Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
1. Салициловая кислота в растении 9
1.1. Биосинтез салициловой кислоты 9
1,2.Краткая история использования салициловой кислоты 10
1.3. Роль салициловой кислоты в функционировании растения 11
2. Некоторые механизмы влияния СК на устойчивость растений 12
2.1. Общие черты реакции растения на стресс 12
2.2. Участие салициловой кислоты в формировании устойчивости растений к патогенам 14
2.3. PR-белки 15
2.4. Место СК-индуцированных путей в ответных реакциях растения на патогены 18
2.5. Транспортные функции мембран при патогенезе и обработке элиситорами 21
2.6. Салициловая кислота и активные формы кислорода 26
3. Салициловая кислота и симпластный транспорт вируса табачной мозаики 29
3.1. Строение плазмодесмы и транспорт вируса 29
3.2. Влияние различных факторов на проводимость плазмодесм 33
3.3. Транспорт вируса табачной мозаики 35
3.4. Влияние салициловой кислоты на межклеточный транспорт веществ 37
4. Участие каллозы в регуляции проводимости плазмодесм 41
4.1. Роль каллозы в растительной клетке 41
4.2. Каллоза и межклеточный транспорт веществ 43
4.3. Метаболизм каллозы. Каллозосинтаза 45
4.4 р-1,3-глюканазы растений 46
4.4.1 Роль в функционировании растительной клетки 46
4.4.2. Глюканазы и защитные реакции растения 49
4.5. Влияние салициловой кислоты на аккумуляцию каллозы 50
ГЛАВА II. Материалы и методы 53
ГЛАВА III. Результаты 61
1. Влияние СК на межклеточный транспорт ВТМ 61
2. Влияние салициловой кислоты на аккумуляцию каллозы в плазмодесмах 63
3. Трансгенные растения, экспрессирующие ген бактериальной Й-1,3- глюканазы 66
4. Доказательства трансгенности полученных растений 67
4.1. Отбор растений по устойчивости к канамицину 67
4.2. Отбор растений с использованием различий температурного оптимума бактериальной и растительной Р-1,3-глюканазы 68
4.3. Наследуемость введенного гена р-1,3-глюканазы в первом поколении 70
4.4. Полимеразная цепная реакция 72
5. Общая характеристика трансгенных растений 74
6. Определение локализации фермента 74
7. Некоторые характеристики ферментативного препарата 75
8. Влияние салициловой кислоты на активность глюканазы, содержание каллозы и транспорт ВТМ в трансгенных растениях 77
8.1. Активность Р-1,3-глюканазы и содержание каллозы 77
8.2. Межклеточный транспорт ВТМ 80
9. Действие салициловой кислоты на ферментативную активность Р" 1,3 -глюканазы in vitro 81
10. Действие СК в присутствии ингибиторов синтеза каллозы 82
11. Искусственная индукция синтеза каллозы и ингибирование р-1,3-глюканазы при действии дигитонина 85
12. Реакция трансгенных растений на воздействие низкой температурой 87
ГЛАВА IV. Обсуждение 89
Заключение 10
Выводы 102
Приложение 103
Список литературы 105
- Место СК-индуцированных путей в ответных реакциях растения на патогены
- Влияние салициловой кислоты на межклеточный транспорт веществ
- Отбор растений с использованием различий температурного оптимума бактериальной и растительной Р-1,3-глюканазы
- Искусственная индукция синтеза каллозы и ингибирование р-1,3-глюканазы при действии дигитонина
Введение к работе
Повышение устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессовым факторам является одной из актуальнейших задач биологии растений. В этой связи особое значение приобретает изучение механизмов формирования такой устойчивости. Хорошо известно участие салициловой кислоты (СК) в защитных реакциях растения [Yalpani et at, 1991]. Показано, что многие неблагоприятные факторы среды приводят к её накоплению в тканях [Malamy et ah, 1990]. Обнаружена корреляция между степенью накопления СК и устойчивостью растения. Растения, неспособные накапливать СК (содержащие, например, ген салицилатгидроксилазы, NahG-ген), оказались более чувствительными к инфекции [Delaney, 1994].
