Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Молекулярный генетический анализ 7
1.1.1. Полиморфизм рандомизированно амплифицированной ДНК
1.1.2. Полиморфизм простых повторов ДНК 22
1.1.3. Молекулярное маркирование генов пшеницы 28
1.2. Фенотипическое описание видов, разновидностей и сортов пшениц возделываемых в Таджикистане
1.2.1. Пшеница мягкая- Triticum aestivum L. 33
1.2.2. Пшеница твердая - Triticum durum Desf. 57
1.3. Природно-климатическая характеристика различных регионов Таджикистана
Глава 2. Материал и методы
2.1. Объекты исследования 62
2.2. Биохимические методы исследования 63
2.2.1. Выделение ДНК из проростков пшеницы 68
2.2.2. Полимеразная цепная реакция 69
2.2.3. Электрофорез ДНК и ПЦР-продуктов в агарозном геле 69
2.2.4. Анализ продуктов ПНР в ПААГ 70
2.2.5. Статистическая обработка полученных результатов 70
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1 Генотипирование видов пшеницы произрастающих в Таджикистане
3.1.1. Геномный анализ по RAPD маркерам 72
3.1.2. SSR - генотипирование различных сортов пшеницы 86
Заключение 96
Выводы 101
Приложение 1 104
Приложение 2 109
Список использованной литературы 114
- Полиморфизм рандомизированно амплифицированной ДНК
- Фенотипическое описание видов, разновидностей и сортов пшениц возделываемых в Таджикистане
- Биохимические методы исследования
- Геномный анализ по RAPD маркерам
Введение к работе
Актуальность темы. Мировые генетические ресурсы растений рассматриваются во всем мире как основной источник улучшения сельскохозяйственных культур на ближайшие десятилетия. Создание источников и доноров селекционно-важных признаков в большинстве случаев базируется на мировых генетических ресурсах или коллекциях культивируемых растений и их диких сородичей (Гончаров, 2002). В эффективности познания и использования генофонда важнейшая роль принадлежит методам исследования. Развиваемые молекулярно-биологические исследования ориентированы на решение теоретических и прикладных проблем интродукции, хранения, воспроизведения, идентификации, регистрации и паспортизации генетических ресурсов растений. Особое внимание должно быть уделено разработке эффективных методов для использования в сортоиспытании, селекции, семеноводстве и семенном контроле.
В настоящее время в области сравнительной генетики пшеницы интенсивно проводятся эксперименты с использованием молекулярных маркеров. Молекулярное маркирование (ММ) или генотипирование основано на полиморфизме, свойственным белкам и нуклеиновым кислотам. В результате таких исследований либо строятся практически лишенные функциональных генов карты, либо проводится «сравнительная привязка» того или иного гена разных видов к одним и тем же молекулярных маркерам (Конарев, 2002).
Считается, что стародавние сорта и местные формы сельскохозяйственных растений в результате длительного естественного и искусственного отбора лучше других приспособлены к локальным условиям произрастания и отличаются оптимальной для данной местности длиной вегетационного периода. Изучение местных сортов важно для геногеографических исследований, так как позволяет не только получить представление об основных характеристиках аборигенного материала того или иного вида, но и восстановить его филогенетические связи.
Важнейшей характеристикой популяций служит их внутрипопуляционная генетическая изменчивость (полиморфизм) по дискретным качественным и количественным признакам. С использованием ДНК-маркеров связаны реальные практические достижения в идентификации и регистрации сортов важнейших сельскохозяйственных культур, в семеноводстве и семенном контроле.
Использование ДНК-маркерных технологий привлекает исследователей прежде всего возможностью работать с самим носителем наследственной информации. В работах многих исследователей последних лет справедливо отмечается, что разные ДНК-маркерные системы (в первую очередь, наиболее доступные, такие как RFLP, RAPD, AFLP) достаточно широко и эффективно используются для выяснения* степени родства (или генетических связей) на внутривидовом и межвидовом уровнях(Ьш, Tsunewaki, 1991; Mcintosh et al., 1998; Khlestkina, Salina, 2001). Так, например, все проблемы идентификации и регистрации сортов (и генетических ресурсов растений, в целом), практические - проблемы рациональной организации коллекций планируется решать исключительно с использованием ДНК-маркеров.
