержку.

Тканеспецифичный галактан лубяных волокон льна

Длина лубяных волокон льна варьирует по сообщениям различных авторов от нескольких миллиметров до 10 см (McDoughall et al, 1993; Fahn,1990). Чаще встречаются волокна длиной 20-30 мм. Нижняя треть стебля характеризуется меньшей длиной волокон. Диаметр клетки в средней ее части - 20-25 мкм, в кончике - 4-6 мкм. Толщина клеточной стенки максимальна на высоте стебля примерно 15-20 см от основания стебля (Hock, 1942), т.е. в участке, сформированном в начале периода быстрого роста растений. Льняные лубяные волокна являются многоядерными клетками, число ядер в каждом из них может достигать нескольких десятков (Anderson, 1927).

Число клеток лубяных волокон на поперечном срезе стебля составляет 6-7% от общего числа клеток. При этом масса лубяных волокон достигает 30% от массы стебля, поскольку остальные клетки имеют значительно более тонкие клеточные стенки (Горшкова и др, 2003). Лен — одна из древнейших технических культур, возделываемых человеком. Использование льна-долгунца для производства тканей было известно еще в древнем Египте 3000 лет до нашей эры. Льняное волокно, обладающее высокими прядильными свойствами, гигиеническими особенностями готовых тканей, до настоящего времени находит широкое применение на потребительском рынке. Лен-долгунец, культивируемый в России уже несколько веков на достаточно больших площадях, являлся в дореволюционном государстве одной из основных статей дохода (от продажи льна-сырца за границу).

Лен, как и другие двудольные растения, растет апикальным ростом. Клетки лубяных волокон образуются из веретеновидных инициальных клеток первичной меристемы конуса нарастания. Лен-долгунец содержит только первичные волокна (Александров и др., 1932, Esau, 1943). У других лубоволокнистых растений формируются вторичные волокна, которые образуются вторичной меристемой - камбием. Камбиальный слой у льна-долгунца формирует клетки вторичной ксилемы и флоэмы и разделяет стебель на две части: внутреннюю - древесину, и наружную - коровую. Последнюю часто называют лубом (Сизов, 1955). Поскольку это название используется в различных смыслах (см. выше) и, в какой-то мере, носит технический характер, при дальнейшем изложении будет использоваться корректный с ботанической точки зрения термин «флоэмные волокна».

Было обнаружено, что в верхней части растения находится достаточно специфичная точка, в которой меняются механические свойства стебля (Gorshkova et al., 1996, Salnikov et al, 1993; Salnikov et al., 1998). Эта точка получила название точки слома. Ниже точки слома стебель легко разделяется на наружную и внутреннюю часть. Разделение обычно происходит по внутренней поверхности пучков флоэмных волокон или по камбиальному слою с разной степенью чистоты разделенных "фракций", что зависит от фазы развития растения и условий их формирования. Подобное разделение часто используют при биохимическом анализе (McDougall, 1993 a; Gorshkova et al., 2000; Chikov et al., 2001). В наружную часть всегда входят эпидермис, паренхима и флоэмные волона, клеточные стенки последних составляют основную массу этой части стебля, особенно на поздних стадиях развития растений. Внутренняя часть представлена, в основном, ксилемой, но в нее могут попадать и сосуды флоэмы, и камбий (Gorshkova et al., 2000).

С использованием флюоресцентных красителей, специфичных для пектинов и целлюлозы, стало возможным наблюдать различные стадии формирования первичной и вторичной клеточных стенок в точках стебля льна долгунца, находящихся выше и ниже точки слома. В средней и нижней частях стебля флюоресценция, характерная для пектинов клеточных стенок лубяных волокон верхней части стебля, уменьшается (Salnikov et al., 1998).

