Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Физиологические и молекулярные механизмы повреждений и устойчивости растений к действию гипотермии 6
1.2 Инвертазы растений, их физиологическая роль и значение при гипотермии 21
1.3 Функции углеводов в низкотемпературной адаптации растений 32
1.4 Трансгенные растения, как модель для изучения стрессовых ответов 36
Глава 2. Объекты и методы исследования 40
2.1 Объекты исследования 40
2.2 Выращивание растений in vitro 41
2.3 Определение проницаемости мембран 42
2.4 Определение интенсивности перекисного окисления липидов 42
2.5 Измерение газообмена растений 43
2.6 Определение активности разных типов инвертаз в листьях растений 44
2.7 Определение содержания Сахаров в листьях растений 44
2.8 Исследование ультраструктурной организации 45
Глава 3. Результаты и их обсуждение 46
3.1 Влияние введенного гена дрожжевой инвертазы на углеводный метаболизм трансформированных растений картофеля (Solatium tuberosum L.) сорта Дезире 46
3.1.1 Анализ активности пататинового промотора и разных типов инвертаз в вегетативных органах ВЗЗ-ШУ растений картофеля 46
3.1.2 Активность инвертаз и содержание Сахаров в листьях контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля 51
3.1.3 Особенности фотосинтеза, дыхания и роста контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля в условиях in vitro 55
3.2 Холодостойкость контрольных и ВЗЗ-inv растений картофеля 61
3.2.1 Изменение интенсивности перекисного окисления мембранных липидов при охлаждении контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля 62
3.2.2 Изменение ионной проницаемости клеточных мембран при охлаждении контрольных и B33-/wv растений картофеля 70
3.3 Изменения в углеводном метаболизме и устойчивости к гипотермии контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля в условиях культивирования на средах с разной концентрацией сахарозы 74
3.3.1 Активность разных типов инвертаз и содержание Сахаров в листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля в условиях культивирования на средах с разной концентрацией сахарозы 75
3.3.3 Интенсивность перекисного окисления липидов при гипотермии в листьях контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля, выращенных на средах с разной концентрацией сахарозы 81
3.4 Действие холодового закаливания на углеводный метаболизм и устойчивость к гипотермии контрольных и B33-//IV растений картофеля 85
3.4.1 Влияние низкой закаливающей температуры на активность разных типов инвертаз в листьях контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля 86
3.4.2 Изменение содержания Сахаров в листьях контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля в условиях холодового закаливания 91
3.4.3 Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля при холодовом закаливании 97
3.4.4 Изменение ионной проницаем ости клеточных мембран при адаптации контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля 100
3.4.5 Влияние низкотемпературной адаптации на ультраструктурную организацию хлоропластов в листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля 104
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы 113
- Инвертазы растений, их физиологическая роль и значение при гипотермии
- Определение интенсивности перекисного окисления липидов
- Особенности фотосинтеза, дыхания и роста контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля в условиях in vitro
- Действие холодового закаливания на углеводный метаболизм и устойчивость к гипотермии контрольных и B33-//IV растений картофеля
Введение к работе
Температура среды обитания является одним из наиболее значительных факторов, оказывающих существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов (Туманов, 1979; Levitt, 1980). Известно, что в ответ на различные стрессоры, в том числе гипотермию, в растениях происходит неспецифическое усиление гидролиза полимерных форм углеводов и накопление низкомолекулярных растворимых Сахаров, что играет важную роль в формировании устойчивости к низким температурам (Максимов, 1952; Туманов, 1979; Трунова, 1984; 2007; Perera et al., 1995; Winter, Huber, 2000). Наиболее полно этот вопрос изучен на примере морозостойких растений (Трунова, 1963; 1998; Туманов и др. 1969; Самыгин, 1974; 1994) и в значительно меньшей степени у холодостойких растений, неустойчивых к льдообразованию, но адаптирующихся к низким положительным температурам (Дроздов, Курец, 2003).
