Введение к работе
Актуальность темы. Оксигенный фотосинтез и аэробное дыхание - два фундаментальных процесса, обеспечивающих энергией клетки растений. Оба эти процесса связаны с окислительно-восстановительными превращениями молекулярного кислорода, в ходе которых, с одной стороны, происходит запасание энергии, с другой, постоянное образование активных форм кислорода (АФК) (Karappanapandian et al., 2011).
Для модулирования таких кислород-зависимых процессов в растениях могут быть использованы кислород - переносящие белки - гемоглобины (Гб) (Bulow et al., 1999). Они широко распространены в природе и обнаружены у представителей всех царств живых организмов (Weber, Vinogradov, 2001). Растительные Гб делятся на две группы - симбиотические и несимбиотические Гб, различающиеся сродством к кислороду. Симбиотические гемоглобины (леггемоглобины, Лг) синтезируются в клубеньках бобовых растений и служат для переноса кислорода, необходимого для дыхания бактероидов, вместе с тем поддерживая концентрацию Ог на безопасном для нитрогеназы уровне. Наиболее изученным представителем этого семейства является леггемоглобин А сои, накапливающийся в больших количествах в инфицированной ткани и обладающий очень большим сродством к кислороду (Smagghe et al., 2009).
В последнее десятилетие представления о функциях симбиотических Гб расширились. Кроме транспортной функции, Лг может участвовать в модулировании NO сигнала, защите от окислительного и нитрозативного стресса. Так, есть данные, что Лг, вместе с несимбиотическими Гб может эффективно снижать содержание NO в клубеньках (Shimoda et al., 2005; Baudouin et al., 2006). Кроме того, показано, что Лг может переносить кислород и к митохондриям растений, т.е. оказывать влияние на интенсивность дыхания (Suganuma et al., 1983).
Основной функцией для большинства несимбиотических Гб является защита от разнообразных неблагоприятных факторов, в тоже время участие симбиотического Гб в метаболизме растения в неблагоприятных условиях, в частности, в условиях окислительного стресса, мало изучено. Другими словами, представляет интерес изучение влияния экспрессии гена Лг на основные кислород-зависимые процессы в растении, не только при нормальных условиях, но и при внесении в среду источника оксида азота (II) и токсических концентраций тяжелых металлов.
Целью работы явилось изучение влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост, кислородный обмен и антиоксидантное состояние тканей трансформированных растений в норме и при стрессе.
Задачи
Клонирование кодирующей области гена леггемоглобина А сои под управлением 35S промотора вируса мозаики цветной капусты в векторе рСатЬіаІЗОІ.
Получение трансгенных «бородатых» корней на растениях рапса и их использование в качестве модельной системы с целью проведения поисковых исследований и предварительного анализа наличия влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост и устойчивость растений к повреждающему действию кадмия.
Создание трансгенных растений табака путем агробактериальной трансформации.
Исследование влияния экспрессии гена Лг А сои на рост, кислородный и энергетический обмен трансгенных растений.
5. Изучение изменения антиоксидантного состояния (содержания
конечных продуктов ПОЛ, показателей активности ферментов
антиоксидантной защиты) под влиянием источника экзогенного N0
(нитропруссида натрия) и солей кадмия у трансформированных и
^трансформированных растений табака.
Научная новизна. Получены трансгенные по гену Iba леггемоглобина А сои растения табака. Впервые изучено влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток не только в нормальных условиях, но и при внесении источника экзогенного N0 и окислительного стресса. Впервые показана повышенная устойчивость трансгенных растений к повреждающему действию кадмия, на фоне некоторого снижения скорости роста.
Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о функциях леггемоглобина. Впервые показано влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток.
Обнаружено, что трансгенным растениям свойственна более высокая устойчивость к повреждающему действию солей кадмия, по сравнению с ^трансформированными растениями. Поскольку эти результаты связаны не со специфическими факторами защиты, такими как фитохелатины, которые из-за недостаточной прочности комплексов с металлами и специфичности образования, не всегда могут играть существенную роль в детоксикации тяжелых металлов, экспрессия гена леггемоглобина может способствовать повышению устойчивости растений к широкому спектру загрязнителей. Создание трансгенных растений, способных расти при достаточно высоких концентрациях ТМ в почве, позволит проводить фиторемедиацию
промышленно загрязненных районов, а также найдет применение в цветоводстве, ландшафтном дизайне и других областях, где в первую очередь имеет значение устойчивость растений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2009), симпозиуме «Растение и Стресс» (Москва, 2010), VII съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).
Публикации. Основные результаты работы изложены в 12 печатных изданиях, из них 3 - из входящих в перечень ВАК.
Структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 30 рисунков, 2 таблицы. Состоит из введения, части I (Обзор литературы), части II (Описания методов исследования), части III (Результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника.