Исследование флоэмных волокон льна с использованием методов просвечивающей (трансмиссионной) электронной микроскопии выявило ряд особенностей в их структуре, а также показало некоторые интересные закономерности формирования полисахаридных оболочек этих клеток. На ранних стадиях развития растений - в период быстрого роста - цитоплазма клеток характеризуется высокоактивным аппаратом Гольджи. Везикулы Гольджи рассеяны по всей цитоплазме, а вблизи плазмалеммы наблюдается их скопление (Агеева, 1990; Сальников и др., 1993). Обнаруженная в этот период высокая активность аппарата Гольджи в лубяных волокнах кореллирует с высокой интенсивностью синтеза полисахаридов матрикса клеточной стенки, наблюдаемой в параллельных. биохимических исследованиях. На поздних стадиях развития волокон идет процесс активного образования микрофибрилл целлюлозы и утолщения клеточной стенки волокон. В этот период вблизи плазматической мембраны обнаруживается скопление параллельных друг другу микротрубочек, вероятно, участвующих в ориентированной укладке возникающих микрофибрилл. Цитоплазма элементарных волокон характеризуется пролиферацией эндоплазматического ретикулума, что связано с его участием в синтезе и транспорте ферментов, необходимых для организации целлюлозосинтетазных комплексов на плазматической мембране (Лозовая и др., 1990; Сальников и др., 1993).

Если говорить о характеристике состава и строения льняного волокна, то оно представляет собой многокомпонентный полимерный объект, технологические свойства которого зависят от химического состава и строения компонентов, надмолекулярной структуры и морфологии (Афонин, Миронова, 1973; Ордина, 1978; Кошелева, 1980; Марченков, 1985; Иванов и др., 1986; Akin et al., 1996; Gilault et al., 2000). Среди основных особенностей, присущих льняному волокну, можно выделить также и то, что волокна льна могут достигать нескольких сантиметров в длину и быть закрученными друг относительно друга (Сальников и др., 1993). Основную массу льняного волокна (85-87%) составляют полисахариды клеточной стенки. Клеточные стенки волокон содержат большое количество целлюлозы с высокой степенью кристалличности. Также волокна льна содержат широкий набор нецеллюлозных полисахаридов матрикса, охарактеризованные в целом ряде работ (Northcote, Picket-Heaps, 1966; Davis et al., 1991; McDougall, 1993 b; Goubet et al., 1995; vanHazendonk et al., 1996; Gorshkova et al., 1996; Girault et al., 1997; Mooney et al., 2001). Примечательной особенностью клеточной стенки льняных флоэмных волокон является наличие тканеспецифичного полисахарида клеточной стенки — высокомолекулярного буферрастворимого галактана (Gorshkova et al., 1996).

Гель - хроматография буферрастворимых полимеров

Для биохимического анализа фиксировали различные участки стебля растения в соответствии со схемами, приведенными при изложении результатов. Ниже точки слома стебель делили на внутреннюю (ксилємную) и внешнюю (волокнистую) части. Для анализов образцов использовали внешнюю часть, содержащую волокна. Образцы для биохимического анализа фиксировали жидким азотом. Эксперименты проводили в 3-6 кратной повторности.

Для выделения клеточных стенок и буферрастворимых полимеров материал (150-1 000 мг сырой массы) гомогенезировали в 10 мл50 мМ К-фосфатного буфера, рН 7. Гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 10 000g. Содержащиеся в супернатанте буферрастворимые полимеры осаждали этанолом (конечная концентрация 80%), промывали и высушивали. Из осадка, оставшегося после получения буферрастворимых полимеров, выделяли клеточную стенку по методике Talmadge et. al. (1973). Для удаления крахмала осадок в течение ночи обрабатывали глюкоамилазой (Sigma, USA). Тест на наличие крахмала с использованием КІ - Г2 давал на полученной клеточной стенке отрицательные результаты. Полисахариды матрикса клеточной стенки удаляли кипячением осадка в уксусно - азотном реактиве (смесь азотной и ледяной уксусной кислот в соотношении 1:10) в течении 1 часа. Оставшийся при этом осадок представлял собой целлюлозу (Updegraff, 1969).