Учитывая значимость Сахаров в устойчивости растений к гипотермии, значительный интерес представляют гидролитические ферменты углеводного метаболизма, в частности, инвертаза, катализирующая реакцию расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу и поэтому играющая важную роль в углеводном метаболизме. На сегодняшний день, вопрос о роли инвертаз (вакуолярной, апопластной, цитоплазматической) в устойчивости холодостойких растений к гипотермии остается открытым. Отсутствуют четкие экспериментальные доказательства связи активности инвертаз и содержания различных форм Сахаров с формированием устойчивости холодостойких растений к гипотермии, стратегия выживания которых направлена на сохранение от повреждений надземной части, как наиболее уязвимой к действию пониженных температур. Решению этих вопросов может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом. В частности, трансформация типичного
представителя группы холодостойких растений - картофеля геном дрожжевой инвертазы апопластной локализации способна изменить содержание и соотношение моно- и дисахаров в листьях за счет гидролиза сахарозы в апопласте (Kallarakal, 1989; Schaewen et al., 1990; Sonnewald et al., 1997) и, возможно, повлиять на устойчивость растений к гипотермии.
Цель настоящей работы состояла в изучении зависимости формирования устойчивости к гипотермии растений картофеля от активности инвертаз и содержания разных форм Сахаров, изменения которых достигались тремя способами:
1) путем трансформации растений геном дрожжевой инвертазы; 2) культивированием in vitro на средах с различной концентрацией сахарозы и 3) длительной экспозицией при пониженной адаптирующей температуре. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Исследовать влияние трансформации растений картофеля геном дрожжевой инвертазы на активность инвертаз, содержание разных форм Сахаров и устойчивость к гипотермии по определению перекисного окисления липидов в тканях листьев и экзоосмоса электролитов из них.
Определить интенсивность процесса фотосинтеза в условиях in vitro и его вклад в изменение содержания Сахаров в листьях растений исследуемых генотипов.
Изучить активность инвертаз и содержание разных форм Сахаров в листьях контрольных и трансформированных растений картофеля, выращенных на средах с разной концентрацией сахарозы (2, 4, 6%), и исследовать вызванные этим фактором изменения в устойчивости к гипотермии.
В период длительной адаптации растений картофеля к низкой положительной температуре изучить динамику активности инвертаз, содержания разных форм Сахаров и формирования холодостойкости.
Выявить изменения в ультраструктурной организации хлоропластов растений картофеля, вызванные трансформацией геном дрожжевой инвертазы, а также длительным воздействием низких положительных температур.
Инвертазы растений, их физиологическая роль и значение при гипотермии
В высших растениях инвертаза является основным ферментом углеводного метаболизма и относится к числу важнейших ферментов, участвующих в различных защитных реакциях в условиях стрессов.
Растительные инвертазы играют важную роль в метаболизме сахарозы, катализируя реакцию ее необратимого расщепления. Они обеспечивают гексозами энергетические процессы, вовлечены в разгрузку флоэмы, играют ключевую роль в процессах роста и развития. В связи с этим, в зависимости от потребности растения в моносахарах, уровень активности инвертазы может изменяться в течение дня, в онтогенезе растений, в зависимости от сезона, а также в условиях стрессов (Goupil etal, 1988, Wuetal., 1993).
Исследование инвертаз в различных тканях растений привело к обнаружению разных типов этих ферментов. Инвертазы - это группа 0-фруктофуранозидаз (P-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза, ЕС 3.2.1.26), которые отличаются рН-оптимумом активности (кислые, рН 4,5-5,0, Кга- 2-13, нейтральные и щелочные рН 7,0-7,8, Km - 9-25), а также по растворимости (растворимые и нерастворимые). Они также различаются по клеточной локализации: кислая растворимая инвертаза является вакуолярной, кислая нерастворимая -внеклеточной (связанной с клеточной стенкой), а нейтральные или щелочные инвертазы являются цитозольными.
Каждая из трех типов инвертаз определяется несколькими генами. Так, в моркови существует три гена, кодирующих инвертазы клеточных стенок, и два гена, кодирующих вакуолярные инвертазы (Sturm, 1995). Для кукурузы (Xu et al., 1996b), арабидопсиса (Haouazineakvorian et al., 1997) показано, что растворимые кислые инвертазы кодируются небольшим семейством генов.
