Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1.1. Использование различных углеводов для роста культур изолированных тканей и клеток разных растений (гексозы, олигосахариды, пентозы, многоатомные спирты, полисахариды) 9
1.2. Вовлечение сахарозы в метаболизм в культуре тканей и клеток растений 27
1.2.1. Инвертаза в культуре тканей растений 29
1.2.2. Сахарозосинтетаза в культуре тканей растений 32
1.3. Метаболизм лактозы 36
1.3.1. ft -галактозидаза высших растений 37
1.3.2. 5-галактозидаза культивируемых клеток растений 39
1.4. Метаболизм галактозы 43
1.4.1. Метаболизм галактозы в растениях и культурах тканей растений 45
1.5. Штаммовые различия культур тканей и клеток растений 48
Глава 2. Объекты и методы исследования 55
2.1. Определение содержания Сахаров 55
2.2. Определение активности инвертазы 57
2.3. Определение активности сахарозосинтетазы 57
2.4. Определение активности В -галактозидазы 59
2.5. Определение активности ферментов обмена галактозы 59
2.6. Изучение поглощения меченых Сахаров 62
Глава 3. Исследование эффжтивности компонентов питательной среды для роста штаммов культуры тканей сахарной свеклы 63
3.1. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента 63
3.2. Использование углеводов разными штаммами культуры тканей сахарной свеклы 74
3.2.1. Действие различных концентраций Сахаров на рост культур сахарной свеклы 82
Глава 4. Штаммовые различия культуры тканей сахарной свеклы .. 85
4.1. Содержание Сахаров и активность инвертазы в корне и семядолях проростка сахарной свеклы 87
4.2. Содержание Сахаров в тканях семядольного и корневого штаммов сахарной свеклы 87
4.3. Активность инвертазы культур ткани сахарной свеклы 95
4.4. Активность сахарозосинтетазы культур ткани сахарной свеклы 98
4.5. Изучение поглощения С-сахарозы^штаммами семядольного и корневого происхождения 100
4.6. Обсуждение главы 4 104
Глава 5. Использование лактозы штаммами семядольного и корневого происхождения 113
5.1. Рост штаммов семядольного и корневого происхождения на средах с лактозой и галактозой 113
5.2. Закономерности накопления биомассы и Сахаров семядольным и корневым штаммами на средах с различным содержанием глюкозы и галактозы 115
5.3. Содержание Сахаров в тканях штаммов сахарной свеклы при выращивании на среде с лактозой 121
5.4. Активность В -галактозидазы в тканях семядольного и корневого штаммов 124
5.5. Изучение активности ферментов обмена галактозы 128
5.6. Обсуждение главы 5 129
Заключение 138
Выводы 143
Литература
- Вовлечение сахарозы в метаболизм в культуре тканей и клеток растений
- Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента
- Содержание Сахаров в тканях семядольного и корневого штаммов сахарной свеклы
- Закономерности накопления биомассы и Сахаров семядольным и корневым штаммами на средах с различным содержанием глюкозы и галактозы
Введение к работе
Культивируемые клетки и ткани высших растений широко используются как модельные объекты для изучения различных сторон метаболизма, роста и развития растений. Известны примеры эффективного применения культур для анализа строения и химического состава первичных клеточных стенок ( Aibersheim et ai., 1973), исследования отдельных сторон основного метаболизма (Курсанов и др., 1976; Дубинина и др., 1982) и метаболизма вторичных соединений ( zenk, 1978), выявления механизмов транспорта веществ через мембраны ( Komor et ai., 1981 ) закономерностей клеточной дифференцировки и роста (King, Street, 1977; Roberts et al., 198 . В физИОЛОГИЧеС ких работах культура клеток растений открывает новые перспективы для изучения вопросов морозо- и солеустойчивости (Туманов и др., 1977; Ошмарина и др., 1983), отложения веществ в запас (Холодова и др., 1982) и т.д. Возможность получения широкого спектра штаммов культур с различными метаболическими способами использования соединений позволяет решать задачи, часто трудно разрешимые на уровне целого растения ( Maretzki, Thom,1978). Преимущества клеточных культур перед целым растением заключаются также в большей контролируемости условий выращивания, в возможности получения оптимально больших масс однородных по морфофизиологическому состоянию клеток.
