Введение к работе
Актуальность проблемы. Анализ механизмов рецепции и трансдукции гормональных сигналов является важным и актуальным аспектом исследований гормональной регуляции высших организмов, в том числе растений. Одними из основных фитогормонов являются цитокинины, регуляторы метаболизма и деления клеток, а также роста, морфогенеза и старения растения. Для этого класса фитогормонов недавно обнаружены мембранные рецепторы, гены первичного ответа и основные элементы сигнальной трансдукции (Kakimoto, 2003). Однако молекулярные механизмы действия цитокининов еще во многом не изучены и продолжают активно исследоваться.
Остаются неясными, в частности, пути взаимодействия сигнала цитокининов с другими известными сигнальными системами. В последнее время в литературе появились сведения о влиянии ряда веществ (микро- и макромолекул) на эффекты, вызываемые фитогормонами (в том числе цитокининами) и о возможном участии этих веществ в трансдукции гормональных сигналов. Для цитокининов такими веществами могут являться фосфолипаза Д (ФлД) и образуемые ей фосфатидные кислоты (Romanov et al., 2002), полиамины (Feray A. et al., 1992) и малые сигнальные молекулы, содержащие кислород, в частности, NO (Scherer & Hoik, 2000; Tun et al., 2001). При этом остаются не выясненными вопросы, на каком биохимическом уровне реализуется их взаимодействие с цитокининами и каким способом эти вещества влияют на молекулярный механизм действия данных фитогормонов.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование неизученных аспектов молекулярного механизма действия цитокининов и взаимодействия этих фитогормонов с другими сигнальными системами, с привлечением новых трансгенных моделей.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: - подбор и освоение модельных систем, позволяющих количественно оценивать эффект цитокининов на экспрессию индивидуальных генов первичного ответа;
сравнение действия разных форм цитокининов, включая стереоизомеры зеатина, на отработанных модельных системах;
- оценка возможности участия фосфолипазы Д и окиси азота N0 в
процессе трансдукции цитокининового сигнала;
- изучение влияния различных полиаминов на ранние эффекты
цитокининов и раскрытие молекулярных основ этого влияния.
Научная новизна работы. Полученные данные позволили прояснить
вопросы взаимодействия цитокининовои регуляторной системы с другими
регуляторными системами (с участием N0, фосфолипазы Д) и молекулами
(полиамины) у растений. В частности, подтверждена возможность участия
фосфолипаз Д, за исключением семейства ФлД типа а, в трансдукции
цитокининового сигнала. Установлено отсутствие у окиси азота N0 роли
сигнального посредника действия цитокинина. Показано
посттранскрипционное ингибирующее действие полиаминов на цитокинин-зависимую индукцию генной экспрессии. Установлены количественные характеристики способности широкого спектра веществ цитокининового ряда индуцировать экспрессию генов первичного ответа. Обнаружены различия лигандной специфичности у близких по структуре рецепторов цитокининов АНКЗ и AHK4/CRE1. Подтверждено наличие собственного цитокининового действия у цис-зеатина и синтетических цитокининов -производных фенилмочевины (тидиазурона).
Практическое значение работы. Полученные результаты имеют как чисто фундаментальный характер, так и возможность практического применения. Данные фундаментального характера о молекулярном механизме действия цитокининов могут быть использованы для подготовки лекционного материала при чтении курса физиологии и биохимии растений в высших учебных учреждениях, а также послужить базой для дальнейших исследований в данном направлении. Адаптированные модельные системы на основе трансгенного арабидопсиса и трансформированной E.coli могут быть с успехом использованы для анализа действия широкого спектра веществ на трансдукцию цитокининового сигнала на молекулярном уровне, а также для скрининга новьж соединений с цитокининовои или
антицитокининовой активностью. Использованная в работе модельная система на основе трансформированной E.coli является готовым инструментом для изучения особенностей функционирования и свойств отдельных цитокининовых рецепторов.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на NATO-Russia Workshop «Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино-на-Оке, 2003), 7-ой конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино-на-Оке, 2003), V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), рабочих совещаниях INTAS по теме «Role of Phospholipases in the Mechanism of Cytokinin Action» (Санкт-Петербург, 2003; Киев, 2004), Международном симпозиуме «Cell Biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants» (Ялта, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ (одна в печати), включая 6 статей в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждений, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 142 страницах машинописного текста, содержат 2 таблицы и 30 рисунков. Библиография состоит из 203 источников, из которых зарубежной литературы-165.