Все типы инвертаз также представлены различными изоформами (Tymowska-Lalanne, Kreis, 1998). Изоформы отличаются константами Михаэлиса Ментен (Km), обладают разными биохимическими свойствами и чувствительностью к ингибиторам. Сосуществование изоэнзимов инвертаз описано для многих растительных тканей. Эндосперм кукурузы содержит две изоформы растворимой инвертазы (Jaynes, Nelson, 1971), развивающиеся междоузлия ячменя две изоформы инвертазы клеточных стенок (Karuppiah et al., 1989). Из листьев арабидопсиса были выделены и очищены три изоформы фермента (Haouazineakvorian et al., 1997). Полагают, что они являются результатом посттрансляционного процессинга. Кислые инвертазы являются N-гликозилированными ферментами (Tymowska-Lalanne, Kreis, 1998), существование же дополнительных, потенциальных участков гликозилирования может, по-видимому, объяснить наличие разных изоформ. Гликозилирование кислых инвертаз требуется для их транспорта через плазматическую мембрану и тонопласт, а также для локализации в апопласте или вакуоли. В противоположность кислым инвертазам, щелочные изоэнзимы не гликозилированы.
Гены, кодирующие разные формы и изоформы инвертазы, могут экспрессироваться независимо друг от друга в определенных органах или на определенных стадиях развития растения.
Активность растительных инвертаз может модулироваться экспрессией генов под влиянием различных внешних и внутренних факторов или путем изменений активности уже существующих в клетке белков-фермента. Существование нескольких генов инвертаз и наличие множественных изоферментов инвертаз способствует большой гибкости в контроле метаболизма сахарозы, ее передвижении или хранении при различных внутренних и внешних условиях, на разных стадиях развития ткани, органа, растения и при стрессах.
Как было указано ранее, основная реакция, катализируемая инвертазой - это необратимое расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу. Кроме этого, фермент может также использовать другие субстраты, которые обладают конечным незамещенным p-D-фруктофуранозильным остатком, обеспечивая гидролиз (Roitsch and Gonzalez, 2004). Было показано, что инвертаза листьев картофеля гидролизует лактозу при скорости, составляющей 10% от скорости гидролиза сахарозы. Инвертаза клубней картофеля гидролизует лактозу, раффинозу, трегалозу, но тоже со скоростью 10% от скорости гидролиза сахарозы (Burch et al., 1992). Инвертаза клеточных стенок и вакуолярная инвертаза земляники катализируют гидролиз раффинозы и стахиозы. Активности фермента по отношению к раффинозе и стахиозе составляли 25% и 15% от активности при расщеплении сахарозы. Вакуолярные инвертазы бутонов лилий гидролизует раффинозу и стахиозу (Miller and Ranwala, 1994; Roitsch and Gonzalez, 2004). Напротив, щелочная инвертаза соевых бобов не способна утилизировать раффинозу, мальтозу и лактозу в качестве субстрата (Chen, Black, 1992).
Некоторые формы инвертаз обладают гликозилтрансферазной активностью, которые катализируют синтез трисахаридов, обычно L-кетоз. Было обнаружено, что три вакуолярных изоэнзима, очищенных из листьев ячменя, действуют как сахарозо:сахарозофруктозилтрансферазы, образуя L-кетозы как основной продукт. Образование L-кетоз может быть первым этапом в образовании фруктанов. Фруктаны хранятся в вакуолях многих трав и других растений, а также представляют резерв карбогидратов. Полагают, что фермент, ответственный за начальный шаг синтеза фруктана, сахарозохахарозофруктозилтрансфераза, дает результирующие сахара - глюкозу и трисахарид. Таким образом, инвертаза может также быть включена в синтез фруктана и заменять сахарозогсахарозофруктозилтрансферазы.
Исследование инвертаз растений показало, что очень часто три формы инвертазы активны в различных тканях и органах на различных стадиях развития растений. Как утверждают Cheng et al., (1996), вполне возможно, что каждая ткань в растении имеет уникальный набор генов, кодирующих различные изоформы этого фермента. Многообразие данных свидетельствуют о том, что различные изоформы часто экспрессируются в различных типах клеток и могут играть разную роль. Биохимические и физиологические исследования показывают, что инвертаза клеточных стенок активна в месте транспорта сахарозы (во флоэме, в основании эндосперма) и в зоне растяжения (Dochlert, Felker, 1987). Полагают, что основными функциями кислой инвертазы, локализованной снаружи от плазмалеммы, является распределение сахарозы между донорными и акцепторными органами, участие в регуляции межтканевого транспорта сахарозы. Кроме этого, кислая нерастворимая инвертаза осуществляет контроль в дифференциации клеток и развитии растений, а также в реакциях на стрессы (Eschrich, 1992; Roitsch et al., 2003).
