Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Морфологическая изменчивость возбудителя мучнистой росы пшеницы и цитофизиологических реакций растения как возможное фенотипическое проявление изменений в состоянии патосистемы 71
1.1 Особенности развития возбудителя мучнистой росы пшеницы 77
1.1.1 Действие экзогенных цитокининов на параметры ранних этапов развития возбудителя мучнистой росы пшеницы 82
1.1.2 Развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса 89
1.2 Регуляция направления роста возбудителя мучнистой росы пшеницы вдоль и поперек главной жилки листа 93
1.3 Образование и вариабельность гало – ответная реакция эпидермальных клеток злаков на проникновение возбудителя мучнистой росы 114
1.3.1 Изменение размеров гало под действием экзогенных цитокининов 121
1.3.2 Изменчивость гало под действием оксидативного стресса и метаболических ингибиторов 125
1.3.3 Изучение гало методом сканирующей электронной микроскопии 137
ГЛАВА II. Многофазность иммуномодулирующего действия физиологически активных веществ 143
2.1 Иммуномодулирующие свойства цитокининов в патосистеме пшеница-возбудитель мучнистой росы 145
2.2 Форма концентрационной кривой иммуномодулирующих свойств цитокининов и ее варьирование 152
2.3 Влияние иммуномодуляторов на форму концентрационной кривой иммуномодулирующей активности зеатина при совместном применении 172
2.4 Математическая модель концентрационной зависимости влияния цитокининов на восприимчивость листьев пшеницы к возбудителю мучнистой росы 181
2.5 Динамика цитокининов и абсцизовой кислоты при инфицировании мучнистой росой пшеницы в патосистемах с различным уровнем совместимости 202
2.6 Биологические свойства олигоаденилатов растительного происхождения 207
2.6.1 Действие олигоаденилатов растительного происхождения на вирусную инфекцию и рост черенков картофеля в культуре ткани in vitro 214
2.6.2 Олигоаденилаты растительного происхождения при оздоровлении картофеля от вирусов методом апикальной меристемы 220
2.6.3 Цитокининподобная активность интерферона и олигоаденилатов растительного происхождения 227
2.6.4 Иммуномодулирующие свойства олигоаденилатов растительного происхождения в патосистеме пшеница–возбудитель мучнистой росы и их влияние на форму концентрационной кривой зеатина при совместном применении 231
2.7 Изменение восприимчивости пшеницы к возбудителю мучнистой росы при обработке экзогенной АБК 238
2.8 Влияние медиаторов кальциевой сигнальной системы на восприимчивость пшеницы к мучнистой росе 248
ГЛАВА III. Многофазное действие экзогенных цитокининов в регуляции ростовых процессов 252
3.1 Концентрационная зависимость действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков рапса 255
3.2 Многофазность концентрационной зависимости действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков томатов 274
3.3 Влияние цитокининов разного химического строения на длину проростков рапса и томатов 277
3.4 Суммарные концентрационные кривые томатов и рапса 288
3.5 Вариабельность концентрационной зависимости рострегулирующего действия цитокининов в присутствии иммуномодуляторов и цитокининов иной природы 297
3.5.1 Взаимное влияние тидиазурона и зеатина 297
3.5.2 Концентрационная кривая зеатина при моделировании окислительного стресса 306
3.5.3 Изменение концентрационной кривой зеатина в присутствии салициловой кислоты 314
3.6 Многофазность концентрационной зависимости активности цитокининов в амарантус-тесте 328
ГЛАВА IV. Индуцибельные лектины и устойчивость растений к патогенным организмам и абиотическим стрессам 335
4.1 Изменение активности лектинов при инфицировании и в растениях, обработанных индукторами устойчивости 339
4.2 Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулированного вирусом табачной мозаики 351
4.3 Влияние экзогенных моносахаридов и лектинов на активность реакции Хилла в изолированных хлоропластах здоровых и инфицированных растений 361
4.4 Изменение содержания агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) в растениях, обработанных перекисью водорода 373
4.5 Роль лектинов в регуляции защитных реакций и ростовых процессов растений 382
4.5.1 Индукция лектинов при биотических и абиотических стрессах 383
4.5.2 Лектины и фитогормоны 390
4.5.3 Лектины в ростовых процессах 393
4.5.4 Лектины и окислительный стресс 396
4.5.5 Лектины и цитоскелет 398
Заключение 406
Выводы 420
Положения, выносимые на защиту 422
Список литературы 423
Список работ, опубликованных по теме диссертации 505
Публикации по теме диссертации в рецензируемых журналах и патенты 505
Публикации в материалах конференций и сборниках
- Развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса
- Влияние иммуномодуляторов на форму концентрационной кривой иммуномодулирующей активности зеатина при совместном применении
- Концентрационная зависимость действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков рапса
- Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулированного вирусом табачной мозаики
Развитие возбудителя мучнистой росы пшеницы при моделировании окислительного стресса
В предыдущем разделе было показано, что цитокинины оказывают влияние на характер дифференциации инфекционных структур мучнисторосяного патогена. Некоторые другие соединения также могут увеличивать аномалии развития фитопатогенных грибов. Образование аномальных аппрессориев с увеличенным числом лопастей происходило под действием метрофенона, ингибитора полимеризации актинового цитоскелета (Nave et al., 2008). При применении метилглиоксаль-бис-гуанил гидразона, ингибитора синтеза полиаминов, наблюдали подавление развития аппрессориев некротрофного гриба Cochliobolus miyabeanus (Ahn, 2008). В наших экспериментах изучали влияние на дифференциацию инфекционных структур возбудителя мучнистой росы окислительного стресса, который моделировали применением 3-амино-1,2,4-триазола (3-АТА).
При концентрации 3-АТА 50 мМ развитие патогена останавливалось на стадии формирования аппрессория и дальнейшего образования колоний не происходило. При 10 мМ 3-АТА наблюдали образование небольшого числа нежизнеспособных колоний. Хотя действие относительно низкой концентрации (2мМ) практически не приводило к изменению числа колоний, происходило замедление их роста и аномалиям (рис. 1.6 В). Иногда конидии прорастали с появлением множества зачатков гиф, не образующих нормальные инфекционные структуры в дальнейшем. Ранее при использовании перекиси водорода и 3-АТА также наблюдали сходные конидии и единичные микроколонии с многочисленными утолщенными и, вероятно, не функционирующими, ростковыми трубками (Аветисян, Бабоша, 2009).
Одновременное добавление зеатина частично снимало ингибирование возбудителя мучнистой росы под действием 3-АТА (табл. 1.1). Увеличивалась доля нормального развития инфекционных структур и число колоний. Среди вариантов с одновременным применением зеатина и 3-АТА наблюдали корреляцию между долей нормальных аппрессориев и числом микроколоний. Однако все колонии, развившиеся в присутствии 3-АТА, имели небольшой размер, были видимы только при использовании СЭМ, и дальнейшего их развития не происходило. Следует отметить, что зависимость стимуляции развития инфекции от концентрации зеатина в присутствии 3-АТА была немонотонной, а ее форма соответствовала форме кривых на рис. 1.4 и 1.5. Достоверное (при p(2) 0,001–0,02) увеличение доли нормального развития наблюдали в 2-х диапазонах концентрации зеатина: 0,25–1 и 3–4 мкМ, первый из которых представлял собой хорошо выраженный максимум.
3-АТА является действующим веществом препарата с гербицидной активностью (Singer, McDaniel, 1982) и обладает активностью ингибитора пероксидазы и каталазы (Perez, Rubio, 2006). Известно также, что некоторые вещества из той же группы триазолов являются системными фунгицидами с активностью ингибиторов синтеза стеролов (Maffi et al.,1995). Сопоставление характера воздействия на развитие мучнисторосяного патогена между 3-АТА и перекисью водорода дает определенные различия между ними (Аветисян, Бабоша, 2009), что может быть связано с наличием у 3-АТА дополнительной фунгицидной активности. Вместе с тем токсическое действие 3-АТА, вероятно, все же опосредовано увеличением активных форм кислорода. Так, по литературным данным, обработка клеток табака 3-АТА приводила к увеличению содержания перекиси водорода (Able et al., 2000). Наоборот, обработка перекисью водорода способствовала большей толерантности растений табака к токсическому действию 3-АТА за счет увеличения активности ферментов-антиоксидантов (Gechev et al., 2002). Следует отметить, что и перекись водорода, и 3-АТА в наших исследованиях способствовали израстанию аппрессория и изменению структуры гало (Аветисян, Бабоша, 2009), что характерно также для развития мучнистой росы на листьях устойчивых растений (Сережкина и др., 1996; Мишина и др., 2001). Эти данные свидетельствуют о важной роли оксидативного стресса в регуляции патогенеза мучнистой росы и позволяют предположить (Аветисян, Бабоша, 2009), что причиной аномального развития патогена на устойчивых растениях может быть воздействие активных форм кислорода, возникающих в устойчивом растении при прохождении защитных реакций.