Для анализа буферрастворимых полимеров использовали хроматографические системы с колонками, позволяющими разделить полисахариды в диапозоне масс от 5 000 до 5 000 000: 1) HPLC система (UK6 инжектор и 510 HPLC насос,Waters, Milford, USA) с преколонкой (7,8x300 мм; Ultrahydrogel 500, Waters) и последовательно соединенными колонками (Ultrahydrogel 2000 и Ultrahydrogel 500, Waters). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,4 М (рН 3,0) со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр (Pharmacia, Uppsala, Sweden). 2) FPLC система (Pharmacia LKB P500) с колонкой (15x500 мм; Superosa 6, Pharmacia). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,1 М ( рН 4,5) со скоростью 0,5 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр LKB 2142. Объем отбираемых фракций - 1 мл. 3) HPLC система (HPLC насос, Gilson 302, France) с колонкой (12x400 мм; Sepharose 4В, Pharmacia). Элюцию проводили ацетатным буфером 0,01М (рН 4,5) со скоростью 0,25 мл/мин. В качестве детектора был использован дифференциальный рефрактометр Knauer. Объем отбираемых фракций - 1 мл. Для анализа содержания Сахаров использовали фенольный метод Дюбуа (Dubois et al, 1956). Моносахаридиый состав определяли с помощью системы Dionex (Dionex, Sunnyvale, USA) с амперметрическим детектором. В качестве элюента использовали 15 MMNaOH, 20 мин. Для введения ИС02 в. растения использовали замкнутую фотосинтетическую систему, состоящую из фотосинтетической камеры, газгольдера, компрессора и поглотителя 14С02. Общий объем системы составлял 90 литров. Внесение 370 МБк NH14C03 не приводило к существенному отклонению концентрации СОг от естественной. Эксперимент проводили на интактных растениях льна, которые целиком помещали в фотосинтетическую камеру. Время экспозиции растений с 14СОг (40 минут) выбрали с учетом необходимости попадания метки в метаболические пулы анализируемых тканей растения. Количество растений, помещенных в фотосинтетическую камеру, рассчитывали таким образом, чтобы убыль радиоактивности за время экспозиции не превысила 30%. Опыт проводили в 10 часов утра при естественном освещении в безоблачный день. Температура в фотосинтетической камере составляла 2бС. Часть растений фиксировали сразу после их экспозиции с 14СОг, остальные через 8 часов, одни сутки и пятеро суток роста растений в естественных условиях. Пробы, отобранные с каждого растения, обрабатывали отдельно. Количество биологических повторностей в опыте - 3. После выделения и фракционирования буферрастворимых полимеров и клеточной стенки по описанным выше методикам радиоактивность полученных фракций просчитывали на жидкостно-сцинтилляционном радиометре "Delta-300" фирмы "Tracer Analytic" (США). Для приготовления гистологических срезов отрезки стебля длиной Змм фиксировали в течение 24 часов в фиксаторе Чемберлена, промывали 80% этанолом и помещали в 70% этанол. Зафиксированный и обезвоженный материал заливали в парафиновые блоки по методике З.П. Паушевой (Паушева, 1970). Срезы готовили на салазочном микротоме и наклеивали на предметные стекла. Затем парафин удаляли и окрашивали срезы по методу Генденгайна (Паушева, 1970), заключали в канадский бальзам и анализировали с помощью светового микроскопа (МБИ-3, при увеличении 80). Количество биологических повторностей - 10, аналитических - 15. Все полученные результаты обработаны статистически по общепринятой методике (Лакин, 1980), средние квадратичные отклонения приведены в таблицах.

Первым этапом наших исследований было выяснение положения точки слома на стебле растения в онтогенезе. Оказалось, что точка слома обнаруживается только на определенных стадиях жизни растения. В ранний период развития растений льна, в фазы всходов и елочки (примерно три недели после прорастания), ее не идентифицировали. При наступлении периода быстрого роста точку слома легко выявляли с точностью до нескольких миллиметров (рис. 5).

В ходе развития растения точка слома перемещается вверх по стеблю. Когда растение начинает цвести (примерно семь недель после прорастания), рост стебля заканчивается; в дальнейшем увеличение высоты растения достигается только за счет роста метелок. В этот период точка слома исчезала (рис. 5). Расстояние от верхушки стебля до точки

Гель-проникающая хроматография буферрастворимых полимеров участков стебля льна, зафиксированных на различных стадиях развития растения

Выявление постсинтетических изменений тканеспецифичного галактана поставило вопрос об их динамике. Интенсивность постсинтетических модификаций полисахаридов клеточной стенки крайне редко оценивали в системе интактного растения. Классическим подходом для решения таких задач служит анализ перераспределения метки после введения экзогенного меченого субстрата. Тканеспецифичность буферрастворимого Р-(1- 4)-галактана, подтвержденная иммуноцитохимически В.В. Сальниковым (Gorshkova et.al.,2004), позволяла исследовать метаболизм этого полимера, не выделяя волокна. Проведение эксперимента на целых растениях и использование в качестве субстрата и СОг. максимально приближает ситуацию к естественной.

