Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 11
1. Вакуолярная мембрана и роль вакуоли в растительной клетке 11
1.1. Функции вакуоли в клетках высших растений 12
1.2. Тонопласт: особенности химического состава и физиологическая роль белков 16
2. Процессы транспорта в растениях 22
2.1. Механизмы мембранного транспорта на тонопласте 22
2.2. Транспорт сахарозы в растении 43
3. Протонные помпы тонопласта 56
3.1. Н+-АТФаза (ЕС 3.6.1.34) 56
3.2. Н+-пирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1.) 66
4. Регуляция активности протонных помп тонопласта 74
5. Аттракция и донорно-акцепторные отношения. Роль фитогормонов в их регуляции 88
6. Выводы из литературного обзора. Цели и задачи работы 103
III. Материалы и методы исследования 107
IV. Результаты и их обсуждение 129
1. Характеристика изолированных вакуолей и фракции изолированных мембран, использованных в экспериментах 129
2. Участие белков переменной аффинности в переносе сахарозы через тонопласт 140
3. Динамика гидролитической активности протонных помп тонопласта и накопление сахарозы в онтогенезе столовой свёклы... 145
4. Изучение изменения физиологической активности протонных помп тонопласта 156
4.1. Изучение изменения физиологической активности протонных помп тонопласта методом протеолиза 156
4.2. Изучение изменения физиологической активности протонных помп тонопласта методом редокс-регуляции 158
4.3. Роль фитогормонов в изменении гидролитической и транспортной активностей протонных помп тонопласта в онтогенезе 163
4.3.1. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы в начале первого года вегетации ...164
4.3.2. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+--пирофосфатазьі в начале первого года вегетации 169
4.3.3. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы в конце первого года вегетации 173
4.3.4. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы тонопласта в конце первого года вегетации 175
4.3.5. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность КҐ-АТФазьі в период покоя 177
4.3.6.Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы в период покоя 180
4.3.7. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н4"-АТФазы на втором году вегетации 184
4.3.8. Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-пирофосфатазы на втором году вегетации... 186
4.4. Взаимодействие ионного и гормонального влияния на изменение гидролитической активности протонных помп тонопласта 191
4.4.1. Влияние ионного состава среды инкубации на гидролитическую активность протонных помп тонопласта в разных буферных системах 192
4.4.2. Изучение гормонального влияния в среде без основных регуляторных ионов (Mg и К ) 197
4.4.3. Изучение гормонального влияния в среде с ионами магния (Mg+2) 200
4.4.4. Изучение гормонального влияния в среде с ионами калия (К+) 203
4.4.5.Изучение гормонального влияния в среде с ионами магния и калия (Mg иК ) 206
4.5. Влияние фитогормонов на транспортную активность протонных помп тонопласта 210
4.6. Сопоставление влияния фитогормонов на гидролитическую и на транспортную активности протонных помп тонопласта 214
5. Роль фитогормонов в сахаронакоплении 215
5.1. Влияние ИУК на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли 217
5.2. Влияние АБК на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли 219
5.3. Влияние кинетина на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли 222
5.4. Влияние ГК на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли 223
5.5. Влияние ЭБ на поступление меченой сахарозы в изолированные вакуоли 225
6. Гормональный статус корнеплода в онтогенезе и его связь с физиологической активностью протонных помп тонопласта и сахаронакоплением 228
6.1. Изменение количества ИУК в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза 228
6.2. Изменение количества АБК в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза 231
6.3. Изменение количества цитокининов в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза 233
6.4. Изменение количества гиббереллиноподобных веществ (ГПВ) в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах
онтогенеза 234
6.5. Соотношение фитогормонов в корнеплоде столовой свёклы на разных этапах онтогенеза 239
7. Влияние фитогормонов на изменение массы и содержание Сахаров в корнеплодах столовой свёклы в полевых экспериментах 244
Заключение 251
Выводы 258
Литература 261
- Тонопласт: особенности химического состава и физиологическая роль белков
- Аттракция и донорно-акцепторные отношения. Роль фитогормонов в их регуляции
- Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы в начале первого года вегетации
- Изменение количества ИУК в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза
Введение к работе
Современный этап развития биологии характеризуется исследованиями в ряде приоритетных научных направлений, одним из которых является изучение механизмов мембранного транспорта. Менее всего в настоящее время изучены эти механизмы применительно к специфичной для растений мембране - вакуолярной.
