Содержание к диссертации
Стр.
Введение. .. . „4
Глава I. Сомакдональная изменчивость кукурузы .. 8
Обзор литературы.. ..8'
Изменчивость морфологических- признаков. ..9
Изменчивость биохимических и физиологических'признаков.'. 11
Вариации числа и структуры хромосом. .. ... 14
Изменения; выявляемые на уровне ДНК ,21
Активация в культуре in vitro мобильных генетических
элементен; . „ Л6
Вариабельность мнтохондриального и хдорогогастного
Геномов ..29
Причины и механизмы сомаклональной изменчивости . 32
Заключение. 47
Материал и методы. 50
Результаты и обсуждение 60
Аномалии развития растений-регенерантов 60
Вариабельность морфологических признаков 66
Сомаклональные вариации после кратковременного
культивирования. 66
Влияние длительного культивирования на изменчивость
морфологических признаков 79
Изменчивость физиологических признаков 88
Гибридологический анализ сомаклональных вариаций 89
Хромосомная изменчивость 97
Изменчивость молекулярных маркеров 100
Вариации в спектрах изоформ эстеразы и пероксидазы 100
Анализ структуры ДНК 111
Заключение 132
Глава 2. Регуляция морфогенеза в культуре тканей куккурузы .135
Обзор литературы..... ....135
Характеристика каляусиых тканей кукурузы; 135
Зависимость морфогенетичесшго потенциала от вида
эксшишха. —....—... —.......... —.... . 138
Зависимость морфогенетического потенциала от генотипа...... 140
Роль физиологических факторов в регуляции морфогенеза. 142
Эдектростимудяция морфогенеза 149
Заключение 152
Материал и методы 154
Результаты и обсуждение... ..159
Образование эмбриогенного каллуса .159
Влияние генотипа на частоту образования эмбриогенного
каллуса.. .159
Влияние эпигенетического и физиологического состояния
экспланта 171
Влияние компонентов питательной среды 177
Гормональный баланс в компетентных и некомпетентных к
морфогенезу тканях. 183
Регуляция регенерации растений из эмбриогенного каллуса... 195 Внутрилинейный полиморфизм по количеству
регенерированных растений 196
Влияние компонентов питательной среды на регенерацию
растений 199
Стимуляция регенерации растений под действием
антибиотика цефотаксима 203
Влияние электрического тока на регенерацию растений 208
Заключение. 224
Глава 3. Использование сомаклональной изменчивости для получения
растений, толерантных к абиотическим стрессам 226
Обзор литературы 226
Изменчивость агрономических признаков у растений,
регенерированных из культивируемых тканей 226
Получение растений, толерантных к биотическим и
абиотическим стрессам методом клеточной селекции 230
Применение сомаклональной изменчивости и клеточной
селекции для создания ценных форм кукурузы; 243
Материал и методы 252
Результаты и обсуждение 256
Уровень изменчивости по устойчивости к абиотическим
стрессам среди сомаклонов А188 256
Выбор селективного фактора. 258
Разработка методики отбора устойчивых клеток 267
Физиолого-биохимическая характеристика солеустойчивого
клеточного клона 278
Характеристика растений, полученных путем клеточной
селекции на среде с NaCl 285
Реакция на засуху растений, полученных из клеточных
клонов, устойчивых к ПЭГ 293
Заключение 310
Выводы 314
Литература. 317
Введение к работе
Индуцируемая; культивированием тканей in vitro и проявляющаяся у
растений-регенерантов изменчивость получила определение
«сомаклональной изменчивости», а измененные растения были; названы сомаклонами или сомаклональными вариантами. Сомаклональная изменчивость обнаружена- у регенерантов большинства; исследованных видов растений;.Описаны сомаклональные вариации по морфологическим; и биохимическим признакам, физиологическим параметрам. Изменения происходят как в ядерной, так и в хлоропластной и митохондриальной ДНК, встречаются растения-регенеранты с крупными перестройками генома и с точковыми мутациями [Скаукрофт, 1990];
Индуцированная in vitro изменчивость позволяет существенно повысить генетическое разнообразие исходного материала, благодаря чему представляет большой интерес для селекции новых сортов растений. Вместе с тем, возникающие при культивировании тканей in vitro неконтролируемые мутации являются нежелательными при микроклональном размножении или генетической инженерии. Поэтому очень важно знать закономерности сомаклональной изменчивости и уметь ее регулировать.
В настоящее время установлено, что дедиференциация при введении тканей в культуру in vitro и редифференциации при регенерации растений,
а также культивирование клеток на искусственных питательных средах оказывают существенное влияние на стабильность генома и характер экспрессии- генов. Накоплено много данных по вариабельности морфологических признаков; а также числа и структуры хромосом у растений-регенерантов;[D'Amato,„ 1985; Каїр, 1995]. Высказан ряд гипотез о происхождении і сомаклональных вариаций [Yeoman, 1981; Phillips et al., 1994]. B^ меньшею степени; сомаклональная изменчивость исследована на молекулярном уровне [Goodwin et al., 1997; Гостимский и др., 1999]. Несмотря на< активное исследование; открытыми остаются вопросы о влиянии условий культивирования клеток на частоту сомаклональной изменчивости, о соотношении среди сомаклональных вариаций мутаций и изменений негенетической; природы, о стабильности сомаклональных вариантов, о реализации на« фенотипическом уровне хромосомных аберраций или изменений ДНК. Неясно, отличается ли сомаклональная изменчивость по частоте и спектру изменений от классического мутагенеза у целых растений, какие признаки сильнее подвержены вариабельности в условиях in vitro. Из-за использования разными авторами разных видов растений и разных способов изучения трудно оценить характер сомаклональной изменчивости в целом.
Препятствием к широкому использованию культивируемых клеток в селекции являются трудности, возникающие при регенерации растений. До сих пор не выработаны общие подходы к регуляции морфогенеза in vitro,
*/
из-за чего для каждого вида и даже сорта условия регенерации растений приходится подбирать эмпирически.
Кукуруза, выбранная в качестве объекта изучения сомаклональной изменчивости, является важной сельскохозяйственной культурой, она хорошо охарактеризована с точки: зрения физиологии и генетики. Составлены подробные генетические карты хромосом кукурузы. Вместе с тем, генетическое разнообразие существующих сортов; этой культуры очень ограничено. Мировой банк зародышевой; плазмы кукурузы представлен, главным образом, формами тропического происхождения, неадаптированными к длинному световому дню и короткому вегетационному периоду умеренных широт [Earle, Kuehnle,1990]; Поэтому актуальным является создание новых форм; растений, сочетающих высокую продуктивность с экологической пластичностью. Ускорить и облегчить процесс селекции призваны новые методы создания исходного селекционного материала, в том числе, сомаклональная изменчивость и клеточная селекция.
Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей сомаклональной изменчивости и оценка возможности ее использования для создания растений кукурузы, толерантных к неблагоприятным условиям окружающей среды.
В задачи исследования входили:
разносторонняя характеристика сомаклональнои изменчивости кукурузы, включающая оценку на морфологическом, физиологическом, биохимическом, хромосомном и молекулярном уровнях;
исследование роли генотипа и экзогенной регуляции в обеспечении способности клеток к морфогенезу in vitro и выявление факторов, повышающих эффективность регенерации растений;
разработка селективной системы и отбор среди сомаклональных вариантов растений кукурузы, толерантных к абиотическим стрессам (засухе, засолению, неблагоприятным температурам).