Интенсивно изучаются способы влияния СК на сопротивляемость организма. Широкое распространение получила гипотеза Клессига и др. [Klessig et at., 1994], связывающая действие СК с «окислительным взрывом» и накоплением в тканях активных форм кислорода, главным образом перекиси водорода. Хотя последовательность событий до сих пор не вполне ясна, в результате этого процесса происходит индукция синтеза специфических защитных белков (PR-белков), способствующих развитию устойчивости растения. Такие события происходят при многих неблагоприятных воздействиях - грибной, бактериальной, вирусной инфекциях, а также, по-видимому, при ряде абиогенных воздействий, например, температурном стрессе [Cutt & Klessig, 1992]. Исследования последних лет выявили некоторые компоненты соответствующих сигнальных систем и идентифицировали ответственные за синтез этих компонентов гены [Alvares, 2000; Yoshioka et ah, 2001; Singh etah, 2004].
Некоторые патогены, в частности вирус табачной мозаики, транспортируются от места инфицирования до проводящей системы, осуществляющей их дальний транспорт по растению, по плазмодесмам. Поэтому изменение проводимости плазмодесм может влиять на межклеточный транспорт ВТМ. Действительно, имеются данные о том, что СК изменяет электрическую проводимость межклеточных контактов, то есть влияет на транспорт заряженных соединений, главным образом ионов, по плазмодесмам [Лялин с сотр., 1986]. Кроме того, показана способность СК увеличивать распространение декстрана (3 кДа) между клетками листа табака [Murphy & Carr, 2002]. В то же время Murphy & Carr заключили, что такие изменения проводимости не могут отразиться на транспорте вируса табачной мозаики, поскольку размер вируса значительно превышает это значение (находится в области 10 кДа). Вопрос о возможности влияния СК на межклеточный транспорт ВТМ через изменение проводимости плазмодесм остается открытым.
Известно, что одним из способов влияния на транспортную способность плазмодесм является отложение каллозы в их устье [Radford et al., 1998]. Сужая просвет плазмодесмы, каллоза может уменьшать диаметр транспортного канала и затруднять распространение вируса. В связи с этим была высказана гипотеза о том, что влияние СК на вирусный патогенез может осуществляться через снижение в её присутствии межклеточного транспорта ВТМ из-за стимуляции отложения каллозы в области плазмодесм [Красавина и др., 2002]. Проверке этой гипотезы посвящена настоящая работа.
Цель исследования: изучить возможность влияния салициловой кислоты на межклеточный транспорт вируса табачной мозаики в растениях табака через отложение каллозы, влияющее на проводимость плазмодесм.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние СК на отложение каллозы в тканях листа табака.
2. Выявить влияние отложения каллозы на симпластный транспорт вируса табачной мозаики.
3. Получить и охарактеризовать трансгенные растения табака, экспрессирующие бактериальный ген В-1,3-глюканазы, гидролизующей каллозу.
4. Изучить влияние салициловой кислоты на активность бактериального и растительного фермента.
Место СК-индуцированных путей в ответных реакциях растения на патогены
Первыми барьерами на пути проникновения патогена в клетку служат клеточная стенка и плазматическая мембрана, а в цепи первичных реакций на заражение важную роль играют изменения ионных потоков через мембрану. В течение нескольких минут после заражения временно изменяются трансмембранные ионные потоки - усиливается вход протона и кальция, а калий и хлор, напротив, выходят из клетки [Atkinson et al., 1990; Hahlbrock et al., 1995; Jabs et al., 1997]. В результате в апопласте повышается рН и увеличивается концентрация К+ [Keppler & Baker, 1989]. Характерно, что по некоторым данным изменение Кҳ㥠обмена происходит только при заражении патогенами, индуцирующими защитную гиперчувствительную реакцию [Barker et al, 1987].