Наконец, и это следует подчеркнуть особо, культивируемые клетки высших растений, синтезирующие ценные для народного хозяйства вещества, являются одним из важнейших объектов биотехнологических производств.
Развитие же биотехнологии ставит нас перед необходимостью решать задачу получения максимального количества ткани с максимальным же уровнем синтеза нужного для практики полезного вещества. Это, в свою очередь, делает актуальным вопрос об особенностях роста, метаболизма и выращивания культивируемых клеток растений. В этой связи - из-за гетеротрофности культуры тканей и клеток растений по углероду - особое значение приходится придавать источникам углеводного питания. Очевидно, при промышленном выращивании культур была бы весьма экономически целесообразной замена сахарозы, используемой человеком в пищу, на продукты, являющиеся отходами сахароперерабатывающей и молочной промышленности.
Основная цель настоящей работы сводилась к сравнительному изучению роста и углеводного метаболизма разных по происхождению штаммов культуры тканей сахарной свеклы в разных - прежде всего по составу Сахаров - питательных средах.
Выращивая культуры тканей сахарной свеклы, полученные из семядолей и корня проростка, а также из корнеплодов сахарной свеклы, на средах с сахарозой, глюкозой, фруктозой, галактозой, мальтозой, раффинозой и др. (взятых в качестве единственных источников углерода) , изучая накопление биомассы, степень и форму метаболизации названных Сахаров и участвующие при этом ферменты (инвертазы, сахарозосинтетазы, галактозидазу, ферменты обмена галактозы), мы пытались обнаружить метаболические и ростовые эффекты, связанные как с происхождением штаммов, так и с составом сред выращивания. При этом мы полагали, что экспериментальные данные такого сравнительного подхода могут иметь не только теоретическое, но и практическое значение.
В главе I дается обзор существующей литературы по использованию различных Сахаров культивируемыми клетками около 40 видов растений; метаболизации основных Сахаров, исследуемых в работе - сахарозы, лактозы, галактозы; штаммовых различиях в отношении углеводного обмена в культуре клеток. В главе 2 дается описание использованных в работе методик. В трех последующих главах приводятся основные результаты экспериментальных исследований. В главе 3 посредством методов математического планирования эксперимента впервые получены количественные оценки эффективности компонентов питательной среды для роста и сахаронакопления выбранных нами штаммов культуры тканей сахарной свеклы. Это позволило существенно упростить и оптимизировать состав среды выращивания.
Глава 4 посвящена описанию и доказательствам значительных физиолого-биохимических различий друг от друга сахарной свеклы семядольного и корневого происхождения по всем основным параметрам метаболизации сахарозы.
Здесь впервые установлено, что семядольный штамм является штаммом типа сахароза расщепляется кислой, локализованной снаружи клеток; в клетках обнаруживается глюкоза и фруктоза и лишь в небольшом количестве сахароза, что объясняет более интенсивный рост этого штамма, особенно на ранних этапах культивирования.
Корневой же штамм оказался .штаммом сахарозного типа: сахароза поглощается клетками без предварительного гидролиза и, вероятно, далее с участием сахарозосинтетазы, расщепляясь внутри клеток на фруктозу, потребляемую на дыхание, и УДФглюкозу -высокоэнергетический субстрат, используемый для построения клеточных стенок (Павлинова, Туркина, 1978).