Регулируя содержание сахарозы, инвертаза оказывает существенное влияние на морфологическую и биохимическую дифференциацию ткани. Так, сахароза может участвовать в индукции формирования сосудистой ткани, в особенности флоэмы (Lyne et al., 1971). Показано, что в каллусной культуре моркови отсутствие кислой инвертазы приводит к значительному снижению скорости метаболизма и изменению морфологической дифференциации ткани (Parr et al., 1976). В работе Чина и Вестана высказывается предположение об участии инвертазы свободного пространства в образовании клеточной стенки (Chin, Weston, 1973). Некоторые авторы считают, что в начальный период клеточного роста растяжением кислая инвертаза свободного пространства является основным ферментом, обеспечивающим потребности растущих клеток в гексозах (Jones et al., 1975). Было показано, что активность инвертазы клеточных стенок была наибольшей в растущем участке, но, в отличие от активности растворимой инвертазы, она снижалась быстро по мере замедления роста (Dochlert, Felker, 1987). Сходным образом, в корнях моркови высокая активность инвертазы клеточных стенок была показана в быстро растущих тканях и малая - в зрелых корнях (Ricardo, 1970).
Определение интенсивности перекисного окисления липидов
Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по накоплению продукта окисления - малонового диальдегида - по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (Жиров и др., 1982). Навеску листьев 300 мг гомогенизировали в 5 мл среды выделения (0,1 М трисНСІ буфер рН 7,6, содержащий 0,35 М NaCl). К 3 мл гомогената добавляли 2 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты в 20%-ной трихлоруксусной кислоте, нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут, фильтровали и регистрировали оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 532 нм. В качестве контроля брали среду выделения с реагентом. Концентрацию малонового диальдегида рассчитывали по формуле: C=D/EL, где С - концентрация малонового диальдегида, мкмоль, D - оптическая плотность, Е - коэффициент молярной экстинкции, равный 1,56х105см Моль 1. Количество образовавшегося малонового диальдегида рассчитывали в мкмоль на 100 мг сухой массы.
Измерения газообмена растений проводили на установке открытого типа с инфракрасным газоанализатором Uras 2Т ("Hartmann und Braun", Германия). Листовая камера представляла собой металлическую камеру-прищепку с водной рубашкой и с прокачиванием воздуха через шесть отверстий над тремя экспонированными к свету последовательными воздушными секциями камеры (общей площадью 8 см2 и объемом 4 см3) с каждой стороны листа. Листовую камеру размещали в рабочем объеме климатического шкафа Gronland ("ILKA", Германия) с регулируемой температурой. Используемый в качестве осветителя диапроектор Протон фирмы Диапроектор (СССР) располагали вне климатического шкафа, а освещение растений в листовой камере осуществляли через специальное окно, закрываемое по мере необходимости светонепроницаемой заслонкой. Освещенность участка листа в листовой камере составляла 50 Клк. Благодаря термоизолирующему эффекту двойного стекла в окне климатической камеры и водной рубашке в листовой камере температура участка листа, на котором регистрировали газообмен, на свету и в темноте не отличалась от заданной. 1 Измерения газообмена включали измерение скоростей видимой ассимиляции С02 и темнового дыхания. Содержание С02 в продуваемом через листовую камеру воздухе составляло 415 ррт, а чувствительность газоанализатора - 50 ррш на всю шкалу. При этом разница в содержании С02 на входе и выходе листовой камеры не превышала 1-2% от содержания С02 в воздухе.