Наличие вакуоли является отличительной особенностью растительной клетки. Её роль в жизнедеятельности растений достаточно велика. В настоящее время показано, что это полифункциональный компартмент, который занимает особое место в структурной и функциональной организации растительного организма. Трудно переоценить роль вакуоли в регуляции клеточного объёма, тургора, а также рН и ионного гомеостаза цитозоля, что обеспечивает работу ферментов цитоплазмы, в изоляции вторичных продуктов метаболизма и метаболических ядов, в трансдукции сигналов различной природы, в процессах апоптоза, в ответных защитных реакциях растения на стрессовое воздействие и т.д. (Андреев, 2001). Одна из важнейших функций вакуоли состоит в запасании метаболитов (Курсанов, 1976).
В выполнении указанных функций ключевая роль принадлежит уникальной клеточной мембране - тонопласту. На сегодня известно, что вакуолярная мембрана содержит ряд специализированных систем пассивного и активного переноса веществ: каналы, переносчики, протонные помпы. Основной вклад в транспорт на тонопласте вносят две протонные помпы: РҐ-АТФаза (ЕС 3.6.1.34) и ЬҐ-пирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1.)(Rea, Sanders, 1987). Оба фермента способны преобразовывать освобождённую при гидролизе АТФ и неорганического пирофосфата энергию в перенос протонов через тонопласт. Генерируемая разность электрохимического потенциала расходуется на вторичный транспорт ионов, Сахаров, аминокислот, который осуществляется через каналы и переносчики. Таким образом, ЬҐ-АТФаза и ЬҐ-пирофосфтаза являются ключевыми ферментами в системе переноса углеводов и других соединений в антипорте с протоном (Briskin et al., 1985; Саляев, Катков, 1988). В связи с этим протонные насосы тонопласта привлекают постоянное внимание исследователей и интенсивно изучаются. Однако процессы регуляции активности этих ключевых ферментов изучены слабо и представляют особый интерес с точки зрения возможности управления транспортом метаболитов.
Основным метаболитом, запасаемым в растении (в отличие от глюкозы в животной клетке), является сахароза. Процессы синтеза и транспортировки сахарозы по растению в настоящее время изучаются. Но каким бы способом ни транспортировалась сахароза (по симпласту или по апопласту), конечный этап дальнего транспорта - вакуолярная мембрана, которая содержит переносчик сахарозы и протонные помпы, обеспечивающие процесс транспорта. Путь к тонопласту идёт по донорно-акцепторным градиентам, а скорость закачивания сахарозы в вакуоль, которая зависит от активности протонных помп тонопласта, может являться в этом процессе одним из определяющих звеньев, регуляция которого будет определять процесс аттракции.
Аттракция - давно известное в физиологии растений понятие, значимость изучения которого в последнее время существенно возросла, поскольку большая часть исследователей склоняется к мнению о ведущей роли аттракции в продуктивности (Ламан, Прохоров, 1999). Процессы онтогенеза обеспечивают постоянное существование в растении аттрагирующих центров, т.е. структурных зон с большим фондом активных генов, возникающих в ходе реализации генетической программы развития. В аттрагирующих центрах происходят либо интенсивная репликация генетического материала и новообразование структур, либо интенсивный однонаправленный синтез и накопление запасных веществ. В том и другом случаях состояние аттрагирующих центров и их метаболическая активность определяют потребность в ассимилятах, величину "запроса на фотосинтез", скорость и направление транспорта ассимилятов (Мокроносов, 1981).
Развитие корнеплодов свёклы тесно связано с процессами сахаронакопления. Конечным этапом дальнего транспорта сахарозы в период сахаронакопления является переносчик сахарозы на тонопласте в корнеплоде. Его аффинность и активность протонных помп тонопласта будут отвечать за процесс сахаронакопления. Поэтому нами была предпринята работа по изучению функциональной активности протонных помп тонопласта и процессов сахаронакопления, которые они определяют. Вначале нами были использованы подходы, которые оказались плодотворными при изучении других мембран растений, в частности плазматической, но в дальнейшем был сделан акцент на изучение гормонального влияния на протонные помпы тонопласта и процесс сахаронакопления. Прежде всего, это было сделано потому, что имеются данные, показывающие, что аттрагирующая способность акцепторов ассимилятов находится под гормональным контролем, т.е. фитогормоны обладают аттрагирующем действием и претендуют на одну из ведущих ролей в процессе аттракции (Кузьмина, 1997; Роньжина, 1999).