Цель и задачи работы. Цель работы - молекулярное маркирование ДНК стародавних и современных сортов рода Triticum L., собранных в различных природно-климатических регионах Таджикистана, а также идентификация их на основе молекулярного анализа генома.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. сбор семенного материала различных стародавних и современных сортов пшеницы, их фенотипическое описание; 2". использование молекулярных маркеров на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа генетической вариабельности отобранных сортов и разновидностей мягкой пшеницы; использование RAPD - маркеров для геномного анализа стародавних и современных сортов мягкой пшеницы Таджикистана; использование SSR - маркеров (микросателлитов) для выявления полиморфизма ДНК сортов и разновидностей пшеницы; определение генетического расстояния между сортами и разновидностями пшеницы и построение дендрограмм для выявления генетического сходства на основе геномного анализа.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые с использованием различных молекулярных маркеров проведен комплексный анализ стародавних и современных сортов пшеницы, выращиваемых на территории Таджикистана. На основе полученных данных определены уровни внутривидового полиморфизма и показаны различия по геномной вариабельности у всех изученных сортов. Полученные данные сопоставлены с данными о фенотипической изменчивости стародавних сортов пшеницы (Удачин, 1975). У исследованных стародавних сортов пшеницы выявлен внутривидовой полиморфизм по всем использованным молекулярным маркерам и это свидетельствует об информативности данных маркеров. Впервые был проанализирован полиморфизм ДНК у стародавних сортов, выращиваемых на разных высотах над уровнем моря и в разных почвенно-климатических условиях Таджикистана. Полученные данные указывают на степень геномного полиморфизма стародавних и современных сортов и представляют интерес, так как могут использоваться в селекции как доноры хозяйственно-ценных признаков. В связи с этим практическую значимость имеют результаты, касающиеся изменчивости генов, ответственных за устойчивость к различным заболеваниям и неблагоприятным факторам среды. Подобранные нами методы и праймеры позволяют эффективно выявлять внутривидовую изменчивость у сортов и могут быть использованы в дальнейших селекционных исследованиях. Полученные результаты можно использовать для улучшения сортов сельскохозяйственных культур с применением методов молекулярных маркеров.
Полиморфизм рандомизированно амплифицированной ДНК
В 1985 году в области молекулярной генетики появляется новый метод - полимеразная цепная реакция (ПЦР), - позволяющий амплифицировать in vitro любой участок геномной ДНК, для которого известна первичная структура фланкирующих (праймерных) районов (Saiki et al., 1985). В 1990 году одновременно две группы исследователей предлагают амплифицировать безымянные последовательности ДНК, используя вместо пары специфических праймеров один праймер с произвольной последовательностью (Welsh, McClelland et al., 1990; Williams et al., 1990).
