Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1. Глутаминсинтетаза 11
Локализация 12
Полипептидный состав и множественные молекулярные
формы 17
1.3. Регуляция на уровне синтеза 19
Дифференциальная экспрессия генов 19 1.3.1.1. Органо- и тканеспецифичная экспрессия 19 1.3 Л .2. Экспрессия генов в онтогенезе 22
Экспрессия генов и абиотические факторы 25
Действие света 25
Регуляция синтеза источником азота 32 1.4; Регуляция на уровне активности 3 6 1.5. Роль в эффективности использования азота 41
2. Глутаматдегидрогеназа 43
Локализация 44
Полипептидный состав и множественные молекулярные
формы 46
2.3. Регуляция на уровне синтеза 49
Дифференциальная экспрессия генов 49
Экспрессия генов и абиотические факторы 50
Регуляция на уровне активности 53
Физиологическая роль 55
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 63
Объекты исследований 63
В ыращивание растений 64
Постановка опытов с водной культурой люпина белого 64
Постановка вегетационных опытов 66
3. Методы исследований 67
3 Л. Получение бесклеточного экстракта 67
Определение активности глутаминсинтетазы 68
Определение активности глутаматдегидрогеназы 68
Определение активности аспарагинсинтетазы 69
Определение содержания белка 70
Определение содержания свободных аминокислот 70
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 71
ГЛАВА III, Регуляция глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы
у люпина при гетеротрофном питании за счет запасов семени 71
Результаты 71
Обсуждение 79 ГЛАВА IV. Регуляция глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы
при совместном и раздельном усвоении гетеротрофных запасов
семени и неорганического азота среды 84
1. Совместное усвоение проростками люпина гетеротрофных
запасов семени и экзогенного нитрата или аммония 85
Результаты 8 5
Обсуждение 89
2. Усвоение экзогенного нитрата или аммония проростками
люпина, лишенными семядолей 95
2.1. Результаты 95
2.2. Обсуждение 98
3. Регуляция ГС и ГДГ у rrrbrb-^ rrRhRb- и RRrbrb-мутактов
гороха при совместном усвоении гетеротрофных запасов
семени и нитрата 100
Результаты 100
Обсуждение 104 ГЛАВА V. Регуляция глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы
у люпина при усвоении нитратного или аммонийного
азота среды на этапе автотрофного питания 108
Результаты 108
Обсуждение 113 ГЛАВА VI. Регуляция глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы
у люпина при усвоении симбиотически фиксированного азота 114
Результаты 114
Обсуждение 118
ВЫВОДЫ 122
ЛИТЕРАТУРА 124
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Дефицит белка - одна из острейших проблем, стоящих перед человечеством. В этой связи особую актуальность приобретают исследования по интенсификации производства наиболее экономически выгодного растительного белка. В частности, до сих пор мало использованным, но мощным резервом увеличения производства растительного белка является повышение роли и продуктивности зернобобовых культур, биомасса и семена которых выгодно отличаются по этому показателю.
Вторым важнейшим преимуществом бобовых является их способность к симбиотической азотфикации. Благодаря азотфиксации обеспечивается экологическая чистота и рентабельность получаемой продукции, так как бобовые не нуждаются в азотных удобрениях. Кроме того, бобовые выполняют средообразующую функцию, повышая плодородие почвы, улучшая её физическое, химическое и фитосанитарное состояние.
В последнее время среди зернобобовых культур большой интерес вызывает люпин, о чем свидетельствует регулярное проведение Международных научных конференций по этой культуре. Особое внимание ему уделяется в странах с коротким вегетационным периодом, где признанный белковый лидер - соя не может широко культивироваться из-за климатических условий. Создание новых сортов люпина, отличающихся скороспелостью и низким содержанием алкалоидов, ставит эту культуру на одно из первых мест среди других зернобобовых. При этом люпин обладает целым рядом агробиологических и физиолого-биохимических особенностей, в силу которых он может стать важной культурой в биологизации сельского хозяйства большинства, областей Нечернозёмной зоны, Поволжья и других регионов Российской Федерации. Являясь эффективным азотфиксатором (до 230 кг биологического азота на 1га за вегетационный период), люпин способен развиваться на бедных почвах, обогащая их симбиотическим азотом, полезной
микрофлорой и органическим веществом за счет высокобелковой зеленой массы. Благодаря специальным корневым выделениям люпин способен разлагать труднорастворимые фосфаты до легкорастворимых фосфорных соединений и тем самым улучшать фосфатный режим почвы. Кроме того, корневая система люпина, проникая глубоко в почву (до 2 м), действует как глубинный насос, поднимая из-под пахотного слоя профильтрованные туда калий и другие макро- и микроэлементы, и тем самым улучшает калийный режим почвы (Такунов, 2001).