Гормональная регуляция активности протонных помп тонопласта и сахаронакопления была нами изучена на изолированных вакуолях на всех этапах онтогенеза, а также на целом растении в полевых экспериментах, что дало возможность сделать ряд интересных выводов. Сопоставление регуляции активности протонных помп тонопласта с регуляцией сахаронакопления позволило выдвинуть гипотезу об одном из вероятных механизмов аттракции, который состоит в стимуляции протонных помп тонопласта - конечном этапе дальнего транспорта запасаемого метаболита.
При этом все вещества и способы, содействующие увеличению активности протонных помп тонопласта, могут претендовать на роль аттрагенов.
Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).
Автор выражает благодарность научному консультанту советнику РАН, члену-корреспонденту РАН Р.К.Саляеву за внимание и ценные замечания, к.б.н., с.н.с. Е.В.Прадедовой и всем сотрудникам лаборатории за помощь в работе и поддержку, а также сотрудникам группы физических методов исследования, обеспечившим проведения ряда экспериментов.
Список часто применяемых в работе сокращений: АТФ - аденозинтрифосфат ПФн - неорганический пирофосфат НҐ-АТФаза - НҐ- аденозинтрифосфатаза Н+-ПФаза - Н+-пирофосфатаза ЭБ - эпибрассинолид ИУК - индолил-3 -уксусная кислота ГК - гибберелловая кислота ГПВ - гиббереллиноподобные вещества АБК - абсцизовая кислота Кинетин - 6-фурфуриламинопурин ДДС - додецилсульфат натрия ПХМБ - парахлормеркурийбензоат БАП - бензиламинопурин Положения, выдвигаемые на защиту:
Основная часть процессов активного транспорта сахарозы на тонопласте (более 90%) осуществляется с участием протонных помп.
Протонные помпы тонопласта отвечают за поступление сахарозы в вакуолях (корнеплод), а изменение их активности связано с изменением сахаронакопления.
Регуляция протонных помп тонопласта осуществляется разными путями: изменением редокс-условий, ионного окружения, протеолизом, фитогормонами. Почти всегда, когда активируется одна протонная помпа, вторая либо не меняет своей активности, либо ингибируется.
4. Фитогормоны способны изменять активность протонных помп тонопласта и сахаронакопления. Этот процесс существенно зависит от онтогенеза и на всех фазах развития растения обеспечен фитогормонами в необходимых соотношениях.
Тонопласт: особенности химического состава и физиологическая роль белков
Изолированная вакуолярная мембрана обладает типичным трёхслойным строением при толщине 9,5-10 нм, присущим для пограничных мембран in suti (Саляев, Чернышов, 1975), и характеризуется достаточно сложной надмолекулярной структурой (Moore, Mollenhauer, 1976). При этом тонопласт имеет чёткую асимметрию, которая выражается в различной электронной плотности периферических слоев мембраны на поперечных срезах и в неодинаковой концентрации внутримембранных глобулярных частиц на вакуолярных и цитоплазматических сколах. Коэффициент распределения глобулярных частиц между вакуолярной и цитоплазматической сторонами составлял 725/1006 = 0.361 (Саляев и др., 1983а). Известно, что высокая насыщенность глобулярными частицами (до 1000 - 3500 частиц на 1мкм2) характерна для мембран, проявляющих особенно высокую функциональную активность (Branton, Deamer, 1972). Внутримембранные глобулы, как правило, представляют собой глобулы трансмембранных (интегральных) белков (Shotton, 1978), которые могут являться ферментами, ионными каналами и переносчиками. Суммарная площадь, занятая частицами на продольных сколах, составляла около 23,5% от общей площади поверхности тонопласта, а объём, занимаемый глобулярными частицами, составлял около 22% от объёма мембраны (Саляев и др., 1983а). Это удовлетворительно коррелирует с результатами прямых биохимических анализов тонопласта, согласно которым во фракции вакуолярных мембран, тщательно очищенных от периферических белков, около 20% приходится на долю интегральных белков, извлекаемых из мембран только с помощью детергентов (Саляев и др., 1982). Белок / липидное соотношение в тонопласте столовой свёклы составляло 0,69. 