Влияние иммуномодуляторов на форму концентрационной кривой иммуномодулирующей активности зеатина при совместном применении
Условия существования растений нестабильны. Действие неблагоприятных абиотических факторов приводит к индукции защитных процессов, в норме способствующих повышению адаптации. Контакты с элиситорами фитопатогенов также способны включать защитные реакции, индуцировать местную или системную устойчивость. Все это приводит к наличию той или иной степени индуцированной устойчивости у растений в полевых условиях (Walters, 2009). Можно предположить, что эндогенные вещества, синтезированные в ответ на предшествующие биотические и абиотические стрессы, способны оказывать влияние не только на восприимчивость растений, но и на метаболизм цитокининов и, соответственно, на форму концентрационной кривой цитокининов. В экспериментах, описанных в данном разделе подобную ситуацию моделировали одновременной обработкой зеатином и дополнительными иммуномодуляторами.
Салициловая кислота регулирует защитные реакции растения, выполняя гормоноподобные функции (Raskin, 1992). При обработке салициловой кислотой происходит индукция синтеза PR-белков, а растения приобретают устойчивость к патогенам (Du, Klessig, 1997). Действие данного вещества на устойчивость обычно связывают с инактивацией каталазы и соответствующим увеличением количества перекиси водорода (Chen et al., 1993; Durner, Klessig, 1996). Предынкубация растения в присутствии салициловой или 2,6-дихлороизоникотиновой кислот усиливала синтез перекиси водорода, индуцируемый при контакте с элиситорами (Kauss, Jeblick, 1996; Трошина и др., 2004). Наоборот, антиоксиданты ингибировали синтез PR-белков, индуцируемый салициловой кислотой (Wendehenne et al., 1998). Некоторые исследователи полагают, что между сигнальными путями цитокининов и салициловой кислоты, участвующими в регуляции устойчивости растений к фитопатогенам, имеется тесная взаимосвязь (Argueso et al., 2012).
. Зависимости числа колоний возбудителя мучнистой росы (в % от контроля) от концентрации салициловой кислоты. 1–3 – Результаты независимых экспериментов. Отдельными точками с ординатой 100% показан уровень ошибки в контроле в %. Соответствующие абсолютные величины плотности колоний в контроле в каждом из экспериментов и их ошибки имели значения 5,1±0,5; 86±3 и 1,5±0,3 ед./см-2. Более крупным незаполненным маркером отмечены достоверные экстремальные точки при использовании t-теста. Заполненным маркером отмечены экстремумы, достоверность которых показана с использованием критерия Ньюмена-Кейлса
Зависимость числа колоний возбудителя мучнистой росы от концентрации зеатина в присутствии салициловой кислоты. 1 – только зеатин; 2 – 20 мкМ и 3 – 100 мкМ салициловой кислоты. Более крупным маркером отмечены достоверные экстремальные точки согласно t-критерию (незаполненный маркер) и критерию Ньюмена-Кейлса (заполненный маркер).