Праймеры с произвольной последовательностью короче специфических (10-11 п.н. вместо 19-23), оптимальная температура отжига их с матрицей ДНК составляет 37С. Разработанный метод получил название RAPD-анализа. Его основные этапы схематически изображены на схеме 1, а краткая характеристика в таблице 1. Для RAPD-анализа требуется в сотни раз меньшее количество ДНК, чем для RPLP-анализа. Хотя об амплифицированных последовательностях ничего не известно (если не проводить дополнительные исследования с помощью гибридизации, клонирования и т.д.), наличие сходства или отличия RAPD-фрагментов при сравнении ДНК отдельных форм, позволяет использовать их в качестве ДНК-маркеров. Этот метод привлекателен относительно низкими затратами на необходимые материалы и оборудование и быстротой проведения анализа, кроме того, он не требует применения радиоактивной метки. Для амплификации неизвестных последовательностей ДНК не требуется предварительного клонирования, секвенирования и т.д. Однако низкая температура отжига праймера с матрицей создает зависимость получаемого результата от условий проведения ПЦР-реакции (Penner, 1995; 1996). Изменение концентрации ионов магния в реакционной смеси, использование ДНК-полимеразы, полученной из разных источников, или разных приборов для амплификации ДНК, приводит при попытке воспроизвести результат, к исчезновению в ПЦР-спектре одних фрагментов и появлению других. Кроме того, G+C состав праймеров G+C может влиять на результат амплификации (Fritsch et al., 1993), однако исследования T.R. Sharma и S Jana (1995, 2002) не показали зависимости между G+C составом праймеров и количеством амплифицируемых полос. Наличие минорных RAPD-фрагментов, которые в последствии не воспроизводятся, может быть обусловлено образованием искусственных гетеродуплексов или неспецифической амплификацией при неполной гомологии праймера с матрицей (Ни, Quiros, 1991; 1997). Несовершенство RAPD-анализа заключается также в том, что последовательности одинаковой длины могут быть полиморфны по структуре. Поэтому надежность полученных с помощью RAPD-анализа результатов, как правило, подкрепляется либо 2-3-кратным воспроизведением результатов, либо кросс-гибридизацией фрагментов (Devos, Gale, 1992; 1993; 1994; Khlestkina, Salina, 2001), либо клонированием интересующей RAPD-последовательности в составе плазмиды, дальнейшего ее секвенирования и использования в ПЦР со специфическими праймерами-(Penner, 1996). Поскольку источником полиморфизма RAPD-фрагментов являются, вероятнее всего, точечные замены, затрагивающие сайты отжига праймера, то собственно полиморфизм выражается в присутствии или отсутствии ПЦР-фрагментов. Поэтому в подавляющем большинстве случаев имеет место доминантный тип наследования RAPD-маркеров. Наличие сходства или отличия RAPD-фрагментов при сравнении ДНК отдельных организмов, гибридных линий, сортов, видов и т.д., может быть использовано в филогенетическом анализе, и в эволюционных исследованиях, и для получения маркеров, тесно сцепленных с генами. Интенсивно идут работы по идентификации RAPD-продуктов, чему способствует сочетание этого метода с методом переноса по Саузерну (Maniatis et al., 1982; Wallace, 1983) и последующей гибридизацией с избранным праймером (Мазин, 1990; Дрейпер, 1991). Среди продуктов амплификации представлены, по-видимому, все типы ДНК: уникальные гены, средние и высокие повторы (Сулимова, 1991; 1993; 1995; Бебихов, 1993; Гвоздев, 1993; Малышев, 1997; Алтухов, 1998; 2002; Гостимский, 1999; Гречко, 2002; Жимулев, 2002), причем, например, в ДНК сои из, 11 исследованных фрагментов шесть получены с уникальных генов, а три и два с указанных повторов, соответственно. В другой работе на растениях амплифицируемые фрагменты были получены в основном с повторяющихся последовательностей. Очевидно, что среди RAPD-фрагментов можно ожидать появления любых локусов, в зависимости в основном от специфики праймера (Гречко, 2002) и количества повторяющейся ДНК в геноме. Надежность RAPD-анализа можно повысить, используя случайные праимеры попарно. Однако подобные исследования на пшенице не показали эффективного увеличения полиморфизма (Penner, 1996). Отсутствие кросс-гибридизации продуктов, полученных при использовании одного и того же праймера при анализе различных таксономических групп, показывает, что повторяющиеся последовательности очень разнообразны. Эти наблюдения ведут к заключению, что в геноме пшеницы повторяющиеся-. последовательности включены во многие сайты. Разработан подход по трансформации RAPD-последовательностей в специфические ПЦР-ампликоны (SCARs - sequenced characterized amplified regions амплифицированные регионы, характеризуемые последовательностью), при котором обеспечивается высокая воспроизводимость и надежность результатов.