6-8% белков тонопласта были отнесены к периферическим, остальные 92% -к интегральным, пронизывающим мембранный матрикс. При электрофоретическом разделении в ПААГ с ДС в спектре белков тонопласта выявлялось около 20 полипетидов, большинство из которых имели молекулярные массы менее 70 кД. Спектр белков тонопласта, солюбилизированных Тритоном Х-100, состоял из 15 белковых полос, 8 из которых были гликопротеинами (Salyaev, 1984). Такие биохимические характеристики, как белок/липидное соотношение, количественный и качественный спектр белков изменялись при использовании других объектов для получения вакуолярных мембран. Так, например, во фракции тонопласта, выделенной из корнеплодов столовой свёклы (Саляев и др., 1982) и из лепестков амариллиса (Wagner, 1981) обнаружены лишь следы углеводов, тогда как в тонопласте, выделенном из дрожжей, на 100 мг белка приходилось 79 мг углеводов (Kramer, 1978). Но все исследователи, независимо от объекта исследования, отмечают высокую текучесть и эластичность вакуолярной мембраны, которая обусловлена большим содержанием липидов, составляющих до 80% от её общего веса. В химическом составе липидов тонопласта преобладают полярные липиды глицерофосфатиды, среди которых до 68% составляют фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. В значительных количествах отмечено присутствие фосфатидной кислоты (14,6%) и фосфатидилинозита (12%). Среди гликолипидов обнаружены моно- и дигалактозилдиглицериды (и стерилгликозиды) (Макаренко и др., 1992). В тонопласте найдено высокое содержание свободных стиролов (Haschke et al., 1990). Среди жирных кислот вакуолярных липидов преобладают ненасыщенные жирные кислоты. Они составляют 68,5% у корнеплодов столовой свёклы и 77,8% у турнепса. Чаще всего встречается линоленовая кислота. Она составляет у моркови 54,2%о от всех липидов тонопласта, а у столовой свёклы 44,2%. Пальмитиновая кислота составляет 28,3%, а олеиновая 21,5% (Makarenko et.al., 2000). Методами инфракрасной спектроскопии изучена структура вакуолярной мембраны. Было показано, что тонопласт характеризуется высокой упорядоченностью липидов, присутствующих в мембране в виде участков свободного жидкого липидного бислоя. Преобладание в структурной организации тонопласта полярных липидов с высоким содержанием ненасыщенных жирнокислотных остатков придаёт мембране высокую эластичность и текучесть. Присутствие в составе липидов ct-токоферолов ингибирует перекисное окисление липидов (Макаренко, Саляев, 1998).
С помощью методов ИК-спектроскопии проводилось изучение вторичной структуры интегральных белков тонопласта, которое показало, что содержание ос-спиралей в нативных препаратах мембран составляло до 53%, уменьшаясь до 8% после экстракции липидов. При этом содержание неупорядоченных конформаций резко увеличилось с 11%о до 58%о. В структуре белков нативных мембран было выделено до 12% поворотов цепей и до 24% участков параллельной и антипараллельной Р-складчатой структуры, содержание которых практически не изменялось при удалении липидов (Макаренко, Саляев, 1998). Большинство мембранных белков тонопласта являются интегральными. Невысокое содержание периферических белков предполагает отсутствие прочных примембранных слоев, что подтверждается высокой эластичностью и текучестью тонопласта. Преобладание интегральных белков обусловливает большое количество гидрофобных аминокислот, обнаруженное во фракции белков тонопласта (Саляев и др. 1983в). Высокие показатели гидрофобности тонопластных белков указывают на значительную глубину их проникновения в мембрану, что хорошо коррелирует с большим количеством внутримембранных частиц, выявляемых в тонопласте методом криофрактографии (Саляев и др. 1983а). Значительное присутствие кислых и основных аминокислот во фракции интегральных белков вакуолярной мембраны свидетельствует о способности этих белков к ионным взаимодействиям, которые играют важную роль в поддержании трансмембранной ориентации белковых молекул.
