Введение к работе
Актуальность проблемы. Опасность засоления сельскохозяйственных уголий с каждым годом возрастает. В ряде регионов экологического бедствия (Аральский регион и лр.) засоление почв и дефляция солей стали главным фактором не только снижения сельскохозяйственной продукции, но и угрозой здоровью человека. Отсюда получение солеустойчивых форм растений, способных осваивать вновь образуемые засоленные почвы и лавать экономически значимый урожай, становится все более актуальной задачей. Однако большим тормозом для получения таких форм равно как традиционными, так и нетрадиционными метолами физиологии и генетики растений стала недостаточная изученность механизмов адаптации и выживания растительных клеток в условиях засоления, знание которых необходимо для создания надежных физиолого-биохимических параметров отбора (Шевякова,1989).
В последние годы многочисленные исследования направлены на изучение одной из универсальных ответных реакций растений на стресс, в том числе и солевой - аккумуляцию пролина (Шевякова, 1983; Кирьян, Шевякова, 1984; Кирьян, 1985; Калинкина, 1985; Ка-линкина, Наумова, 1992). В то же время практически отсутствуют исследования по изучению изменений в содержании связанного пролина и его производного - оксипролина у растений при действии повышенных концентраций солей.
Как 'лзвестно, эластичность клеточных стенок, в том числе и растительных, в большей степени зависит от содержания з них окси-пролинбогатых белков (экстенсинов). При засолении клеточн~я стенка растительных клеток является вместилищем избыточных ионов, что является одним из механизмов устойчивости к солям (Строганов, Лапина, 1979; Лапина, І98І). Однако в литературе по солеустойчивос-ти отсутствуют данные о том, какие изменения претерпевает при этом сама клеточная стенка. Кроме того, остается неясным, образуются ли в- растительной клетке и тканях повышенные количества связанного пролина подобно тому, как это наблюдается с накоплением свободного пролина в условиях засоления.
Первой работой, в которой был поставлен вопрос об адаптивном значении пролинбогатых пептидов для растений в экстремальных условиях засоления, была публикация Л.С.Прихолько с соавторами (1979). Имеются исследования, в которых установлено участие уникальных оксипролин-богатых гликопротеинов (экстенсинов) клеточных стенок в их растяжимости в процессе жизнедеятельности раститель-
- it-ной клетки ( Xamfiozk' 198S; Coofiei -elai 138ї; ^га.Ці eicd 1383),
Оксипролинзависимая эластичность клеточных стенок - одно из свойств, которое может обуславливать выживаемость клеток в условиях солевого стресса. Более того, в литературе отсутствуют сведения о том, в какой мере процесс гипролиза белков с освобождением свобопного пролина может быть отнесен к адаптационным механизмам .
В связи с этим важное значение приобретает изучение закономерностей изменения в содержании свобопного и связанного пролина, оксипролина у растений в период адаптации к солевому стрессу и . проявления повреждающего действия солей.
Удобным молельным объектом для изучения этих вопросов являются клеточные линии растений, контрастные по солеустойчивости и способности аккумулировать свободный пролин, которые и были использованы в настоящей работе.
Цель и задачи исследования. Цель работы - установить содержание связанного пролина и оксипролина в различных фракциях белков, выделенных из солеустойчивых и несолеустойчивых суспензионных культур клеток sutvt%\ г Is соответственно (ЛЕу-1) и дикий штамм, произраставших на солевой и безсолевой среде.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать рост отличающихся по солеустойчивости культур клеток в различных условиях засоления/VaCI.
-
Используя в качестве биохимических маркеров пероксилазу и свободный пролин, выявить характер ответной реакции клеток на солевой стресс.
-
Определить содержание связанного пролина и оксипролина в клеточной стенке солеустойчивых и несолеустойчивых клеток.
-
Изучить влияниеУаСІ на интенсивность включения С-пролина в белки растворимой, ионосвязанной и ковалентноевязанной с клеточной, стенкой фракции и установить компонентный состав ионосвязанной фракции белков, меченных С-пролином.
-
Изучить состав специфичных для клеточных стенок изоперок-сидаз, которые могут принимать участие в образовании экстенсина.
Научная новизна. Используя в качестве маркера ответной реакции на солевой стресс изменения в активности пероксидазы, содержании свободного пролина и интенсивности роста сравниваемых клеточных линий A/izoiLft&a sy'vealus, были выделены диапазоны концентрации yVaCI адаптивного и повреждающего воздействий. В соответствии с этим.клеточные линии были охарактеризованы по содержанию связан-
~ 5 ~ ного пролина и оксипролина. Впервые установлено присутст, - окси-пролина в белковой фракции клеточных стенок у УаСІ-резигг-нтной клеточной линии JfcjEg-I и несолеустойчивого дикого штамма
Показано, что содержание оксипролина возрастает в конце
клеточного цикла у обоих клеточных линий: у дикого штамма на сре
де Мурасиге-Скуга безУаСІ, у \Щ-1 - на той же среде, но с вне
сением I^VaCI. В солеустойчивых клетках наблюдалось более плав
ное изменение в содержании оксипролина, что коррелировало с их
более высокой солеустойчивостью. Снижению количества связанного
оксипролина в клетках дикого штамма с возрастанием концентрации
УаСІ в среде соответствовало отсутствие изменений в содержании
связанного пролина. У//аС1-резистентных клеток на фоне снижения
количества связанного оксипролина наблюдался хорошо выраженный
максимуі/. связанного пролина в диапазоне концентрацийУаСЇ, опти
мальных для роста (1,0 - 1,550. Впервые установлено образование
пролинбогатых белков в клеточной стенке, в растворимой и ионосвя-
занной фракциях солеустойчивых клеток. Обсуждается возможная
роль таких белков, как запасного пула свободного пролина, исполь
зуемого в условиях засоления для защиты структурных элементов
клетки и осморегуляции. /
Практическая значимость. Изменения в і/.єтаболизме пролина и оксипролина и их связь с солеустойчивостью клеточных линий позволяет использовать выявленные в работе закономерности для поиска биохимических маркеров адаптивных реакций растений и при отборе клеток для получения растений-регенерантов с повышенной солеустойчивостью.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на: II, III;
ІУВсесоюзньк конференциях молодых ученых по физиологии раститель
ной клетки (Москва, 1986; Петрозаводск, 1988; Минск, 1990), на
расширенном семинаре лаборатории солевого обмена и солеустойчи-
вости ШР РАН (Москва, 1989), Международном симпозиуме по фи
зиологическим, биохимическим и генетическим аспектам солеустойчи-
вости растений (Ташкент, 1992), на заседании секции Ученого Сове
та по физиологии растений Института ботаники HAH РК (Алма-Ата,
1990).- * -
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, "экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включает f3lt наименований, в том числе //Я иностранных. Диссертация изложена на М&страницах машинопис-