Последняя, 5 глава посвящена особенностям использования лактозы штаммами семядольного и корневого происхождения. В этой главе впервые показано, что семядольный штамм способен, а корневой - не способен использовать лактозу. Галактоза, добавленная к среде оказалась одинаково токсична для обоих штаммов. Выяснилось, что использование лактозы семядольным штаммом связано с отсутствием б активности, относительно низкой скоростью транспорта, внутриклеточной лактозы с участием нейтральной галактозидазу. Неспособность же корневого штамма использовать лактозу оказалась связанной с активностью внеклеточной кислой й , транспортом в клетку наряду с лактозой свободной галактозы, ее повышенной метаболизацией до УД Галактозы, которая не сопровождается достаточной активностью УД Глюкоза ключевого фермента, осуществляющего последний этап превращения галактозы в глюкозу.
Приведенные в диссертации материалы указывают на возможность получения широкого спектра штаммов, различающихся по тем или иным признакам обмена веществ, что позволяет использовать клеточные культуры растений как для биотехнологических целей, так и для изучения метаболизма клеток и растений.
Вовлечение сахарозы в метаболизм в культуре тканей и клеток растений
Сахароза является основной транспортной формой углеводов высших растений (Курсанов, 1976). Исключительная роль сахарозы в растении в значительной степени определяется особенностью структуры ее молекулы с защищенными реакционноспособными группами и наличием глюкозидо-фруктозидной связи, обладающей высокой отрицательной величиной свободной энергии гидролиза ( Pontis, 1977; Павлинова, Туркина, 1978; Akazawa, Okamato , 1980; Чижов, Отт, 1981,1982; Avigad, 1982). Являясь первым свободным продуктом фотосинтеза и основной транспортной формой интактных растений, сахароза служит главным источником углерода для метаболизма и синтеза клеточных структур гетеротрофных тканей растений. Именно поэтому, вероятно, сахароза является также наиболее эффективным сахаром для большинства культур тканей высших растений, что находит отражение в составе Наиболее ИСПОЛЬЗуемых питательных Сред (Murashide, Skoog, 1962; Бутенко, 1964; Hamborg, Eveleigh, 1968; Schenk, Hildebrandt, 1972; Ojima, Ohira, 1978).
Так же как и в растениях (Курсанов, 1976),молекула сахарозы может поглощаться клетками культуры как целиком, так и после предварительного гидролиза ее на моносахариды.
Существуют два основных пути расщепления сахарозы: I) гидролиз на глюкозу и фруктозу с помощью инвертазы (fi - D-фруктофурано-зид-фруктогидролаза, КФ 3.2.1.26), 2) расщепление на УДФ глюкозу и фруктозу в обратимой реакции, катализируемой сахарозосинтетазой (УДФ глюкоза: D - фруктоза - 2 -L- глюкозилтрансфераза, КФ 2.4. I.I3). В первом случае обе освобождаемые гексозы, прежде чем включиться в метаболизм, нуждаются в активации, что сопряжено с дополнительной затратой энергии АТФ (Павлинова, Туркина, 1978). Второй путь более экономичен в энергетическом отношении, поскольку энергия связи сахарозы не теряется, а сохраняется посредством УДФ глюкозы, глюкоза которой находится в активированном состоянии. Кроме того, легкая обратимость реакции, катализируемой сахарозо-синтетазой, открывает больше возможностей для регулирования превращений сахарозы (Курсанов, 1976). Теоретически возможно участие еще одного сахарозосинтезиррщего фермента - сахарозофосфатсинте-тазы (УДФ глюкоза: D -фруктозо-6-фосфат-2 сС-глюкозилтрансфераза, КФ 2.4.1.14), которая катализирует обратимую реакцию синтеза из УДФ глюкозы и фруктозо-6-фосфата сахарозо-6-фосфата, расщепляемого сахарозофосфатфосфатазой на сахарозу и неорганический фосфат. Однако, эти реакции, характерные для фотосинтезирующих тканей, сдвинуты в сторону синтеза сахарозы: константа равновесия этой реакции 3250, что обеспечивает практическую необратимость реакции (Delmer, Albersheim, 1970; Pollock, 1976, Pontis, 1977). Напротив, сахарозосинтетаза, катализирующая легко обратимую реакцию (beioir, Cardini, 1953 ),характерна для гетеротрофных тка-ней( Delmer, Albersheim, 1970 ), в частности для запасающего корня сахарной свеклы (Павлинова, Прасолова, 1972).