Аттракция и донорно-акцепторные отношения. Роль фитогормонов в их регуляции
Аттракция (от латинского слова attractio, т.е. «притяжение») -важнейшее свойство растений активно притягивать метаболиты к центрам ростовых процессов, в том числе к растущим семенам, плодам, корнеплодам. Значение этой способности растений настолько велико, что в последнее время многие исследователи склоняются к мнению о том, что именно аттракция определяет такой важный показатель для растений как продуктивность (Ламан, Прохоров 1999).
Продукционный процесс у растений определяется, с одной стороны, интенсивностью фотосинтеза, а с другой - использованием ассимилятов в акцепторных органах (Мокроносов, 1981). В качестве связующего звена между образованием и использованием продуктов фотосинтеза в процессах роста, дыхания и образования запасных веществ выступает транспорт ассимилятов. Именно специалисты по изучению транспорта веществ в растении одними из первых сформулировали проблему донорно-акцепторных отношений (Geiger, 1976; Курсанов, 1976). На сегодняшний день эта проблема вышла на первый план, вокруг неё фокусируется внимание физиологов, работающих в области онтогенеза и его регуляции (Полевой, 1986; Чиков 1987 и др.).
Имеются три категории фактов, на которых базируется концепция донорно-акцепторных отношений (Мокроносов, 1983): 1. Подавление активности или удаление аттрагирующих центров вызывает угнетение фотосинтеза вследствии сокращения "запроса" на ассимиляты и "перекорма" листа. Наоборот, увеличение "запроса" при усилении активности атттрагирующих зон ведёт к интенсификации фотосинтеза. Во многих работах (Hall, 1977, Herold, 1980) показано торможение фотосинтеза при удалении или нарушении функций апикальных меристем, цветков или соцветий, плодов, клубней, при нарушении флоэмного транспорта из листа и т.д. В других работах (Thorne, Koller, 1974) наоборот, отмечено усиление фотосинтеза при появлении новых генеративных органов, плодов, клубней, при усилении аттрагирующей активности тканей после гормональных апликаций и т.д. , 2. Нарушение сбалансированных донорно-акцепторных отношений при удалении или затемнении части листовой площади вызывает усиление фотосинтеза в уцелевших листьях (Wareing et al., 1968). Этим обеспечивается полная или частичная компенсация фотосинтетической деятельности утраченных листьев. 3. Существует положительная корреляция между интенсивностью фотосинтеза и относительной скоростью роста (Федосеева, Багаутдинова, 1977). Исходя из вышеизложенного можно заключить, что интенсивность фотосинтеза регулируется прежде всего совокупной активностью аттрагирующих систем целого растения при условии, что внешние факторы (С02, свет и др.) не являются лимитирующими. При хорошо сбалансированных донорно-акцепторных отношениях между фотосинтезом и ростом энергетическая потребность в ассимилятах обеспечивается при скоростях фотосинтеза значительно более низких, чем потенциальная активность фотосинтезирующей системы. Нарушение нормальных донорно-акцепторных отношений в онтогенезе восстанавливается сначала компенсирующей интенсификацией фотосинтеза, а затем формированием добавочной листовой поверхности.
Постоянная корректировка системы донорно-акцепторных отношений в онтогенезе является самой значительной регуляторной функцией целого растения. Связи в донорно-акцепторной системе не являются жёсткими, они демпфированы возможностью депонировать ассимиляты в промежуточных фондах. Можно проследить депонирование «избыточных» ассимилятов в структурах разных уровней: 1) накопление ассимилятов, преимущественно в форме крахмала, в строме хлоропласта, 2) накопление ассимилятов в пространстве периферического эндопластидного ретикулума, 3) депонирование ассимилятов в свободном пространстве клетки или метаболически относительно малоактивных компартментах (вакуоль), 4) накопление ассимилятов в паренхимных тканях черешка и стебля (Мокроносов, 1983).
Организация донорно-акцепторных отношений постоянно меняется в онтогенезе растения. Даже формирование отдельного листа проходит через последовательные фазы перехода от донорной функции к акцепторной. Особенно разнообразны донорно-акцепторные системы у растений, отличающихся по морфологии и программе развития, по типу плодов и т.д.