Элиситоры, образуемые при атаке бактериальных и грибных патогенов, служат первыми сигналами, воспринимаемыми рецепторами плазмалеммы. После взаимодействия элиситоров с мембранным рецептором запускается каскад реакций, приводящих к экспрессии защитных генов. В цепи таких реакций быстрому изменению транспорта ионов принадлежит заметная роль. Обработка элиситорами влияет на такие же потоки ионов, как и инфицирование патогенами: активируется HVlC обмен на плазмалемме, сопровождаемый входом кальция в клетку [Bach et al., 1993; Niirnberger et ah, 1994].
Так же, как патогены и элиситоры, на ионные потоки через плазмалемму действует СК. Поэтому можно полагать, что многие эффекты патогенов и элиситоров на транспортные функции плазматической мембраны связаны с накоплением СК. Еще в ранних работах было показано ингибирование под действием СК поглощения фосфата ( Р) и калия корнями проростков ячменя [Glass, 1975]. Минимальная ингибирующая концентрация СК составляла 10"5 М, полное ингибирование достигалось при 5х10 4М. Эффект был обратимым, ингибирование полностью снималось при исключении СК из среды. Ингибирующее действие СК на поглощение калия было подтверждено другими исследователями [Scharff & Perry, 1976; Нафег & Balke, 1981; Gordon et al, 2002]. При этом не было обнаружено повреждения плазмалеммы.
Причиной действия СК на транспорт калия является изменение в её присутствии активности калиевых каналов на плазмалемме [Lurin et al., 1996]. Ионные каналы опосредуют и действие элиситоров, например, ингибиторы анионных каналов блокировали ответ растений на обработку элиситорами [Lurin et ah, 1996; Jabs et ah, 1997]. Эксперименты по влиянию модуляторов ионных каналов свидетельствуют о важном значении ионных потоков в передаче стрессовых сигналов и в развитии защитных реакций растения. Примером могут служить работы Schaller и другие [Schaller & Oecking, 1999; Schaller & Frasson, 2001]. Исследователи вводили ионофоры в листья молодых растений томата через срезанное основание стебля. Валиномицин, создающий калиевую проводимость мембраны и диссипирующий трансмембранный градиент концентрации калия, мимикрировал действие поранения и индуцировал быструю аккумуляцию в листьях транскриптов связанных с поранением генов. Еще более эффективным было воздействие нигерицина, диссипирующего трансмембранные концентрационные градиенты не только К+, но и tt [Schaller & Oecking, 1999; Schaller & Frasson, 2001]. Таким же действием обладал полиеновый антибиотик амфотерицин В, который мимикрировал действие элиситора на ионные потоки [Jabs etaL, 1997].
Некоторые пептиды, обладающие мембранным действием, например, аламетицин, обладали способностью заменять СК в индукции защитных реакций растения. Причиной этого могло быть повышение содержания СК в обработанных растениях. Аламетицин - пептид из Trichoderma viride, образующий потенциалозависимые каналы для одновалентных катионов с несколько большей селективностью для Н\ Обработка аламетицином листьев Phaseolus lunatus вызывала 90-кратное повышение содержания СК. Повышалась также концентрация летучего производного СК, метилсалициловой кислоты, что приводило к повышению устойчивости не только обработанного растения, но и соседних растений [Engelberth et at, 2001].