На рис. 2.6 представлены результаты 3-х независимых экспериментов при испытании иммуномодулирующих свойств салициловой кислоты в использованной нами модельной системе в отсутствие цитокининов. Иммуномодулирующее действие данного вещества сильно зависело от используемой концентрации. Кривые доза-эффект были не монотонными и сходными по форме. Во всех 3-х экспериментах при концентрации 20 мкМ наблюдали минимум (достоверный или визуально заметный), соответствующий относительному увеличению устойчивости растения. Дополнительно все кривые имели по 2 в разной степени выраженных максимума. На кривой №1 этим точкам соответствовало почти 2-кратное увеличение плотности колоний патогена, достоверное при сравнении с необработанным контролем. В независимых экспериментах варьировали общая направленность иммуномодуляции, что выражалось в расположении концентрационной кривой целиком или почти целиком выше или ниже уровня контроля. Варьировало также положение и выраженность максимумов. Все 3 экстремума верхней кривой отделены от соседних точек достоверными различиями, т.е. имеют восходящую и нисходящую ветви. Для средней кривой эти условия выполнены только для минимума. Таким образом, концентрационная зависимость для салициловой кислоты в исследуемой модельной патосистеме может иметь вид немонотонной и многофазной кривой с 3-мя экстремальными точками, положение которых по горизонтальной и вертикальной осям может варьировать. В соответствии с этим направление иммуномодуляции при обработке салициловой кислотой может быть положительным или отрицательным, что согласуется с ранее известными фактами разнонаправленной активности данного вещества по отношению к возбудителю фитофтороза (Васюкова и др., 1996). Интересно отметить, что действие салициловой кислоты на флоэмную разгрузку в корнях проростков кукурузы также имело двухфазный характер и изменяло свое направление в зависимости от концентрации или продолжительности экспозиции (Бурмистрова и др., 2009). Интересно отметить, что обработка салициловой кислотой снижает синтез оксида азота (NO) (Gemes et al., 2011), а тот в свою очередь способен ингибировать и стимулировать действие салициловой кислоты, по крайней мере, в 2-х местах сигнальной цепи для каждого из противоположных направлений активности (Mur et al., 2013). Не удивительно, что экспрессия в растениях пшеницы гена NPR1 (non-expressor of PR genes – один из ключевых компонентов сигнальной цепи салициловой кислоты) приводила к противоположным по знаку изменениям устойчивости к Fusarium asiaticum у колоса и проростков (Gao et al., 2013).
Концентрационная зависимость действия цитокининов на рост корня и гипокотиля проростков рапса
На рис. 3.1–3.3 представлены концентрационные кривые действия экзогенного зеатина на длину корня и гипокотиля проростков рапса. Добавление зеатина вызывало зависимое от концентрации ингибирование роста корня (рис. 3.1АВД и 2АВ). Этот ингибирующий тренд может быть представлен линией регрессии (линии №2 на графиках). Как правило, эта кривая имела 2 области с разным наклоном. При низких концентрациях зеатина (меньше 0.3–0.5 мкМ) наблюдали более резкое относительное снижение размеров корня. Коэффициенты регрессии, характеризующие наклон линий и построенные отдельно для высоких и низких концентраций, как правило, достоверно различались (данные не представлены). Однако наряду с монотонным ингибирующим трендом, все полученные нами 256 концентрационные кривые имели немонотонный компонент – флуктуации ординаты вариантов вокруг линии регрессии в виде более или менее выраженных экстремальных точек (минимумов и максимумов). При концентрациях, в которых в случае монотонной кривой должна была бы находиться точка перегиба между крутым и пологим участками (примерно 0.25–0.5 мкМ для кривых рис. 3.1, 0.14–0.37 мкМ рис. 3.2), во всех опытах наблюдали в разной степени выраженный минимум и, соответственно, в начале более пологого участка – максимум. В некоторых опытах заметны дополнительные экстремальные точки при более высоких и более низких концентрациях. Все концентрационные