А.Т.Мокроносов, уделявший большое внимание разработке системы донорно-акцепторных отношений, в своих работах (1982, 1988) выделяет ряд типов донорно-акцепторных отношений в основном по признаку пространственно-временной организации: 1. Системы «акцептор-донор» настолько близки, что ассимиляты передаются сразу и непосредственно акцептору. Этот тип объединяет растения с розеткой листьев (редис, свёкла и т.п.). 2. Система «акцептор-донор» образована несколькими относительно автономными подсистемами. Такой тип характерен для многих растений с метамернои структурой, где каждому ярусу листьев соответствует плод (соплодие), ориентирующий на себя основной поток ассимилятов. Этот тип донорно-акцепторных связей присущ многим растениям из семейства бобовых, тыквенных, губоцветных. Такие же локальные системы характерны для хлопчатника. 3. В системе «акцептор-донор» имеется единая мощная аттрагирующая зона: колос у злака, клубни у картофеля, корзинка у подсолнечника и т.д. Листья разных ярусов последовательно включаются в обеспечение акцептора. При этом возможны разные варианты: а) ассимиляты транспортируются прямо в аттрагирующий орган, например, у растений баклажана или перца; б) между основным акцептором и листьями существует промежуточный акцептор, в котором ассимиляты временно депонируются, т.е. донорно-акцепторная связь разделяется более или менее значительным интервалом времени. Например, у топинамбура в первой половине вегетации происходит интенсивный рост стебля. Активный фотосинтез обеспечивает запасание в стебле до 65-70% общего органического вещества. Во второй половине вегетации фотосинтез затухает, при этом основная масса клубней формируется за счёт ассимилятов, ранее накопленных в стебле. Реассимиляция органических веществ из стеблей или других промежуточных акцепторов составляет значительный вклад в формирование урожая зерна у злаков и клубней у картофеля.
Влияние фитогормонов на гидролитическую активность Н+-АТФазы в начале первого года вегетации
Обнаружена положительная корреляция между уровнем ИУК в разных частях колоса пшеницы с накоплением в них сухого вещества (Baugerh et al., 1985). Тесная зависимость между повышением содержания АБК и процессами накопления веществ была обнаружена в семенах сои (Schussler et al., 1984). Наиболее значительное увеличение цитокининовой активности наблюдалось в молодых клубнях (Koda, 1982; Jameson etal., 1985), а затем, по данным разных авторов, содержание цитокининов либо постепенно увеличивалось, по мере дальнейшего увеличения размера клубней и общего содержания крахмала (Jameson et al., 1985), либо оставалось долгое время на высоком уровне, снижаясь к моменту созревания клубней (Koda, 1982). Проводилось изучение градиента содержания свободных фитогормонов в связи с клубнеобразованием (Пузина, Кириллова, 1996). Сделан вывод о преимущественном значении цитокининов в процессе инициации клубнеобразования, ауксина и АБК и в ходе дальнейшего формирования клубня. Показана тесная связь донорной функции листьев и аттрагирующей активности колоса ячменя с-у-изменением гормонального статуса (Киселёва, 1999). Развитие экспортной функции листа происходило сначала параллельно усилению фотосинтеза и- увеличению концентрации ИУК и цитокининов, а затем - на фоне снижения фотосинтетической активности, содержания ИУК и цитокининов, но увеличения АБК. Транспорт ассимилятов в колос до опыления был обусловлен высоким содержанием ИУК, зеатина и соотношением ИУК/зеатин, а после опыления, по мере формирования зерновки и усиления аттракции, - ростом содержания АБК, соотношения АБК/ИУК и низким соотношением ИУК/зеатин. Таким образом, рост и накопление метаболитов в растущих клубнях, также как и в формирующихся семенах злаков (активность аттрагирующих центров), связаны с изменением гормонального баланса, при этом именно различия в динамике фитогормонов и определяли особенности роста и отложения веществ в запас.
При искусственном нарушении донорно-акцепторных отношений, одновременно с изменением фотосинтеза, транспорта и распределения ассимилятов, происходят изменения в гормональном балансе растения. Так, удаление бобов у сои приводило через 36 ч. к четырёхкратному увеличению АБК в листьях, причём такой эффект наблюдался лишь в период интенсивного накопления метаболитов в семенах, когда плоды являются главным акцептором продуктов фотосинтеза. Концентрация ИУК в листьях изменялась при этом мало (Hein et al., 1984). При удалении части колоса у пшеницы происходили изменения в гормональном балансе растения (Кузьмина и др. 1983): увеличивалось содержание ИУК в корнях с одновременным усилением к ним притока С14-ассимилятов, при этом снижался уровень ИУК во фракции стебель + листья; содержание АБК возрастало в оставшейся части колоса и снижалось в стеблях и листьях.