Для анализа использовали волокнистую часть стебля от семядолей до точки слома. Предварительные эксперименты показали, что через 10 суток после введения 4СОг в растение метка уже практически не обнаруживается в тканеспецифичном галактане, поэтому фиксацию проб проводили сразу после фотосинтеза с ,4С02 и через различные промежутки времени в течение 5 суток. Общая радиоактивность анализируемого участка стебля (табл. 6) была достаточно высокой для надежной регистрации радиоактивности полимеров клеточной стенки после их детального фракционирования. Динамика радиоактивности клеточной стенки имела обычный характер (табл. 6). Доля радиоактивности клеточной стенки от общей радиоактивности постепенно увеличивалась и составляла через 5 суток около 40% от общей радиоактивности анализируемого участка.

Для определения радиоактивности галактана, оценивали радиоактивность фракций после разделения буферрастворимых полимеров на колонке с Sepharose 4В (рис 13). Параллельная регистрация тканеспеци фичного галактана с помощью рефрактометра не выявила существенного изменения профиля элюции. Радиоактивность галактана определяли, суммируя радиоактивность собранных фракций (с 6 по 23) (рис. 14). После 40 -минутной экспозиции с 14СОг происходило постепенное включение метки в галактан, через сутки оно достигало максимальных значений, а к 5 суткам радиоактивность полимера существенно снижалась (рис 13, 14). Обращает на себя внимание тот факт, что изменение радиоактивности различных фракций со временем не было сопряжено с изменением общего характера профиля: не происходило смещения молекулярных масс, соотношение двух пиков галактана оставалось примерно постоянным. Таким образом, «низкомолекулярный» галактан (правое плечо или дополнительный пик, обсуждавшийся в разделах 3.2 и 3.5) не возникает в результате распада более высокомолекулярной фракции, а синтезируется и модифицируется параллельно с ней.

Для оценки интенсивности постсинтетической модифиации галактана мы сопоставили включение метки в галактан и в неметаболизируемый полимер клеточной стенки — целлюлозу. В отличие от галактана, радиоактивность целлюлозы постоянно увеличивалась во времени. При этом происходило не только относительное уменьшение радиоактивности галактана в сравнении с радиоактивностью целлюлозы, но и убыль ее абсолютных значений (рис. 13, 14). Мы рассчитали время полужизни тканеспецифичного галакана, сопоставив прирост его радиоактивности и прирост радиоактивности целлюлозы за одинаковые промежутки времени. Для подобного расчета необходимо сделать допущение, что скорость синтеза галактана и целлюлозы за период наблюдения не изменялась или изменялась синхронно. (среднее для трех биологических повтор ноете й в каждой временной точке)

Основанием для подобного допущения является то, что эти полимеры клеточной стенки синтезируются в сходной метаболической цепочке и имеют общего предщественника - УДФГ. Расчет проводили по формуле: где ТІ/2 - время полужизни (час), Tt— промежуток времени от экспозиции с 1 СОг до фиксации (час), Rut - радиоактивность целлюлозы во время t, RH — радиоактивность целлюлозы сразу после 40-минутной экспозиции с ,4С02, Rrt - радиоактивность галактана во время t, Rr — радиоактивность галактана сразу после 40-минутной экспозиции с 14СОг (Горшкова, 1997) (табл. 7). В первые 8 часов после "глотка" 14СОг время полужизни полимера составило всего 4 часа, что свидетельствует о быстром распаде новосинтезированных молекул. Затем время полужизни галактана увеличивалось. За период от "глотка" до 5 суток оно составило уже 52 часа, что говорит о замедлении процесса распада оставшихся молекул галактана. Таким образом, постсинтетическая модификация галактана начинается сразу после его образования и идет особенно интенсивно в первые часы после синтеза.