Кроме торможения поглощения и активации выхода калия, СК влияет на транспорт важного клеточного посредника - протона. Под действием СК происходит усиление входа НҐ в клетку, приводящее к подкислению цитозоля. Временное снижение рН цитоплазмы вызывают также многие бактериальные и грибные элиситоры [Kneusel et al., 1989; Mathieu et al., 1996; Kuchitsu et al., 1997; Roos et al., 1998]. Происходящее при этих воздействиях изменение рН цитозоля незначительно, поскольку буферные системы клетки оберегают рН-гомеостаз. Но даже небольшие и, по-видимому, кратковременные и локальные снижения рН вызывали активацию 㥠АТФазы и гиперполяризацию мембраны [Kurkdjian & Guern, 1989; Michelet & Boutry, 1995]. Другим следствием снижения рН цитоплазмы является активация ионных каналов - калиевых, кальциевых и анионных [Lurin et al., -1996]. Это не может не отразиться на процессах, связанных с патогенезом. Действительно, при искусственном подкислении цитозоля слабыми кислотами некоторые авторы наблюдали активацию MAPKs [Тепа & Renaudin, 1998] и усиление экспрессии защитных генов [Lapous et al., 1998; He et aL, 1998]. Эти данные предполагают важную роль снижения рН цитоплазмы, происходящего при стрессовых воздействиях, на многих этапах передачи сигналов.
Кроме влияния на трансмембранные потоки протона, СК обладает другим способом действия на внутриклеточный рН. Являясь слабой кислотой, СК поступает из более кислого апопласта в клетку в недиссоциированной форме, и в нейтральном цитозоле отщепляет протон, таким способом вызывая внутриклеточное подкисление. Однако, несмотря на важное для развития патогенеза значение снижения под влиянием СК цитоплазматического рН, действие СК не ограничивается этим. В ряде экспериментальных условий действие СК в индукции защитных реакций растения отличалось от действия агентов, так же как и СК приводящих к снижению внутриклеточного рН. Например, некоторые родственные СК соединения (4-гидроксибензойная кислота) снижали рН цитозоля, не вызывая присущие СК защитные реакции [Lebrun-Garcia et ah, 2002]. Масляная кислота, снижая pHj примерно до тех же значений, что и СК, тем не менее не вызывала индуцируемых СК реакций. Т.е. помимо неспецифического действия слабой кислоты на внутриклеточный рН салициловая кислота оказывает специфическое влияние на защитные ответы растения.
Влияние салициловой кислоты на межклеточный транспорт веществ
Существует много данных о том, что обработка СК вызывает снижение числа некрозов, образованных на листьях TV-ген содержащих растений табака в ответ на инфицирование патогенами. Одной из причин уменьшения числа некрозов может быть торможение репликации вируса. Действительно, в присутствии СК тормозилась аккумуляция в инфицированных клетках чувствительного к ВТМ табака (пп генотип) вирусных РНК, РНК-зависимой РНК-полимеразы и белка оболочки [Chivasa et aL, 1997; Naylor et aL, 1998]. Для некоторых других вирусов (например, potato virus X, turnip vein clearing virus) также было показано ингибирование в присутствии СК накопления РНК или вирусных частиц [Naylor et aL, 1998; Wong et aL, 2002].
В экспериментах с растениями табака выявилась тканеспецифичность действия СК на репликацию ВТМ. СК снижала содержание вирусной РНК в клетках мезофилла и в выделенных из этой ткани протопластах, но практически не влияла на репликацию в эпидермальных клетках [Murphy & Carr, 2002].
СК уменьшала не только число, но и размер некроза [Enyedi et aL, 1992]. Снижение содержания СК в трансгенных растениях табака, экспрессирующих бактериальный ген салицилатгидроксилазы (NahG-ген), приводило к значительному увеличению размера некротических повреждений, вызванных инфицированием ВТМ, по сравнению с некротическими повреждениями на листьях растений дикого типа [Gaffney et al., 1993; Delaney et ah, 1994]. Салицилатгидроксилаза разрушает СК до катехола, предотвращая накопление СК при инфекции.
Трудно понять, происходит ли уменьшение размера некрозов из-за действия СК на репликацию вируса или на его межклеточный транспорт. Вычленить изменение транспорта можно на тканях, в которых репликация не меняется. Как упоминалось выше, СК не действовал;заметно на репликацию ВТМ в эпидермисе листа табака, в то же время транспорт вируса из первично инфицированной клетки в соседние клетки эпидермиса был замедлен [Murphy & Carr, 2002]. В этом случае можно заключить о возможности действия СК на распространение вируса через межклеточный транспорт.