Экспериментальное нарушение морфофизиологических корреляций у картофеля при частичном удалении листьев (дефолиация) или корней (деризоидация) также связано с изменением содержания фитогормонов в листьях. При частичной деризоидации в первый период после нарушения донорно-акцепторных отношений (3-4 дня) идёт подавление роста листьев, фотосинтеза, снижение уровня цитокининов и повышение уровня ауксинов. Содержание АБК сначала не изменялось, но затем становилось значительно выше, чем в листьях контрольных растений (Багаутдинова, 1985). При декапитации огурца наблюдали ингибирование оттока продуктов фотосинтеза и снижение содержания ауксина в листе, удаление половины колоса у пшеницы способствовало увеличению содержания АБК в его оставшейся части - это позволило сделать вывод о регуляторной роли ИУК в донорных процессах листа и АБК в формировании аттрагирующей способности колоса (Кузьмина, 1997).
Приведённые примеры убедительно демонстрируют, что аттрагирующая способность акцепторов ассимилятов находится в значительной степени под гормональным контролем, т.е. фитогормоны обладают (как аттрактанты) аттрагирующим действием и могут претендовать на одну из ведущих ролей в процессах аттракции.
Аттрагирующие центры не только регулируют потоки ассимилятов, а через них и деятельность фотосинтетических процессов, но также оказывают регулирующее влияние на развитие листа-донора. Это влияние проявляется в ускорении старения листа под действием ближнего акцептора ассимилятов. Так, у сои формирование семян служит сигналом к быстрому старению листьев. Распространение сигнала старения ограничивается ближним к акцептору листом. Удаление бобов задерживает старение листа (Lindoo, Nooden, 1977). У пшеницы удаление колоса также снижает темпы старения флагового листа: задерживается распад хлорофилла и медленнее снижается активность РДФ-карбоксилазы и глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы (Patterson, Brun, 1980). Природа сигнала старения, возникающего под влиянием аттрагирующего центра, ещё не ясна. Возможны два объяснения этого явления: либо аттрагирующий центр по мере созревания направляет в лист-донор факторы старения (АБК, фенольные ингибиторы), либо за использование потока цитокининов из корней конкурируют органы плодоношения и листья. Участие цитокининов в задержке старения срезанных листьев было показано О.Н.Кулаевой ещё в 1962 году (Кулаева, 1962). В том и другом случаях удаление формирующихся плодов может задерживать старение донорного листа.
Изменение количества ИУК в корнеплодах столовой свёклы на разных этапах онтогенеза
Небольшой объем осадка вакуолей (0,2 мл) «шокировали» дистиллированной водой (1,8 мл). Нерастворимые примеси в суспензии осаждали на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) в течение 5 мин при 1200g. Супернатант разбавляли водой еще в 10 раз. Содержание Сахаров определяли и в соке корнеплода. Для этого 1 г сырой ткани корнеплода натирали на пластмассовой терке, затем отжимали через капроновую сеть. Сок центрифугировали при 1200 g 5 мин на микроцентрифуге Туре-320 (Poland). 0,5 мл надосадочной жидкости разбавляли в 100 раз дистиллированной водой и измеряли в полученном растворе сока сахара антроновым методом (Туркина, Соколова, 1971).