зависимости действия зеатина на длину гипокотиля так же, как и кривые для длины корня, имели сложный характер (линии № 1 на рис. 3.1БГЕ и 3.2БГ). В отличие от корня общую тенденцию ингибирования длины гипокотиля при увеличении концентрации фитогормона не всегда можно проследить, хотя в отдельных опытах коэффициент линейной регрессии (кривые с № 2 на рис. 3.1БГ), вычисленный с использованием всех градаций концентрации зеатина, имел существенную (отрицательную) величину. Так же, как и в случае корня, даже на кривых с выраженной общей тенденцией ингибирования концентрационные зависимости роста гипокотиля имели экстремальные точки, т.е. не являлись монотонно убывающими. Ранее в гл.2 уже обсуждали вопрос о том, насколько реальны на концентрационной кривой сложной формы наблюдаемые отклонения от монотонности, т.е. вопрос о достоверности экстремальных точек. Здесь также примем, что экстремальная точка является достоверной, если ее ордината имеет достоверные однонаправленные отличия от величин ординат точек при более высоких и более низких концентрациях изучаемого вещества. В отличие от иммуномодулирующей активности цитокининов зависимость от концентрации их рострегулирующих свойств, как правило, имела общий 257 монотонный тренд. В силу преимущественно ингибирующей общей тенденции в действии цитокининов на рост корня и гипокотиля при использовании исходных данных длины органа разность среднего в точке минимума со значениями, лежащими левее в зоне более низких концентраций, будет преувеличена, а разность (и, соответственно, ее достоверность) относительно значений, лежащих правее, – преуменьшена. Данное обстоятельство приводит к тому, что достоверное различие между значениями в минимуме и следующем за ним при более высоких концентрациях фитогормона максимуме в большинстве случаев будут свидетельствовать о присутствии обеих экстремальных точек. Наличие общей тенденции уменьшения или увеличения может быть учтено при построении линии регрессии в качестве базового уровня для учета отклонений в точках предполагаемых экстремумов. Критерием наличия экстремума в этом случае может быть достоверное отличие между реально полученными значениями ординаты и соответствующими значениями точки на линии регрессии. Как видно из рис. 3.1 и 3.2, зависимость между длиной корня и концентрацией экзогенного зеатина не является линейной. Однако для экстраполяции базовой линии на относительно небольших участках можно использовать линейную регрессию, полученную с использованием нескольких ближайших точек по обе стороны области экстремума. Такой подход может быть оправдан в силу большей простоты вычислений параметров линейной регрессии. Очевидно, что использование базовой линии будет более точным критерием существования экстремальной точки по сравнению с описанным выше в случае, если экспериментальные данные позволяют визуально или каким-либо иным способом отделить точки, которые относятся к области экстремума от точек базовой линии. Это даст возможность рассчитать параметры линии регрессии с большей точностью. Наконец, в случае, если зона экстремума включает несколько точек, возможно, будет более целесообразно построить линии регрессии, соответствующие восходящей и нисходящей ветви. Если коэффициенты регрессии этих линий будут иметь разные знаки, достоверно отличаться от нуля и друг от друга, это будет указывать на наличие экстремума. Следует отметить, что полученные всеми тремя методами результаты указывают на существование экстремума, но не на его точное положение и полное соответствие той экспериментальной точке, которая была использована в расчетах в качестве предположительного экстремума. Кроме того, совершенно очевидно, что две точки с достоверными отличиями с обеих сторон являются двумя разными экстремумами, а не частями одного и того же, только в случае, когда между двумя максимумами имеется минимум или между двумя минимумами – максимум. Именно принимая эти ограничения, далее будем говорить о достоверном максимуме или минимуме в точке, соответствующей примененной концентрации экзогенного вещества.