Области применения RAPD-анализа: (1) получение молекулярных маркеров, сцепленных с агрономически важными признаками; (2) поиск различий между видами и сортами; (3) определение полиморфизма между и внутри популяций; (4) изучение полиморфизма и картирование генов; (5) филогенетические исследования. С помощью RAPD-анализа были составлены геномные карты для целого ряда растений: Arabidopsis, Eucalyptus grandias, Е. urophila, Heliantus anomalis, Soybean, Vicia faba (Малышев, Картель, 1997). Данный метод оказывается незаменимым для составления молекулярно-генетических карт многих растений, для которых, в виду большого размера генома, трудоемкий RFLP-анализ не очень приемлем, например, хвойные деревья (Penner, 1996), использование RAPD-анализа для картирования злаков оказалось затруднено, так как RAPD-маркеры плохо интегрируются в уже существующие RFLP-карты. У мягкой пшеницы, очевидно из-за большого размера полиплоидного генома, наблюдается, по сравнению с другими злаками, низкий межсортовой полиморфизм RAPD-маркеров. Поэтому работы по поиску RAPD-маркеров для пшеницы, тесно сцепленных с генами, не так эффективны, как, например, для ячменя и других злаков (Gupta et al., 1999). Тем не менее, ряду авторов, удалось повысить эффективность подобных исследований за счет использования денатурирующих гелей, в которых RAPD-фрагменты разделяются с более высокой точностью, чем в. общепринятом для RAPD-анализа агарозном геле. Таюке, с помощью RAPD-анализа могут быть получены хромосомспецифичные маркеры (Devos, Gale, 1993; 1994).
Фенотипическое описание видов, разновидностей и сортов пшениц возделываемых в Таджикистане
Семейство Poaceae Barnhart., род Triticum L., вид Triticum aestivum L. -Фляксбергер К.А. 1935г., Жуковский П. М., 1971г., Дорофеев В.Ф. и др. 1987г. Биология и морфология. Гексаплоид 2гг=42. Однолетнее травянистое растение высотой 60-180 см. Корневая система мочковатая. Различают зародышевые, колеоптильные и узловые корни. Зародышевые корни появляются при прорастании семени, колеоптильные - из подземного колеоптильного узла. Вместе они составляют первичную корневую систему, проникающую на большую глубину, но сравнительно мало разветвляющуюся в верхних слоях почвы. Узловые корни появляются из подземных сближенных узлов главного и боковых побегов и располагаются в верхних слоях почвы. В благоприятные годы питание растения в значительной степени происходит за счет узловых корней. В засушливые годы они развиваются плохо или совсем не образуются. Растение получает воду и минеральные вещества только за счет первичной корневой системы. Подземные сближенные узлы представляют собой зону кущения или узел кущения (Синская, 1969). В пазухах соответствующих этим узлам, образуются, боковые побеги. Большое значение имеет глубина залегания узла кущения. Чем она меньше, тем в условиях достаточного увлажнения интенсивнее кущение, но и тем сильнее влияние засухи и слабее морозостойкость. Стебель разделен на узлы и междоузлия, полый или заполненный рыхлой паренхимной тканью. Листья состоят из влагалища, охватывающего стебель, и линейной листовой пластинки. В месте отгиба листовой пластинки имеется язычок (лигула), защищающий внутреннюю часть влагалища от дождевой воды (встречаются безлигульные формы). Нижней частью влагалище прикрепляется к основанию стеблевого узла, образуя над ним утолщение - листовой узел. Соцветие - сложный колос. Он состоит из колосового стержня и колосков, сидящих на его выступах. Каждый колосок имеет 2 колосковые чешуи и 3-4 цветка. Число развитых цветков в колоске может достигать 5-6. Наиболее развитые колоски расположены несколько ниже середины