Из ферментов катаболизма сахарозы наибольшее внимание уделено изучению инвертазы, что нашло отражение в ряде обзоров -, (Giaszion, 1969 ї Курсанов, 1976; Павлинова, 1976). Активность инвертазы, изученная для большого числа видов растений, крайне варьирует, меняясь в зависимости от возраста, типа ткани, физиологического состояния, условий хранения и т.д. Высокая активность инвертазы характерна для молодых, быстрорастущих тканей растений, особенно корней (Энгель, Холодова, 1969; Павлинова, Прасолова, 1972; Хавкин, 1977). Посредством инвертазы, синтез молекул,которой и их активность легко индуцируется и репрессируется, может поставляться значительноеколичество гексоз, необходимых для метаболизма клеток ( Pressey, 1968 ; Курсанов и др. 1971).
Инвертазы найдены в культурах тканей кукурузы (straus, 1954; ЗеленОВЭ И др., 1979), МОрКОВИ (Edelman,Hanson, 1972 ), ЯБОра Obata -(Copping, Street, 1972 ), табака (Thorpe, Meier, 1973; Sasamoto Thorpe, 1983 ), ВЬЮНКа (Klis et al., 1974a), картофеля (Shaw at ai., 1976 ), сахарной свеклы (Ангелова и др., 1974; Курсанов и др., 1976; Mohammad, Collin, 1979 ) И др. АКТИВНОСТЬ ИНВертЭЗЫ культур тканей, как и тканей целых растений, очень изменчива, максимальные значения ее активности могут по-разному соотноситься с активностью в интактных растениях. Так, максиглальная активность вы-сокоинвертазного штамма моркови (Parr et ai., 1976 ) близка к ин-тактной и достигает 69 мкмол ічщюлизованной сахарозы на 1г сырой нассы в час. В то же время сравнение по активности инвертазы исходных частей корнеплода и каллусной ткани моркови показало 2-3 кратное превосходство последней ( Thorpe, Meier, 1973 ). Обнаружена также активация инвертазы при введении в культуру тканей из запасающего корня сахарной свеклы (Курсанов и др., 1976), картофеля ( shaw et ai., 1976). Однако для культур тканей сахарной свеклы стеблевого и листового происхождения показано заметное снижение активности инвертазы по сравнению с исходными тканями (Курсанов и др., 1976; Mohammad, Colin, 1979 ; Кудрявцева и др.,1982). Следует заметить, что сравнивать по величинам активности разные культуры затруднительно в виду отсутствия унификации в способах измерения и расчета.
Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента
Галактоза оказывала токсическое влияние на кончики корней кукурузы, в то же время была благоприятным субстратом для корней огурцов, относящихся к семейству Cucurbitасеае , для которых характерны сахара рафинозной группы. Галактоза удовлетворительно поглощалась обоими объектами со скоростью близкой к скорости поглощения глюкозы. Однако ее дальнейшие превращения, особенно в процессе дыхания, интенсивнее протекали в кончиках корней огурцов. Следует отметить, что после поглощения С-галактозы метка быстро появлялась в глюкозе, сахарозе, фруктозе в корнях кукурузы и огурцов, но только в тканях кукурузы накапливался галакто- -зо-І фосфат (Goring, Rekin, 19б8 ). Дальнейшая метаболизация га-лактозо-I фосфата до УДФ-галактозы у чувствительных к галактозе тканей идет с меньшей скоростью, однако оба эти соединения накапливаются в корнях кукурузы и колеоптилях ячменя пропорционально концентрации наружной галакТОЗЫ (Roberts et al., 1971 ). Эти метаболиты накапливаются в тканях в необычно больших количествах и, возможно, конкурентно ингибируют нормальный метаболизм углеводов. В цикле дальнейших превращений при использовании небольших концентраций галактозы УДФ-галактоза включается в гемицеллюлозную и пектиновую фракции клеточных стенок, как это отмечалось для КОрнеЙ кукурузы (Roberts, Butt, 1969 ), ОГурЦОВ (Goring, Rekin, 1968), колеоптилей овса (Ordin, Bonner, 1957 ). Однако наблю- далось лимитирование роста клеточных стенок по сравнению с инкубацией В ГЛЮКОЗе. По ДанНЫМ ЯПОНСКИХ Исследователей (Yamamoto, Masuda, 1984 ) галактозо-І фосфат конкурентно ингибирует синтез УДФглюкозы из глюкозо-І фосфата и УТФ в колеоптилях овса, т.