По количеству метки, включенной в тканеспецифичный галактан за первые 40 минут экспозиции растений с 14С02, можно оценить масштабы его синтеза, по сравнению с другими полисахаридами клеточной стенки. Сразу после "глотка" 14СОг его радиоактивность была достаточно высокой и составила 28% от радиоактивности всей клеточной стенки и 47% от радиоактивности целлюлозы. Таким образом, масштабы формирования тканеспецифичного галактана весьма существенны. Сопоставление этих данных с результатами определения содержания галактана (оно составляло около 1% от массы клеточной стенки — раздел 3.4), позволяет также утверждать, что существует интенсивное расщепление полисахарида, идущее параллельно с синтезом новых молекул.

Изменение механических свойств в районе точки слома и активация синтеза тканеспецифичного галактана позволили предположить, что в этом участке стебля могут происходить существенные изменения в развитии флоэмных волокон. Классическим приемом для изучения динамики удлинения и утолщения клеток является анализ срезов стебля. При этом продольные срезы позволяют характеризовать длину волокон только на ранних стадиях развития, поскольку через удлиняющиеся волокна невозможно сделать продольный срез, по крайней мере, пока эта клетка находится в толще стебля. Однако еще Т. Тамс (Tammes, 1907) отмечала, что динамику удлинения можно анализировать и на поперечных срезах, поскольку интрузивный рост должен приводить к увеличению на них числа волокон. На рисунке 15 приведена иллюстрация этого положения: если внутри отрезка стебля равномерно расположено одинаковое количество волокон (п=20), но длина их возросла вдвое (L=5 и Ь= 10), то и на любом поперечном срезе их число увеличится вдво (рис 15).

Для характеристики локализации и продолжительности отдельных стадий развития льняного волокна мы проанализировали поперечные срезы стебля (рис. 16) в различные периоды роста растений. Число волокон на поперечных срезах стебля растений льна в различных экспериментах составляло от 500 до 600 клеток.

Возможные функции тканеспецифичного галактана флоэмных волокон стебля льна

Изучение формирования льняных волокон затруднено тем, что эти клетки находятся в толще стебля. Их выделение без повреждения практически невозможно, особенно на ранних стадиях развития. С другой стороны, на более поздних стадиях формирования, когда волокна достигают характерной для них длины, невозможным становится получение картины всей клетки, поскольку она никогда не попадает целиком на продольный срез стебля. Однако существуют приемы, позволяющие достаточно четко установить характер и продолжительность отдельных стадий формирования волокон.

Лен, как и другие двудольные растения, растет апикальным ростом. Зона роста выявляется по уменьшенной длине междоузлия и составляет 1,5-2,0 см от апекса. Поскольку в стебле льна содержатся только первичные флоэмные волокна (Александров и др., 1932; Esau, 1943 b), верхняя часть стебля всегда содержит более молодые волокна, чем нижняя. Анализируя стебель сверху вниз, можно проследить последовательные этапы развития волокон (рис.25 А). Этот подход широко используется и, безусловно, дает общие представления о ходе развития волокон. Однако четких характеристик в этом случае получить невозможно, поскольку сопоставляются волокна, формировавшиеся на разных этапах развития растений, отличающихся, например, гормональным балансом, обеспеченностью субстратами и т.д. Тем более неудачным является часто используемое сопоставление волокон из средней части стебля на разных этапах развития растений, которое сложно оправдать с биологической точки зрения.

Более четким является подход, основанный на а) наличии в стебле только первичных волокон; б) верхушечном росте растений; в) отсутствии ветвлений стебля. Он заключается в анализе волокон на одной и той же высоте стебля в ходе онтогенеза растений (рис.25 Б), В этом случае сопоставляются волокна, имеющие одинаковую предысторию. Именно этот подход позволил нам установить продолжительность отдельных стадий и их локализацию в стебле, что, в свою очередь, ведет к изменению существовавшего представления о формировании склеренхимных волокон.