В работах по изучению действия СК на процессы некрозообразования, как правило, воздействовали экзогенной СК за несколько дней до инфицирования. Размер и число некрозов регистрировали еще через несколько дней после инокуляции. Такой длительный эффект СК предполагал инициацию целого ряда метаболических изменений, таких как синтез PR-белков, индукцию синтеза фитоалексинов и т.д. [Klessig & Malamy, 1994]. В результате это может привести к отмечаемому в эксперименте уменьшению и числа, и размера некрозов.
Таким образом, до настоящего времени не удалось понять, влияет ли СК на транспорт вируса по плазмодесмам. В единственной работе Murphy и Carr [Murphy & Carr, 2002], экспериментально изучавших этот вопрос, авторы обнаружили ингибирование межклеточного транспорта ВТМ между клетками эпидермиса листа табака в присутствии СК. Однако этот эффект они не объясняют снижением проводимости плазмодесм - SEL плазмодесмы по их данным даже, напротив, увеличивался; большее число молекул декстрана размером 3 кДа транспортировалось из инокулированной клетки в соседние клетки. Однако молекулы 10 кДа, соизмеримые с размером вирусного транспортного комплекса, не транспортировались ни в отсутствие, ни в присутствии СК. СК не влияла также на способность вирусного транспортного белка увеличивать пропускную способность плазмодесм [Murphy &Carr, 2002].
Если принять выводы, сделанные Murphy & Carr, то резкое снижение электрической проводимости межклеточного контакта в подводных листовых трихомах водного папоротника сальвинии [Лялин и др., 1986] как будто тем более нельзя безоговорочно распространить на транспорт макромолекул и вирусов по плазмодесмам. Вместе с тем в работе Лялина и других получены уникальные данные относительно первых эффектов СК на электрическую проводимость плазмодесм. Кратковременное, 4-х минутное, воздействие СК вызывало двухфазную реакцию. Непосредственно после внесения в среду СК одновременно с деполяризацией плазмалеммы наблюдали кратковременное увеличение проводимости межклеточных контактов, сменяющееся резким её снижением до полного исчезновения, свидетельствующего о «закрывании» плазмодесм [Лялин и др., 1986]. Несколько позже было показано, что снижение проводимости плазмодесм в присутствии СК проявляется и на целом наземном растении. Обработка корней тыквы салициловой кислотой приводила к функциональной «изоляции» корня, выражающейся в отсутствии транспорта воды между корнями и надземной частью растения [Лялин и др., 1993].
Похожие данные были получены при изучении влияния обработки салициловой кислотой кончиков корней проростков кукурузы на накопление в их клетках меченной дезоксигруппой сахарозы. Сахароза синтезировалась в клетках щитка из нанесенной на него дезоксиглюкозы и транспортировалась в корень по флоэме. Так же как в клетках трихом, была обнаружена 2-фазная реакция, хотя и с другими временными параметрами. В первый час поступление в потребляющие паренхимные клетки растущего корня повышалось, а через несколько часов - тормозилось. Эффекты СК зависели от её концентрации - при концентрациях, превышающих 0,1 мМ, активации поступления не наблюдали [Бурмистрова и Красавина, 1999]. Известно, что в кончике корня выход ассимилятов из флоэмы и распределение между клетками происходит по симпласту, поэтому поступление сахарозы в акцептирующие клетки могло быть мерилом проводимости плазмодесм.
Таким образом, к настоящему времени нам известна только одна опубликованная работа, экспериментально показавшая влияние СК на межклеточный транспорт ВТМ, хотя механизм такого влияния непонятен [Murphy & Carr, 2002], и три работы одного коллектива авторов, обнаружившие изменение проводимости плазмодесм в присутствии СК [Лялин и др., 1980, 1986, 1993]. Вопрос о возможности действия СК на межклеточный транспорт вируса через изменение проводимости плазмодесм остается открытым.