Люпин без применения удобрений обеспечивает урожайность зерна 2.6-3.2 т/га (люпин белый до 4-6 т/га),,в которых содержится 1.1-1.2 т/га сырого белка, что вї.З-1.8 раз больше, чем у кормовых бобов, вики и гороха. Диапазон изменчивости содержания белка в семенах люпина составляет 32-53%. При этом суммарный белок на 26-36% состоит из незаменимых аминокислот, в связи с чем белки семян люпина имеют высокую питательную ценность. Наряду с белком в состав семян люпина входит до 12% липидов, которые характеризуются высоким содержанием; полиненасыщенных жирных кислот (Лисицин и др., 2001). По наличию витаминов группы В семена люпина, как и других бобовых, значительно превосходят зерновые культуры. Все это позволяет использовать люпин не только как зеленое удобрение, но и как ценную кормовую и пищевую культуру.
Однако потенциальный генотип, определяющий накопление больших количеств белка в зеленой массе, а затем и в семенах люпина, способен реализоваться при оптимальном азотном питании растений, как физиологической основы биосинтеза белка. Оптимизация азотного питания у конкретной культуры возможна на основе изучения особенностей физиол ого-биохимических процессов ассимиляции азота.
Важным этапом азотного питания является ассимиляция аммония, которая осуществляется при участии двух ключевых ферментов -глутаминсинтетазы (ГС) и глутаматдегидрогеназы (ГДГ). Большинство работ, посвященных этим ферментам, относятся к области биохимических
исследований, когда свойства ферментов и их регуляция изучаются в условиях in vitro. Тогда как в целом растении ферменты подвергаются действию внешних факторов не непосредственно, а через изменение направленности различных физиологических процессов, состава метаболитов и особенностей их транспорта. Регуляция ГС и ГДГ, и относительный вклад этих ферментов в процесс ассимиляции аммония в разных органах в ходе их роста и развития при различных типах питания изучены далеко недостаточно. В случае люпина указанные выше вопросы практически открыты, особенно мало известно об особенностях ассимиляции азота в онтогенетическом аспекте. Между тем, только на основе знания механизмов регуляции активности ключевых аммонийассимилирующих ферментов, последовательно реализующихся в ходе онтогенеза, возможно полное понимание всего процесса усвоения азота растением.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель работы заключалась в изучении особенностей регуляции активности ГС и ГДГ и выявлении их относительного вклада в процесс ассимиляции аммония в органах люпина белого на различных стадиях его онтогенеза и при; разных типах азотного питания.
В работе были поставлены следующие задачи:
/. Изучить характер распределения активности и функциональную роль ГС и ГДГ в органах люпина при гетеротрофном питании за счет запасов семени.
2. Исследовать регуляцию ГС и ГДГ у люпина при совместном и раздельном усвоении гетеротрофных запасов семени и неорганического азота среды. С этой же целью изучали активность ферментов у г- и гй-мутантов гороха, различающихся по соотношению углерод- и азотсодержащих запасных веществ в семени.
Изучить регуляцию активности и роль ГС и ГДГ в органах люпина при усвоении нитратного или аммонийного азота среды на этапе автотрофного питания.
Установить особенности органной топографии и роль ГС и ГДГ у люпина при усвоении симбиотически фиксированного азота. Выявить возможную корреляцию между процессом ассимиляции аммония и синтезом аспарагина, как основного азотсодержащего транспортного соединения у растений люпина, на основании изучения сопряженности динамики активности ГС и глутаминзависимой аспарагинсинтетазы (АС), и содержания свободных аминокислот.