е. га-лактоза действует через уменьшение уровня предшественников в синтезе клеточной стенки. Эпимеризация УДФгалактозы в УДФглюкозу при снабжении клеток галактозой происходит, вероятно, с низкой скоростью, поскольку во многих случаях отмечалось ингибирование синтеза целлюлозной фракции клеточных стенок. Галактоза уменьшала содержание ot -целлюлозы в клеточных стенках изолированных корней томатов faugnes, street, 1974), колеоптилей овса ( Ordin, Bonner, 1957 ), корней кукурузы и огурцов ( goring, rekin, 1968 ), причєм у послєдних знэчитель но слабее. Подытоживая, можно сказать, что у непереносящих галактозу растительных объектов она вызывает накопление галактозо-І фосфата и УДФ галактозы, подавление синтеза полисахаридов клеточных стенок и вследствие этого роста. Методы культуры клеток растений позволяют получать клеточные линии, характеризующиеся повышенным уровнем активности ключевых ферментов обмена галактозы. Такой эффективный подход к изучению механизма ингибирующего действия галактозы был использован в исследовании Марецкого и Том (1977), которым удалось выделить галактоз орезистентную линию культуры тканей сахарного тростника. Основным ее отличием от дикого штамма, неспособного расти на среде с галактозой, была в 10 раз более высокая активность УДФглюкозо-4-эпимеразы, что, по-видимому, обеспечивает быстрое вовлечение галактозы в метаболические превращения, препятствуя ее накоплению в ткани до токсических концентраций. Аналогичный подход применили в своем исследовании Капица и Евдонина (1981). Из культуры тканей табака были выделены две линии, растущие на среде с лактозой, которую они гидролизовали вне 48 клеточно, причем одна линия табака могла использовать галактозу для роста, а другая - нет. Растущая на галактозе линия выявила в 3 раза более высокую активность УДФГ-галактозо-I фосфатуридил- трансферазы, что, возможно, позволяет ей избегать неблагоприятного действия галактозы. В литературе имеются сведения о наличии альтернативных путей метаболизапии галактозы в клетках растений. Так, сообщалось о превращении 14С-галактозы в мезоинозит, глюкозу, фруктозу и компоненты оболочек клеток суспензии моркови, хорошо использующей галактозу для роста ( Verma, Dougaii, 1977b ). Однако, биохимические механизмы этого пути еще недостаточно ясны и требуют дальнейших исследований. Таким образом в культивируемых растительных тканях обнаружены следующие компоненты пути Лелуара: фосфорилирование галактозы галактокиназой, превращение галактозо-1 фосфата в УДФ-галактозу с помощью одной из двух трансфераз и эпимеризация УДФ галактозы в УДФглюкозу. В тканях, для которых галактоза является токсичной, наблюдается накопление галактозы и продуктов дальнейшей ее метаболизапии - галактозо-1 фосфата и УД-галактозы, аналогично -животным клеткам. Невозможность же использования галактозы тканями растений обусловлена отсутствием или пониженной активностью, главным образом, двух ферментов - УДФГ-галактозо-1-фосфатуридилтранс-феразы и УД#Глюкоза-4-эпимеразы; и следствием этого - ингибирова-ние синтеза компонентов клеточной стенки, т.е. роста.