колоса. В основании колоса обычно имеются 1-2 недоразвитых колоска. Самые развитые цветки в колоске первый и второй. Верхние цветки в колоске недоразвитые, они не дают зерна. Цветок состоит из наружной и внутренней цветковых чешуи, пестика с двумя перистыми рыльцами, трех тычинок и двух пленок в основании цветка -лодикул. Во время цветения лодикулы набухают и раздвигают цветковые чешуи. Плод - зерновка (Дорофеев и др., 1987). Масса 1000 зерен 20-50 до 70 г. Пшеница мягкая чрезвычайно полиморфна. Встречаются озимые и полуозимые и яровые формы. Всходы наиболее холодостойких сортов способны переносить кратковременные понижения температуры воздуха весной до -10 С. Критическая температура на глубине узла кущения у наиболее морозостойких форм озимой пшеницы близка к -18 С. За период вегетации для озимой пшеницы необходима сумма среднесуточных температур воздуха около 2100 С. Культура довольно требовательна к обеспечению влагой, особенно в период выхода в трубку - налива зерна. Засуха значительно снижает урожайность зерна. Вегетационный период составляет 45-50 суток осенью (развиваются вегетативные органы) и 75-100 суток весной и летом (формируются генеративные органы и растение вступает в плодоношение). Большинство сортов реагируют на короткий день увеличением периода вегетации, хотя встречаются и формы нейтральные к длине дня. Самоопылитель. Перекрестное опыление возможно потому, что большинство цветков цветет, открыто (хазмогамно). Цветение начинается в средней части колоса и распространяется к его основанию и верхушке. Первыми цветут нижние цветки колосков. Затем вторые и т.д. Цветение колоса при умеренно теплой погоде продолжается 3-4 дня. Оно подчинено определенному ритму и начинается в 5-6 часов утра. Максимум в средней зоне наступает в 8-10 часов, затем наблюдается спад, после чего отмечают второй максимум и постепенное затухание цветения. Чем жарче климат, тем раньше наблюдается первый максимум и позже - второй (когда жара спадает). Единичные цветки открываются ночью. В пасмурную прохладную погоду ритм цветения сглажен (Фляксбергер, 1935., Дорофеев и др. 1987). Клейстогамно цветут цветки высокого порядка 4-5-й в колоске (Цвелев, 1976). Родина мягкой пшеницы - Закавказье и страны Средней Азии. В Турции, Иране, Ираке, Сирии, Туркменистане в культуре с 7-6 тысячелетия до нашей эры, в странах Западной Европы - с 6-2 тысячелетия до нашей эры, на Северном Кавказе - с 1 тысячелетия до нашей эры, на территории Белоруссии и Прибалтики - с 4-5 века нашей эры (Вавилов 1964, Синская 1969). В Южную Америку интродукцирована в 1528 году, на территорию США - в 1602 году, в Канаде ее возделывают с 1802, а в Австралии - с 1788 годов. Ареал охватывает все земледельческие районы мира. На севере граница ее возделывания доходит до 66 северной широты (в Швеции). На юге она доходит до южных границ Австралии, Южной Америки, Африки. Преимущественно степная культура. В Европе она занимает главным образом зоны степи и лесостепи, в Северной Америке - прерии, в Южной Америке (Аргентина) - пампу. В предгорных районах выращивают на высоте до 4000 м. (Дорофеев и др., 1987)
Пшеница играет ведущую роль в мировом земледелии, занимая первое место по площади посева и валовому сбору зерна. Основная продовольственная культура. Зерно перерабатывают на муку (для производства хлебобулочных и кондитерских изделий), крупу и другие продукты, используют для приготовления» комбикормов. Наибольший выход муки дают сорта с крупным зерном округлой формы и неглубокой бороздкой. По хлебопекарным качествам у пшеницы мягкой выделяют сорта сильной пшеницы (твердозерной), средней силы (филеры) и слабой.