Характер формирования волокон склеренхимы особенно интенсивно изучали в 20-40 годах прошлого века, причем, именно на флоэмных волокнах льна. Детальные исследования ряда лабораторий (Aldaba 1927; Anderson, 1927; Hock 1942, Esau, 1942; 1943 a, b; Schoch-Bodmer, Huber, 1945, 1951) были обобщены К. Эсау (Esau, 1953) (рис, 26), с тех пор переходят из учебника в учебник (Эзау, 1980; Fahn, 1990) и считаются устоявшимися. Известно, что волокна растут сначала скоординированно (синхронно) с ростом окружающих тканей (симпластический рост), а затем интрузивно. Утверждалось, что необычная длина склеренхимных волокон достигается за счет длительного роста концов клетки, который сочетается с отложением вторичной клеточной стенки в более старой (то есть срединной) части волокна. Таким образом, считалось, что в склеренхимных волокнах сочетаются два процесса, которые обычно разделены во времени (удлинение и формирование вторичной клеточной стенки). Судя по нашим данным, интрузивный рост индивидуального волокна осуществляется в очень ограниченный период, за 3-5 дней. В это время клетки уже достигают длины в несколько сантиметров, но имеют относительно тонкую клеточную стенку, что делает их чрезвычайно хрупкими. В дальнейшем удлинение волокна не происходит. Маркером, позволяющим локализовать на стебле льна окончание интрузивного роста флоэмных волокон, является точка слома.

Рост клеток — сложнейший интегральный процесс, в котором задействованы различные стороны метаболизма (Обручева 1965, Иванов 1974). Скачкообразное изменение скорости роста клеток корня при переходе от деления к растяжению клеток заставляет предполагать, что в их осуществлении задействованы разные механизмы (Ivanov 1997, van der Wee I є 2003). Это тем более справедливо для интрузивного роста. Интрузивный рост - способ роста, при котором скорость удлинения клетки превышает скорость роста сопредельных тканей. Сходным образом удлиняются, например, аксоны и дендриты нервной ткани животных и человека (Lev-Yadun, 2001), однако осуществление этого процесса у растительных клеток значительно осложнено наличием жесткой клеточной стенки. Механизмы реализации и регуляции интрузивного роста растительных клеток изучены крайне слабо (Serpe et аЦ 2002). Практически ничего неизвестно о стимулах, инициирующих интрузивный рост. Неясно, каким образом эти стимулы передаются, что обеспечивает компетентность волокон к их восприятию и отсутствие ее у других клеток. Выявленные нами четкие временные рамки интрузивного роста, высокая скорость этого процесса, охарактеризованная локализация в стебле и наличие легко обнаруживаемого маркера окончания удлинения позволяют приступить к изучению механизмов и, способов регуляции этого своеобразного типа роста растительных клеток.

Ключевой для формирования лубяных волокон стадией в развитии растений льна является период быстрого роста, когда прирост стебля в высоту достигает 2-4 см в сутки. В это время на растущем стебле льна можно найти волокна, находящиеся на всех основных стадиях формирования. Продолжительность периода быстрого роста составляет 18-25 дней.

В период быстрого роста дифференцируется основное количество лубяных волокон, происходит их удлинение до окончательных размеров. В дальнейшем масса волокна увеличивается только за счет утолщения клеточных стенок. Поэтому все характеристики качества урожая, которые зависят от количества клеток волокон и их длины, определяются уже на стадии быстрого роста и в дальнейшем не могут быть изменены. На более поздних стадиях развития апикальная меристема перестраивается на формирование соцветий, точка слома исчезает, в клетках волокон происходят лишь процессы утолщения клеточных стенок и созревания волокон. Неоднородность длины различных волокон формируется именно на стадии интрузивного роста. Интрузивный рост осуществляется с различной скоростью для клеток волокон, находящихся в пучке на одном уровне стебля. Отчасти это может быть следствием неодновременности их образования прокамбием. С другой стороны, различные волокна могут испытывать неодинаковое механическое сопротивление окружающих тканей.

Высокая интенсивность ростовых процессов, временная и пространственная разграниченность различных стадии развития, наличие охарактеризованных маркерных признаков для отдельных стадий (Горшкова и др., 2003) делают льняные лубяные волокна интересным объектом для изучения механизмов роста растительной клетки и их регуляции.

Похожие диссертации на Метаболизм тканеспецифического галактана и развитие флоэмных волокон льна