Примеры вычислений достоверности экстремальных точек тремя методами для кривых длины корня и гипокотиля на рис. 3.1ДЕ представлены в табл. 3.1–3.3. Для вычислений по методу табл.3.3, были использованы средние значения и ошибки, указанные на рис. 3.1, для остальных вычислений – исходные данные. Вполне естественно, что выводы, полученные при использовании каждого метода, совпадают или близки. Вычисления 2-мя методами показали высокую вероятность существования минимума (0,25 мкМ) и максимума (0,5 мкМ) роста корня на кривой рис. 3.1Д, а также второй пары минимум-максимум при 0,75 и 1 мкМ зеатина на кривой роста гипокотиля (рис. 3.1 Е) в этом же опыте (табл. 3.1 и 3.2). В случае первого минимума и первого максимума длины гипокотиля при 0,125 и 0,25 мкМ зеатина небольшая амплитуда изменений в сочетании с наличием тенденции увеличения ингибирования роста при увеличении концентрации фитогормона привела к тому, что простое сравнение средних ординат с использованием t-теста оказалось недостаточно чувствительным, 259 чтобы обнаружить эти экстремальные точки (табл. 3.2). Можно было ожидать и низкую чувствительность метода сравнения линий регрессий (табл. 3.3), соответствующих восходящей и 2-м нисходящим ветвям, поскольку зона минимума при 0,125 мкМ включает только одну градацию концентрации, и 2 необходимые линии из 3-х могут быть построены только по данным 2-х концентраций. Вычисления табл. 3.3 показали, что и минимум при 0,125 мкМ и максимум при 0,25 мкМ зеатина, возможно, все же существенно отличаются от уровня базовой линии, хотя оценка вероятности ошибки лишь ненамного меньше условного порогового значения p=0,05. Учитывая результаты других тестов, в которых вероятности ошибки для двустороннего распределения колебались вокруг значения 0,1 можно предсказать достаточно частое появление визуально заметного минимума в области 0,125 мкМ или при близких концентраций цитокининов, что подтверждается сходством формы кривых гипокотиля в других экспериментах на рис. 3.1–3.3.
Пространственное распределение активности лектинов в околонекротической зоне листьев табака, инокулированного вирусом табачной мозаики
Инфицирование приводит к возникновению гетерогенности ранее однородных клеток растения-хозяина. Инфицированные клетки и клетки, находящиеся на разном расстоянии от пораженной ткани, различаются по своему физиологическому состоянию. Особенностью реакции сверхчувствительности является сочетание признаков усиления метаболизма (увеличение поверхности ядра и укрупнение ядрышек, новообразование митохондрий) в тканях околонекротической зоны и лизиса (деградация тилакоидной системы и образование вакуолей) непосредственно в зоне некротизации (Israel, Ross, 1967; Лега, Реунов, 1996). Состояние клеточных мембран в околонекротической зоне, вероятно, определяется тем, что эти ткани находятся на промежуточном этапе клеточного коллапса, т.к. попадают в область некротизации при увеличении диаметра некроза. На листьях табака, инфицированных ВТМ, проницаемость клеточных мембран, измеренная по величине экзоосмоса, увеличивалась по мере приближения к границе некроза (Селецкая и др., 1996). По мере приближения к некрозу, индуцированному стеблевой ржавчиной, размеры клеток губчатой и столбчатой паренхимы листьев пшеницы уменьшались, а размеры хлоропластов увеличивались (Сережкина и др., 1991). Процесс локализации вирусного патогена сопровождался возникновением в тканях растения, окружающих место первичного внедрения, сложной динамической структуры, включающей кольцевые области тканей с различным физиологическим состоянием (Tesci et al., 1996). Интенсивный синтез компонентов вириона происходил в узкой полосе ткани восприимчивого растения на границе зараженной и незараженной области (Wang, Maule, 1995; Tesci et al., 1996). Эта зона обладала также высоким уровнем фотосинтетического транспорта электронов и синтеза белка (в основном, вирусного) (Tesci et al., 1996). По направлению внутрь зараженной области, к точке первичного проникновения вируса, располагалась полоса ткани с высоким содержанием крахмала и далее зона, в которой преобладали процессы распада: гидролиз крахмала, снижение активности цикла Кальвина, высокий уровень гликолиза, окислительного пентозофосфатного цикла и дыхательного транспорта электронов. При сверхчувствительной реакции растений дурмана на инфицирование вирусом табачной мозаики (ВТМ) околонекротическая зона характеризовалась повышенной активностью протеаз, РНК-аз и фосфатаз по сравнению с окружающими некроз и здоровыми тканями листа (Лега, Реунов, 1993). Несовместимое взаимодействие в патосистеме фасоль–Pseudomonas syringae приводило к повышению активности кислой пероксидазы, ксантиноксидазы и глютатион редуктазы и снижению активности каталазы в инокулированной зоне примерно через сутки после инокуляции, что во времени и пространстве коррелировало с процессом лигнификации, происходящим с потреблением перекиси водорода (Milosevic, Slusarenko, 1996). Здоровые ткани, окружающие индуцированный вирусом некроз, обладали также повышенной дегидрогеназной активностью (Farkas et al., 1960).