Мягкие пшеницы можно разделить на два подвида: 1) ирано-азиатский подвид 2) индоевропейский подвид. 1. Подвид irano - asiaticum. Flaksb. (Фляксбергер, 1935) Колосья грубые, жесткие, не осыпающиеся и вообще построение всего растения грубо-жесткое. Ирано-азиатский подвид пшеницы объединяет пшеницы грубой или полугрубой структуры, главным образом, остистые и реже безостые. К этому подвиду относится ряд групп (пролес) или подгрупп. В Таджикистане все местные аборигенные формы пшеницы относятся к ирано-азиатскому подвиду (Сухобрус, 1951). Ниже помещаем характеристики тех групп (пролес) или подгрупп, которые встречаются в Таджикистане. а. Пролес rigidum Vav. (Вавилов, 1964)
Колосья грубого жесткого построения, с грубыми, ломкими, короткими остями, легко обламывающимися, утолщенными к основанию зерном, плотно закрытым чешуями, трудно обмолачивающимся, часто неправильно расположенными колосками, с колосковыми чешуями, образующими обыкновенно выемку в виде угла между килевым зубцом и зубчиком, который является продолжением бокового нерва; колосковый зубец почти всегда длинный (более 7 мм), нервация чешуи и киль хорошо развиты, нервы покрыты зубчиками, зерно стекловидное и полустекловидное.
В Таджикистане эта группа преобладает в посевах северных засушливых районов, где количество осадков не превышает 400 мм. Представителем группы является хозяйственный местный сорт «Сафедак стекловидный» (Сухобрус, 1951).
Биохимические методы исследования
ДНК пшеницы выделяли, согласно описанной ранее (Plaschke et al., 1996) модифицированной методике, удобной при необходимости анализа большого числа образцов, в частности популяций растений. При этом ДНК популяций выделялась из 6-8 индивидуальных растений. В чашки Петри на достаточно увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу высаживали по 8 зерновок пшеницы. Для предотвращения роста грибов чашки Петри перед высадкой семенного материала стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин. при давлении в 1 атм. Зерновки обеззараживали, выдерживая их в течение 3-5 мин. в 5% растворе диацида с последующей промывкой в трех сменах стерильной дистиллированной воды. После высадки семенного материала чашки закрывали, нумеровали и помещали в термостат при 28С, на 2-3 недели следя за достаточной увлажненностью содержимого чашек. Все операции фиксировали в журнале. Из 50-100 мг свежей зеленой массы (листья 2-3 недельных проростков) помещали в пробирку эппендорф на 1.5 мл, добавляли 200 мкл буфера [100 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 500 мМ NaCl; 50 мМ ЭДТА; 1.25 % SDS; 3.8 % Na2S205], измельчали с помощью гомогенизатора. Добавляли 500 мкл буфера [100 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 500 мМ NaCl; 50 мМ ЭДТА; 1.25 % SDS; 3.8 % Na2S205], инкубировали на водяной бане при 60С в течение 30 минут. Добавляли 700 мкл смеси хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1), перемешивали и центрифугировали в течение 15 минут при 12000 об/мин. Для высаживания ДНК к водной фазе добавляли 1.4 мл «холодного» (-20С) 96 % этанола. Центрифугировали в течение 10 минут при 12000 об/мин. Осадок промывали 3-4 раза 70% этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ [ЮмМ трис- НС1, рН 8.0; 1мМ ЭДТА].
При использовании произвольных праймеров в стерильных условиях готовили смесь, содержащую 1/10 объема Юхбуфера (500мМ КС1, 100 мМ Трис- НС1 (рН 8.3) и 15 мМ MgCl2), 0,8 мМ дНТФ, 1мкМ произвольного праймера, 1 единицу активности (ед.акт.) Taq-полимеразы, 25 нг геномной ДНК и Н20 ( до общего объема 25 мкл).
Реакционную смесь в пробирке покрывали каплей вазелинового масла. Пробирку помещали в амплификатор. Режим реакции: денатурация при 94 С 1 мин, 40 циклов - денатурация 94С 1 мин, отжиг праймера 37С 1 мин, элонгация 72С 2 мин. SSR-анализ
В стерильных условиях готовили смесь, содержащую 1/10 объема Юхбуфера (500мМ КС1, 100 мМ Трис- НС1 (рН 8.3) и 15 мМ MgCl2), 0,8 мМ дНТФ, 0,5 мкМ праймера R, 0,5мкМ праймера L, 1 единицу активности (ед. акт.) Taq-полимеразы, 0.1-2 нг ДНК и Н20 (до общего объема 25 мкл). Реакционную смесь в пробирке покрывали каплей вазелинового масла. Пробирку помещали в амплификатор. Режим реакции: денатурация при 94С 1 мин, 45 циклов - денатурация 94С 1 мин, отжиг праймера 50С, 55С, 60С (температура отжига зависит от структуры праймера) 1 мин, элонгация 72С 2 мин.
Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР со случайными праймерами использовали 0,6-1 % гель, приготовленный на ТАЕ-буфере [40 мМ Трис-HCl рН 8.0, 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА] с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0.01 мкг/мл. Образцы, содержащие 0,3-0,5 мкг ДНК наносили в карманы геля по 10 мкл с добавлением 5 % глицерина, 0.05% бромфенолового синего и 0.05% ксиленцианола. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали гидролизат ДНК фага А,. Электрофорез вели при напряжении электрического поля 3-7 вольт/ см в течение 2-3 часов.
Разделение продуктов амплификации, полученных с праймерами к SSR--последовательностям, проводили в 10 % и 5 % ПААГ, соответственно. Толщина геля составляла 1.5 мм. 5-10% полиакриламидный гель ( с 1/30 частью бисакриламида) готовили на ТБЕ-буфере [0.05М трис, 0.05М раствор борной кислоты, 0.002М ЭДТА]. Гель полимеризовали, добавляя 0.08 % персульфат аммония и 0.67 мМ ТЕМЕД (N, N, N, N тетраметилэтилендиамин). Предэлектрофорез вели при напряжении 3-7 вольт/ см в течение 1-2 часов. Наносили в карманы геля по 25 мкл реакционной смеси с добавлением 2мМ Трис-ацетата (рН 8.1), 2.5мМ ацетата натрия, 2мМ ЭДТА, 0.02 % SDS, 7 % глицерина, 0.06% бромфенолового синего, 0.6% ксиленцианола. Электрофорез вели при напряжении 3-10 вольт/ см в течение 6-20 часов. Гель окрашивали в растворе бромистого этидия (5 мкг/ мл) в течение 20 минут, затем отмывали в дистиллированной воде в течение 20 минут и фотографировали в УФ-свете. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали гидролизат ДНК фага А,.
Документирование электрофоретического разделения продуктов ПЦР После электрофореза гель помещали в камеру с УФ — освещением и затем фотографировали в УФ-свете на аппарате BioDoc. Статистический анализ проводился на основе составления бинарных матриц по каждому из праймеров, в которых отмечалось «присутствие» (1) или «отсутствие» (0) фрагментов с одинаковой молекулярной массой на электрофореграмме. Каждый ПЦР-фрагмент рассматривался как отдельный генетический локус. Характер и степень изменчивости RAPD, SSR-маркеров анализировали в отношении праймера и образца. На основании суммарной матрицы RAPD и SSR-спектров с помощью программного пакета NTSYS рс V.2/11Q были определены генетические дистанции между исследуемыми образцами. Для построения дендрограммы, демонстрирующей филогенетические отношения между изученными образцами по результатам RAPD, SSR-анализа, применили метод невзвешенного парно-группового кластерного анализа с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием программы NTSYS рс V.2/11Q.
Геномный анализ по RAPD маркерам
Экспериментальная работа по RAPD - маркированию пшениц была разделена на два этапа. На первом этапе экспериментов RAPD -маркированию подвергались только местные стародавние сорта мягких пшениц. Второй этап состоял в RAPD - маркировании всех сортов и разновидностей пшениц вовлеченных в эксперименты. Такой порядок экспериментальных исследований был выбран исходя из того, что по известным опубликованным данным, выявленный внутривидовой полиморфизм по RAPD - маркерам находился на уровне, не позволяющем четко дифференцировать и идентифицировать исследованные образцы. Задачей являлся отбор из различных семейств и большого разнообразия ДНК- маркеров, позволящих четко различать изученные сорта и генотипы.