Для определения активности разных типов инвертаз навески ткани листьев (0,3-0,5г) растирали при температуре 4С с небольшим количеством разбавленного в 10 раз фосфатно-цитратного буфера (рН-7,0), диализовали 20ч (при 4С) против этого же буфера для удаления Сахаров, содержащихся в ткани. Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 8000 g. Надосадочную жидкость использовали для определения растворимых типов инвертаз. Осадок после трехкратного промывания тем же буфером (10 мин при 200g) использовали для определения нерастворимой инвертазы клеточных стенок. Инкубационная смесь общим объемом 0,5 мл содержала 0,2 мл фракции клеточных стенок или растворимой фракции, 0,3 мл буфера с сахарозой, конечная концентрация которой в смеси составляла 150мМ. Для определения активности кислой инвертазы использовали 1М ацетатный буфер (рН 4,7), для щелочной - фосфатно-цитратную буферную смесь (рН 7,5). Время инкубации составляло 1 ч при 30С. Об активности фермента судили по количеству образовавшейся глюкозы в инкубационной среде, которую определяли глюкозооксидазным методом (Туркина, Соколова, 1971).
Для определения содержания Сахаров в листьях навеску ткани 0,3-0,5г фиксировали кипящим 96%-ным этиловым спиртом и растирали в фарфоровой ступке. Сахара извлекали трёхкратной экстракцией 80% этанолом. В полученных экстрактах определяли глюкозу - глюкозооксидазным методом, сахарозу и фруктозу - по методу Рое (Туркина, Соколова ,1971).
Особенности фотосинтеза, дыхания и роста контрольных и ВЗЗ-ШУ растений картофеля в условиях in vitro
Известно, что экспрессия чужеродных генов в трансформированных растениях картофеля может вызывать морфогенетические изменения и способна значительно влиять на рост и развитие растений (Schmulling et al., 1988). Вместе с тем, культивирование растений в условиях in vitro приводит к снижению функциональной активности фотосинтеза и в результате, к незначительному фотосинтетическому образованию углеводов (Цоглин и др., 1988; 1991).
Проведенные нами исследования СОг-газообмена у ВЗЗ-wv и контрольных (К) растений включали измерение скоростей видимой ассимиляции СОг и темнового дыхания. При оптимальной для роста растений температуре 22С у растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы (ВЗЗ-mv), видимый фотосинтез был на 23% ниже, а темновое дыхание на 36% выше, чем у трансформированного контроля (К). Более высокий уровень дыхания B33-/«v по сравнению с контролем может быть связан с потребностью трансформантов в энергии для поддержания более интенсивных синтетических процессов (Кравец, Великожон, 1984), а также с более высокими затратами на поглощение Сахаров из среды питания этой миксотрофной культурой. Пониженная скорость ассимиляции С02 у растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, возможно вызвана ингибирующим действием образующихся Сахаров на ряд ферментов, участвующих в процессе фотосинтеза. Существуют данные о влиянии глюкозы, накопление которой ингибирует синтез как структурных, так и ферментативных белков хлоропластов. Как следствие, накопление глюкозы проявляет резкое репрессирующее действие на все функции хлоропластов (Семененко, Афанасьева, 1972).
Следует отметить, что низкая функциональная активность фотосинтеза у трансгенных растений может быть связана с лимитированием процесса по основному субстрату - углекислому газу, которое возникает из-за изолированности растения от внешней среды в стерильных условиях выращивания (Sutter et al., 1985). Различные приспособления, обеспечивающие стерильность (ватно-марлевые пробки), предельно ограничивают газообмен пробирочных растений. Проведенные измерения (Цоглин, Мелик-Саркисов, 1991) показали, что количество углекислоты, поступающей диффузно из воздуха через ватно-марлевую пробку, способно обеспечить лишь 5-6% фотосинтетических потребностей пробирочных растений и благодаря богатым органическим питательным средам рост их происходит в основном гетеротрофно. Увеличение на несколько порядков скорости размножения, по сравнению с природными условиями, пропорционально ускоряет автоселекционные процессы, направленные в сторону отбора растений с лучшими ростовыми свойствами при заданных условиях, то есть при гетеротрофном питании. Необходимо еще учитывать вмешательство в этот процесс оператора, отбраковывающего недостаточно выросшие растения и тем самым значительно ускоряющего отбор растений с хорошими гетеротрофными свойствами. Поскольку фототрофный и гетеротрофный типы питания находятся в конкурентных отношениях, можно предположить, что такой отбор приведет к ухудшению фотосинтетического роста растений и в итоге к потере хозяйственно полезных качеств, что часто наблюдается на практике (Grout, Millam, 1985; Sutter, 1985).