Штаммом культуры изолированных клеток высшего растения называется ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации из сегментов (эксплантатов) органов растений после первого субкультивирования (street, 1973 ; Чайлахян и др., 1982). Как правило исходный эксплантат, который дает начало штамму каллусной ткани, гетерогенен по морфологическому, физиологическому и патогенетическому состоянию, и неизвестно, какие именно клетки,дедифференциру-ясь,дают начало культуре. Т.е. возникновение штамма с индивидуальными признаками носит вероятностный характер. В дальнейшем, после возникновения штамма происходит его становление, приводящее к формированию популяции клеток, приспособленных к росту в условиях in vitro . Этот период продолжается у разных культур неодинаково и приблизительно составляет 100-200 суток, в течение которых происходит 8-Ю циклов роста (Кунах, 1975). После чего наступает период относительной стабилизации штамма на определенном фи-зиолого-биохимическом и патогенетическом уровнях. Однако и в этот период сформированного штамма, наряду со стабилизацией у некоторых культур, в большинстве изученных объектов наблюдается изменчивость культивируемых клеток, характеризующаяся в патогенетическом отношении увеличением числа хромосом и хромосомных аберраций (Шамина, 1978; Bayiiss, 198О ; Фролова, 1981). Существенную роль при этом играют процессы клеточной селекции. Изменчивость растительного генома in vitro зависит от тканевого происхождения исходного эксплантата,состава питательной среды и других условий выращивания, однако, определяющим моментом является генетическая конституция вида (Фролова, 1984).
Содержание Сахаров в тканях семядольного и корневого штаммов сахарной свеклы
Основными объектами исследования служили пересадочные кал-лусные ткани, полученные в 1970г. из корня, гшгокотиля и семядолей 8-ми дневных стерильных проростков сахарной свеклы сорта Вер-хнячская 031 диплоидной линии (Бутенко, Атанасов, 1971 а и б). В отдельных опытах использовали проростки, росшие на водопроводной воде в течение восьми дней. Кроме того, использовали культуры из хранящихся корней ди- и триплоидных растений того же сорта, полученные Малюком с сотр. (1977).
Культуру ткани сахарной свеклы выращивали в темноте при температуре 26С и относительной влажности 70$. При постановке опытов кусочки исходных каллусов взвешивали по 300 мг в стерильных условиях и помещали в пробирки на агаризованную среду. В течение 1,5-2 месяцев опыта обычно проводили 4-6 фиксаций. Учитывали сырой и сухой вес ткани на культуру при 6-8 кратной повторности на вариант. Материал обрабатывали статистически.
При изучении влияния источника утлерода на рост и содержание Сахаров растворы углеводов стерилизовали фильтрованием через бактериальный фильтр G -5 и добавляли к предварительно автоклавиро-ванной среде в таком количестве, чтобы конечная концентрация составила 3$.