На первом этапе материалом для исследования служили 14 стародавних местных сортов и два сорта современной селекции мягкой пшеницы (Triticum aestivum, геном AABBDD - гексаплоид), полученные из коллекции Института земледелия Таджикской Академии сельскохозяйственных наук и коллекции Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан.
Для расширенного анализа, который являлся вторым этапом исследований были отобраны 14 стародавних местных сортов мягких пшениц, два местных сорта современной селекции (Навруз и Хуросон), один сорт твердой пшеницы (AMP) и 15 сортов мягкой пшеницы современной селекции, в процесс выведения которых вовлекались зарубежные сорта (табл. 2). Для генотипирования был выбран 21 RAPD - маркер (олигонуклеотидные праймеры).
При проведении RAPD-ПЦР были использованы 17 эффективных произвольных праймеров (табл. 6), с помощью которых оценивали межсортовое и внутривидовое генетическое разнообразие Triticum aestivum. У изученных сортов по таким фенотипическим признакам, как окраска зерна, окраска колоса и остей, остистось колоса, окраска чешуи наблюдалось внутривидовое разнообразие (табл. 7). При электрофорезе основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 2000-200 п.н. В целом, учитывалось 273 амплифицированных фрагментов, от 12 до 23 (в среднем 16) на один RAPD - праймер. Из 273 ПЦР - фрагментов 150 (55%) были полиморфны у изученных генотипов, 123 фрагмента (45%) имели одинаковую длину у всех изученных образцов. Самый высокий процент полиморфных RAPD - фрагментов - 14 из 16 (87%) был получен при амплификации ДНК с праймером R158. В то же время в случае RAPD -праймера 039 только 4 из 16 (25%) фрагментов были полиморфны (рис.3). Этот праймер выявил наименьшее количество полиморфных локусов.
Уровень полиморфизма, выявляемый при амплификации геномной ДНК с использованием остальных праймеров, имел промежуточное значение. С использованием всех праймеров в различных соотношениях установлено наличие как мономорфных, так и полиморфных фрагментов у исследуемых образцов.
Мономорфные фрагменты могут считаться RAPD-маркерами для представителей вида. Чем больше генетическая дистанция между исследуемыми видами, тем меньше у них общих продуктов амплификации. Выявляемые при электрофорезе мономорфные полосы у различных сортов предполагают общность структурно-функциональной организации их геномов. Каждый из сортов имел свой определенный набор амплифицируемых RAPD - продуктов, отличающийся от других количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности. Некоторые праймеры выявили присущие только одному конкретному сорту ампликоны и, следовательно, являются сортоспецифичными. Число суммарных зон, полученных при амплификации ДНК 16 изученных сортов пшеницы с каждым из праймеров, варьирует от 12 до 23. Отмечены существенные различия по количеству RAPD-фрагментов между изученными сортами. Исследуемые образцы различались также по числу уникальных, характерных только для одного сорта ампликонов.
В случае использования праймера RAPD 158 выявлено всего 16 ПНР -фрагментов длиной в пределах от 150 до 1900 п.н. При амплификации ДНК 16 образцов T.aestivum с данным праймером 14 ПНР - фрагментов длиной около 1850, 1800, 1200, 1000, 950, 900, 840, 760, 740, 700, 650, 500, 320 п.н. являлись не полиморфными. RAPD - фрагмент длиной около 820 п.н. присутствует только у 17 образца (Хуросон, местный сорт T.aestivum), а фрагмент длиной около 390 п.н. отсутствует только у 10 образца (Содирас, белый колос.) сорт T.aestivum из Афганистана.. Эти фрагменты являются полиморфными, то есть выявляют внутривидовой и межсортовой полиморфизм.
По этим данным уровень внутривидового и межсортового RAPD-полиморфизма составляет 2-8 %, что объясняется преимущественно доминантным типом наследования этих маркеров. Для количественной оценки RAPD - полиморфизма и определения уровня дивергенции между изученными генотипами полученные данные были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в RAPD - спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно.