Целью работы было исследование пространственного изменения активности лектинов и некоторых других параметров в околонекротической зоне листьев сверхчувствительных растений табака, инфицированных ВТМ. Листья сверхчувствительных к ВТМ растений табака (Nicotiana tabacum L. сорт Самсун NN и N. glutinosa L.) инокулировали соком инфицированного восприимчивого растения и помещали во влажную камеру при 25 оС и освещенности 4000 лк. Через 2–9 сут околонекротическую ткань листа вырезали с помощью пробойников с последовательно увеличивающимся диаметром. Из листового материала, остающегося после удаления околонекротической ткани всех некрозов с помощью пробойника с 353 максимальным диаметром, отбирали пробы межнекротической ткани. Эктракты ткани получали, как было описано в предыдущем разделе за исключением того, что в некоторых экспериментах в схему получения мембранносвязанных фракций была дополнительно включена экстракция 0,1% тритоном Х-100 (фракция 0.1Т). Активность пероксидазы определяли в реакции с аминосалициловой кислотой (1 мг/мл, 0,01М фосфатный буфер, конечная рН 6,0) и 0,005% перекисью водорода в ячейках 96-луночного планшета. Измеряли D492 с использованием планшетного фотометра Multiscan (Flow Lab., Великобритания) в течение 2–3 мин после инициации реакции с интервалом 20–25 с. Для расчета активности фермента использовали прямолинейный участок кинетической кривой. Количество белка определяли по модифицированному методу Bradford (Read, Northcote, 1981), лигнин – с тиогликолевой кислотой (Doster, Bostock, 1988). Представленные в табл. 4.8 данные свидетельствуют о существовании закономерного распределения активности лектинов в зависимости от расстояния до центра некроза. Во фракции слабосвязанных мембранных белков, элюируемых 0,05% раствором детергента, максимальную активность фитогемагглютининов наблюдали в тканях, расположенных на расстоянии 5 мм от центра некроза. С увеличением этого расстояния количество гемагглютининов падало. Наилучшим образом эта закономерность проявилась на профиле активности, полученном через 2-е сут после инфицирования. В тканях, исследованных через 4 сут после инфицирования, заметно сильное падение активности в околонекротической зоне с минимумом активности в кольце ткани с диаметром 15 мм (достоверное снижение активности в 5 раз по сравнению с межнекротическими тканями). Максимум активности в зоне 5 мм заметен только по сравнению с соседними тканями. Положение максимума активности лектинов, вероятно, определялось метаболически активными тканями непосредственно у границы отмирания ткани. При этом проба 2 мм включала также и отмершие ткани собственно некроза. В опыте, в котором измерения проводили через 4 сут после инфицирования, доля некротизированной ткани была больше соответственно увеличению диаметра некроза (примерно с 1 мм до 1,5 мм), что и проявилось в меньшей активности лектинов в центральной зоне, включающей некроз и близлежащие к нему ткани. Напротив, снижение активности через 4 сут в более удаленных тканях (9 и 15 мм), по-видимому, отражает действительно существующие физиологические закономерности.
Труднее интерпретировать изменения во времени в профиле активности лектинов, элюируемых 0,5% тритоном Х-100 (табл. 4.8). Максимум активности в прилегающих к некрозу тканях (5 и 9 мм) у белков этой фракции заметен только через 4 сут после инфицирования. Наоборот, на начальном этапе в этой зоне наблюдали достоверное снижение активности. Ткани с пониженной активностью окружены зонами с повышенной активностью в центре некроза (2 мм, тенденция) и на расстоянии 15 мм (достоверное повышение по сравнению с межнекротической областью). Такой профиль активности лектинов данной фракции и динамика их изменения позволяет предположить, что снижение фитогемагглютинации в зоне 5–9 мм на 2-е сут после инфицирования может быть связано не с реальным снижением количества лектинов, а с синтезом на ранних этапах некрозообразования ингибиторов гемагглютинации. Ранее такие вещества были обнаружены в корнеплоде сахарной свеклы (Алексидзе и др., 1983).