Концентрацию ионов К+ определяли в соке корнеплодов, которые отбирали на разных фазах роста растения. 50 мкл сока разбавляли в 20-500 раз, в зависимости от периода вегетации. Измерения проводили на пламенном фотометре (Flapho-4, Carl Zeiss Yena, Germany). Определение активного поглощения 3Н-сахарозы на изолированных вакуолях
В 2,5-мл конические микропробирки вносили 50 мкл суспензии вакуолей и 0,5 мл раствора инкубации (455 мМ КС1, 3 мМ MgC , 150 мМ аланина, 0,2 мМ молибдата аммония, 1 мг/1 мл ЧСА, 20 мМ Трис-МЭС, рН 8,0), которая содержала 3 мМ АТФ или ПФ (натриевые соли, Sigma, USA). К смеси вакуолей и среды инкубации приливали 20 мкл раствора гормонов (ИУК, АБК, ГК и кинетина) до конечной концентрации от 10"8 до 10"10М. В последний момент вносили 8 мкл меченой сахарозы (3Н-сахарозы). Содержимое пробирок аккуратно перемешивали и выдерживали 35 мин в термостате при 37С. Затем вакуоли быстро осаждали (2 сек) при 1200 g на микроцентрифуге Туре-320 (Poland). Надосадочную жидкость отсасывали микропипеткой и добавляли 0,5 мл среды инкубации, вновь отсасывали, повторяя процедуру дважды. Фильтровальной бумагой собирали часть жидкости на поверхности осадка и со стенок пробирок для того, чтобы избавиться от примеси меченой сахарозы. К промытому таким образом осадку приливали 1 мл дистиллированной воды, шокировали вакуоли и осаждали в течение 5 мин на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) при 1200g. 0,1 мл лизата использовали для определения количества поглощенной вакуолями Н-сахарозы на жидкостном сцинтилляционном счетчике Wallak-81000 (LKB). Еще 0,1 мл надосадочной жидкости вносили в 3 мл дистиллированной воды для определения бетацианинов на ФЭК-56М (длина волны 540 нм) в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Количество поглощенной радиоактивной сахарозы находили как разницу между опытным вариантом и контролями, один из которых не содержал АТФ и ПФн и не инкубировался при 37С в течение 35 мин, другой - тоже не содержал субстраты, но проходил этап инкубации. Первый контроль помогал оценить количество сахарозы, которое удерживается в межвакуолярном пространстве или сорбируется на мембранах, второй -необходим для определения пассивного транспорта сахарозы через тонопласт (Саляев и др., 1988).
В опытах с гормонами при определении активного транспорта сахарозы находили разницу в количестве поглощенной сахарозы между образцами с гормонами и без (контроль) и выражали в процентах от контрольного активного поглощения. Удельная активность растворов сахарозы составляла 0,32-0,4 МБК/мл. Результаты поглощения сахарозы выражали в условных единицах в пересчете нМоль накопленной сахарозы на мМоль бетацианина в час (Doll et al., 1979; Leigh and Branton, 1976).
Транспортную функцию ферментов оценивали по изменению рН везикул тонопласта методом флуоресцентных зондов. За сдвигами рН следили по изменению флуоресценции хинакрина при длине волны возбуждаемого и испускаемого света 440 и 510 нм соответственно. Эксперименты проводили на спектрофлуориметре (Клыба, 1983) в 3-мл кювете с длиной оптического пути 1 см при температуре 20С. Образец перемешивали встроенной в прибор микромешалкой. В кювету поэтапно вносили 2,5 мл инкубационного раствора и 0,1 мл осадка везикул тонопласта. Инкубационный раствор содержал: 25 мМ Трис/МЭС, 50 мМ KCI, 250 мМ сорбита, 5 мкМ хинакрина, 5 мМ MgSO 4, рН 7,2 (Doll et al, 1979). При работе с везикулами тонопласта концентрацию белка в препаратах определяли по методу В. Шафнера и С. Вейсмана (Shafener, Weismann, 1973). В среднем на 0,1 мл образца приходилось 150 мкг белка. В среду инкубации вносили 5 мМ пирофосфата или 5 мМ АТФ (Трис) и гормоны в разных концентрациях (ЭБ - 10 "п М, ГК и ИУК-10 "8 М).
Эксперименты проводили на изолированных вакуолях (см. раздел 2) и вакуолярных везикулах (см. раздел 4), выделенных из корнеплодов столовой свёклы в период покоя. Гидролитическую и транспортную активность протонных помп тонопласта определяли так же, как уже было нами описано выше, в разделах 8 и 13. Протеолитическую обработку проводили по методу Соммарин (Sommarin et al., 1994) путём введения протеолитических ферментов (трипсина и химотрипсина) в среду инкубации изолированных вакуолей или везикул тонопласта перед определением гидролитической и транспортной активности протонных помп тонопласта. Протеолиз проводили при 20С в течение 15 мин. Останавливали протеолиз добавлением к среде инкубации специфических ингибиторов: соевого ингибитора трипсина или ингибитора трипсина-химотрипсина фирмы «Sigma». Результаты выражали в процентах. За 100% принимали гидролитическую и транспортную активность, полученную на необработанных протеолитическими ферментами мембранах.