Для выяснения вопроса о роли процесса фотосинтеза в накоплении Сахаров у трансформированных (ВЗЗ-wv) и контрольных (К) растений картофеля был проведен сравнительный анализ изменения содержания и соотношения разных форм Сахаров при выдерживании на свету и в темноте. Как показано на рисунке 5, в темноте в течение двух суток наблюдалось незначительное снижение уровня Сахаров у обоих генотипов. В контроле (К) содержание сахарозы уменьшилось на 4%, а у ВЗЗ-wv на 11%, что связано не только с темновой фазой процесса фотосинтеза, но и с высокой активностью инвертазы, которая подтверждается увеличением уровня фруктозы и глюкозы. Общее содержание Сахаров у контрольных растений (К) снизилось на 7%, а у B33- inv на 3%, вместе с тем их уровень у B33-/«v растений оставался на 16% выше, чем у контрольных растений.
При культивировании на среде с 2%-ой сахарозой трансформированные растения (B33-/«v) отличались меньшей интенсивностью роста побега, чем контрольные (К, KTj) растения картофеля (рис.6). Как отмечено Хромовой с сотрудниками (1996), при сравнении независимых линий трансформированного картофеля уже сам процесс трансформации часто вызывает изменения фенотипа, объясняющиеся комбинацией эффектов сомаклональной вариабельности и стрессовой селекции при регенерации растений в посттрансформационной культуре тканей. На рисунке 6 видно, что растения Кті по интенсивности роста близки к нетрансформированным контрольным К. Следовательно, сам процесс трансформации растений не оказывал существенного влияния на их рост.
Как установлено нашими исследованиями, результаты которых изложены в предыдущем разделе, трансформация растений картофеля геном дрожжевой инвертазы приводит к значительному увеличению активности этого фермента и содержания Сахаров в листьях. Повышенная концентрация сахарозы вызывает торможение роста растений, как основного акцептора ассимилятов и к опосредованному снижению активности основного донора ассимилятов -фотосинтеза (Туманов, Трунова, 1958; Эльберсгейм, Дарвелл, 1985; von Schaeven et al., 1990; Bussis et al., 1997; Заботина и др., 1998; Трунова, 2007).
Действие холодового закаливания на углеводный метаболизм и устойчивость к гипотермии контрольных и B33-//IV растений картофеля
Известно, что адаптация растений к гипотермии генетически детерминирована. В связи с этим активность некоторых ферментов используется как маркер устойчивости к неблагоприятным условиям среды (Колоша, 1975; Roberts, 1982; Петрова и др., 1984; Савич, 1988; 1989а,б; 1990). К числу ферментов, которые применяются как биохимические показатели адаптации к гипотермии, многие авторы относят инвертазу (Колоша, Костенко, 1976; Roberts, 1982). Интерес к этому ферменту вполне естественен, поскольку ему принадлежит ведущая роль в гидролитическом расщеплении олигосахаридов при действии на растения пониженных температур. Исследования Робертса (Roberts, 1976) показали возможность использования изоэнзимов этого фермента как маркера морозоустойчивости пшеницы. Имеются сведения о прямой связи между активностью инвертазы и морозостойкостью озимых злаковых растений после второй фазы закаливания (действие температуры от минус 2 С до минус 7С) (Колоша, Костенко, 1976).
В связи с этим представлялось целесообразным изучить характер изменения инвертазной активности и содержания Сахаров у контрольных (К) и B33-wv растений при длительном действии низкой адаптирующей температуры. Такого рода данные могут оказаться полезными, прежде всего, для оценки физиологической роли инвертазы в условиях адаптации холодостойких растений, для которых роль этого фермента изучена в значительно меньшей степени, чем для морозостойких.
Для выяснения изменений активности инвертазы в ответ на продолжительное действие низких закаливающих температур была изучена её временная динамика. Длительная экспозиция растений при низких закаливающих температурах позволяет также направленно изменять углеводный метаболизм и устойчивость к низкотемпературному стрессу (Колоша, Костенко, 1976; Трунова, 1979; Artuso et al., 2000).
Исследуемые растения картофеля при оптимальных для роста растений условиях (22С) имеют существенные различия в активности фермента (рис. 13). Так, суммарная активность инвертазы в листьях ВЗЗ-ШУ растений в 1,5 раза выше контрольного варианта, преимущественно за счет кислых форм (в 1,8 раза).