Для оценки содержания Сахаров при фиксации обычно использовали усредненную выборку из Ф-6 пробирок каждого варианта. Материал фиксировали 96$ кипящим этиловым спиртом и далее проводили трехкратную экстракцию 80$ этанолом, объединенный экстракт упари-вали (Туркина, Соколова, 1971). Сумму Сахаров измеряли игольным методом (Dubois et ai., 1956 ). Качественный состав Сахаров в ткани определяли методом газожидкостной хроматографии. Работу по газохроматографическому определению Сахаров проводили на хроматографе "Хром 31" (производство ЧССР) с пламенным ионизационным детектором. Использовали стеклянные хроматографические колонки,различающиеся полярностью применяемой жидкой фазы - I) колонку (180 х 0,3 см) с 2,5$ неполярного полидиметилсилоксана sE-30, 2) колонку (180 х 0,3см) с 1,7$ среднеполярного полиметилфенилси-локсана ov -17, 3) колонку (240 х 0,3см) с 2,1$ полярного силиконового каучука с нитрильными группами СКТН. В качестве твердого носителя применяли целит-545 зернением 52-60 меш. и 80-100 меш., причем целит предварительно отмывали от окислов железа концентрированной HCI, промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и высушивали при температуре П0-П5С в течение 10-12 часов. Разгонку проводили в режиме программирования температуры термостатированных колонок (начальная - 120-130С, через 6 минут-программированное повышение температуры со скоростью 3-6 град/мин). Температура испарителя равнялась 290С. Первоначальное давление газа-носителя - аргона - на входе в колонку составляло 1,2 атм. Пробы (1-4 мкл) в колонку вводили стеклянным микрошприцем на 10 мкл. Анализ Сахаров проводили в виде их триметилсилилышх (ТМС) производных, которые получали по методу Бробста (1975), обрабатывая экстракт Сахаров гексаметилдисилазаном (условия см. ниже). Качественный анализ проводили по известным образцам Сахаров на колонках различной полярности, а также методом добавок стандартов в анализируемые смеси. Для количественного анализа использовали метод внутренней стандартизации с L-рамнозой в качестве внутреннего стандарта.
Расчет содержания отдельных компонентов проводили по площади пиков с учетом индивидуальных поправочных коэффициентов, определенных в системе сахар - внутренний стандарт. Для количественного анализа внутренний стандарт (обычно 1-3 мг рамнозы) добавляли к экстракту, смесь упаривали досуха, затем растворяли в I мл пиридина и 0,2 мл трифторуксусной кислоты, и еилилировали 0,6 мл гек-саметилдисилазана. Смесь оставляли на 15-20 час, затем вводили в хроматограф. При таком способе для анализа достаточно 100-500 мг сырой массы ткани. 2 г свежей ткани растирали в ступке при +2С до гомогенной массы, добавляя экстрагирующую среду в соотношении 1:3. Экстрагирующая среда содержала бмг/мл пистеина в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 4,8. В опытах по изучению зависимости активности инвертазы от рН использовали 0,1 М фосфатно-цитратный буфер с рН от 4,0 до 8,0.
Гомогенат диализовали в целлофановом мешочке против дистиллированной вода в течение 20 час. при +2С, затем доводили дистиллятом до 10 мл и на каждое определение брали по 2 мл. В контрольных пробирках гомогенат кипятили 3 мин. на водяной бане. В опытные и контрольные пробирки добавляли субстрат (2,5$ раствор сахарозы в буфере) по 0,5 мл и по капле толуола и инкубировали при 30С в течение 1-3 часов. Реакцию останавливали кипячением, гомо генат доводили дистиллированной водой до 4 мл и фильтровали через бумажный фильтр. В фильтрате определяли количество образовавшейся глюкозы глюкозооксидазным методом (Эвальд, Геринг, 1970). Актива ность инвертазы выражали в мг или мкмоль гидролизованной сахарозы на I г сырого веса в час.
Определение активности проводили согласно методике Павлино-вой и Прасоловой, 1970. Ткань ( -V 20 г сырой массы) растирали в ступке при +2с с 0,05 М фосфатным буфером рН 7 (20 мл с добавлением 2 капель мер-каптоэтанола) в течение 20 мин. Затем центрифугировали 10 мин. при 8 тыс.об/мин. Супернатант сливали в колбу, осадок вторично экстрагировали 20 мин. на холоду. Супернатанты объединяли и центрифугировали при 14 тыс. об/мин. в течение 20 мин. Осадок отбрасывали. К раствору для осаждения фермента добавляли I М СН3С00Н, доводя рН до 5,0. После центрифугирования в течение 20 мин.- при 14 тыс. об/мин, супернатант отбрасывали, а осадок растворяли в 0,01 М фосфатном буфере (20 мл) с каплей меркаптоэтанола. К раствору добавляли сульфат аммония до 30$ насыщения. Через 15 мин.