Суточное холодовое закаливание при температуре 5С приводило к повышению общей активности фермента у обоих генотипов практически в одинаковой степени (в 1,3 раза), в основном за счет кислых инвертаз (рис. 13 б, в), при этом суммарная активность у ВЗЗ-mv растений была в 1,5 раза выше, по сравнению с контрольным вариантом (К). Следует отметить, что у контрольных растений суточная холодовая экспозиция вызывала увеличение активности кислой растворимой инвертазы в 1,8 раза, по сравнению с неохлажденным вариантом, у растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, преимущественно увеличилась активность щелочной и кислой нерастворимой инвертазы в 1,5 раза (по сравнению с неохлажденными растениями). На основании этих данных можно допустить, что трансгенные растения будут активнее, по сравнению с контрольными растениями, адаптироваться к гипотермии, поскольку кислая нерастворимая инвертаза, согласно ранее описанной схеме (гл 3.1.2), обеспечивает в вегетативных органах растений более высокий уровень Сахаров, тормозя отток ассимилятов.
После трех суток охлаждения у изучаемых генотипов наблюдалось максимальное увеличение суммарной активности инвертаз. Однако, по уровню этого показателя трансгенные растения значительно превосходили контрольный вариант. В листьях ВЗЗ-mv растений происходило увеличение активности нерастворимой инвертазы в 1,3 раза, при этом активность растворимой формы фермента увеличилась в 1,5 раза (по отношению к уровню суточного охлаждения), что согласуется с результатами других исследователей (Колупаев и др., 1993). В листьях же контрольных растений максимальная активность фермента достигалась главным образом за счет увеличения активности кислой нерастворимой инвертазы.
Сравнение доли активности растворимой и нерастворимой инвертаз в процентах у контрольных и трансформированных растений, по отношению к суммарной активности фермента, после трех суток охлаждения показало, что это соотношение соответствовало этому же показателю неохлажденных растений, что дает основание рассматривать этот факт как стабилизацию в активности фермента. Вместе с тем повышение активности инвертазы в условиях действия закаливающих температур является, на наш взгляд, еще одним аргументом в пользу доказательства важной роли фермента при адаптации растений к гипотермии.
Более длительное охлаждение (6 суток) приводило к снижению инвертазной активности у обоих вариантов, но у ВЗЗ-mv растений она оставалась в 1,3 раза выше, чем в контрольном варианте. Следовательно, можно заключить, что в ответ на стрессорное воздействие активность инвертазы увеличивается, а затем по мере адаптации имеет тенденцию возвращения к исходному уровню, что более интенсивно происходит у ВЗЗ-mv растений.
Известно, что изменение активности инвертаз при охлаждении может происходить за счет изменения количества фермента в ткани и преобразования изоферментного состава, за счет регуляции каталитической активности уже существующих молекул фермента, а также за счет изменения активности фермента вследствие взаимного перехода его растворимой и связанной с клеточными стенками форм.
В нашем опыте увеличение активности инвертазы в растениях, по-видимому, нельзя объяснить только перераспределением активности растворимой и связанной с клеточными стенками форм фермента, которое отмечено в ряде работ (Zouaghi et al., 1979; Krishnan et al., 1985), поскольку в эксперименте наблюдалось одновременное увеличение активности всех форм фермента или по крайней мере значительное увеличение одной из форм, которое не сопровождалось падением активности другой формы энзима. Индукция инвертазной активности через увеличение транскрипции соответствующих генов происходит в ответ на широкий ряд воздействий, связанных со стрессами и развитием стресса, в том числе и низкотемпературного. Полученные результаты дают основание полагать, что для постепенного увеличения активности инвертазы, которое наблюдалось в ответ на действие низкой положительной температуры, по-видимому, необходим синтез ферментного белка, который, хотя и медленно, но может происходить при низких температурах (Петрова, 1984). Также, была выявлена различная чувствительность посттранскрипционного процессинга для гена инвертазы клеточной стенки картофеля к холодовому стрессу (Bournay et. al., 1996). Кроме того, на основании результатов других исследователей (Roberts, 1975; 1982), можно предположить, что ферментативная адаптация растений к длительному существованию в условиях низких положительных температур сопровождается образованием новых изоформ инвертазы.