Закономерности накопления биомассы и Сахаров семядольным и корневым штаммами на средах с различным содержанием глюкозы и галактозы
Каллусные ткани существенно отличаются от исходных тканей растений сахарной свеклы соотношением между сахарозой и моносахаридами (табл.10). В культуре семядольного происхождения это соотношение снижается более, чем в 10 раз по сравнению с исходными тканями семядолей (от 0,89 до 0,09-0,05), т.е. преобладание моносахаридов становится сильно выраженным. В начальный период цикла выращивания сахара более чем на 90$ представлены моносахаридами, затем во время активного роста происходит существенная трата моносахаридов. Содержание сахарозы, обнаруживаемой в следовых количествах в исходном эксплантате, увеличивается к 7 суткам др 1,2 мг/г сырой массы, в дальнейшем вновь уменьшается по мере роста ткани. Максимальное суммарное содержание Сахаров наблюдается на 3-й сутки и равно 17,2 мг/г сырой массы, причем сахара представлены на 66$ глюкозой, на 29$ фруктозой и только на 5$ сахарозой. В стационарной фазе лишь 3-4 мг/г сырой массы Сахаров остается в ткани, в основном в виде глюкозы (рис.21).
В каллусных тканях из корней проростка соотношение между сахарозой и моносахаридами не только не уменьшилось, как это наблюл дается в ткани семядольного происхождения, но, напротив, даже увеличилось в 10 раз по сравнению с корнями проростков (от 0,51 до 5,1). В течение первых двух недель роста концентрация сахарозы в 4-5 раз превышает сумму глюкозы и фруктозы, и только к концу 4-х недельного периода их соотношение снижается до 1,6 (табл.10). Максимальное содержание Сахаров в каллусах корневого штамма выше, чем у семядольного, и достигает 23 мг/г сырой массы, но тратится на рост с более высокой скоростью, чем моносахариды. Так, содержание моносахаридов за цикл роста уменьшается в 3 раза, тогда как сахарозы - более, чем в 10 раз (табл.10, рис.20). Если ткань корневого штамма выдерживать значительно дольше нормального ростового цикла, то при почти полном исчерпании Сахаров в тканях на 50-60 сутки (рис.20) обнаруживается появление неидентифицированных моносахаридов (рис.18), вероятно, являющихся продуктами автолиза клеток.
Имея ввиду такие существенные различия в соотношении сахарозы и моносахаридов двух штаммов сахарной свеклы, интересно было сопоставить их с активностью инвертазы. В рассмотренных экспериментах культуры росли на среде с сахарозой и поэтому существенные различия между штаммами могли объясняться разной активностью инвертазы в тканях.
Активность инвертазы культур ткани сахарной свеклы В первых же опытах по определению активности инвертазы (рН 4,7-4,8) было обнаружено, что активность фермента в ткани семядольного происхождения значительно выше, чем в тканій из корня проростка (табл.11). Первый опыт был проведен с использованием 1,25% сахарозы, однако полученные данные показали, что эта концентрация не является оптимальной, так как скорость расщепления сахарозы тканями семядольного штамма высока и за I час используется 84% внесенной сахарозы. Поэтому в дальнейшем концентрация сахарозы в реакционной среде была увеличена вдвое, а количество ткани уменьшено. Далее при определении активности инвертазы при разном времени инкубации (оп.№2, табл.11) было обнаружено пропорциональное увеличение количества гидролизованной сахарозы со временем инкубации как для семядольного, так и для корневого штамма. Для дальнейших определений активности инвертазы было выбрано время инкубации - I час при 30С. Дополнительные опыты (№ 4,5,6 табл.11) по определению активности инвертазы в ткани семядольного штамма при его выращивании на среде с лактозой выявили сходную по величине активность, что и в ткани на среде с сахарозой. Этот факт указывает на конститутивный синтез инвертазы в семядольном штамме.
Определение активности инвертазы в разных областях рН показало, что в ткани из семядолей значительная активность фермента наблюдается в диапазоне рН от 4,0 до 5,5 (рис.22) независимо от возраста культуры.