Одной из причин изменения проводимости плазмодесм в присутствии СК могло быть ее воздействие на цитоскелет. Основные компоненты сократительной системы найдены в плазмодесмах: актин [White et ah, 1994; Blackmail & Overall, 1998; Красавина и др., 1998, 2001], миозиноподобные белки [Blackman & Overall, 1998; Radford & White, 1998], специфичный для растительных клеток миозин VIII [Baluska et al., 2001]. Актомиозиновый комплекс может быть вовлечен в регуляцию межклеточного транспорта по плазмодесмам. Ингибитор актинового цитоскелета, цитохалазин, увеличивал SEL плазмодесм в листьях табака [Ding et al., 1996] и снижал электрическое сопротивление межклеточных контактов в корне водного растения Trianea bogotensis и в трихомах папоротника Salvinia [Красавина и др., 1999].
Отбор растений с использованием различий температурного оптимума бактериальной и растительной Р-1,3-глюканазы
В большинстве случаев диаметр плазмодесмы неодинаков на всем её протяжении. Обычно плазмодесма сужается в местах выхода из клеточной стенки, образуя neck-область [Olesen & Robards, 1990]. Предполагается, что проводимость именно этой области плазмодесмы легче подвержена регуляции. Именно здесь часто локализуют «внешний сфинктер» (external sphincter), приписывая ему способность сокращать диаметр проводящего канала плазмодесмы [Olesen & Robards, 1990; Badelt et al., 1994]. Именно в этих местах, между плазматической мембраной и клеточной стенкой, откладывается каллоза [Delmer et ah, 1993; Radford, 1998; Botha & Cross, 2000]. Отложение каллозы вокруг плазмодесм подтверждено иммунохимически [Delmer et ah, 1993]. Предполагается, что при этом тормозится межклеточный транспорт веществ [Sivaguru et al., 2000].
Существует корреляция между отложением каллозы и транспортом ассимилятов в растениях. Так, в активных ситовидных трубках каллозы мало, отложение каллозы на ситовидных пластинках активируется при повреждении ситовидных элементов [Eschrich, 1965; McNairn, 1972]. Таким способом исключаются из путей передвижения ассимилятов поврежденные ситовидные трубки, временно нефункционирующие, например, в зимнее время трубки. Весной каллоза исчезает. Часто отмечали, что реакция образования каллозы быстрая и обратимая, через несколько секунд после перерезания флоэмы в ситовидных порах обнаруживали каллозу. При исключении повреждающего фактора содержание каллозы постепенно снижалось. Известно, что транспорт ассимилятов нарушается при повышенной температуре. Это также происходит в результате отложения каллозы во флоэме [Webster & Currier, 1968]. В этих экспериментах обнаружили необходимость предварительного освещения, чтобы образовалась каллоза. Если растение нагревали после продолжительной темноты, отложения каллозы почти не наблюдали. Добавление сахарозы активировало накопление каллозы. В мутанте кукурузы по флоэмному транспорту ассимилятов обнаружили повышенное содержание каллозы. Предположили, что причина отсутствия экспорта из донорных листьев -накопление каллозы в проводящих тканях [Hofius et al, 2004].
По-видимому, отложение каллозы препятствует и транспорту патогенов. Известно, что при патогенезе в клетках растений повышается содержание каллозы. При этом отметили корреляцию между содержанием каллозы в клетках хозяина и устойчивостью растения к распространению патогена [Tucker & Boss, 1996; Clarke, 1996; Botha & Cross, 2000; Roberts & Oparka, 2003]. Было показано, что чем устойчивее растение, тем больший слой каллозы откладывается вокруг места инфекции [Bonhoff et al., 1987].
Влияние каллозы на транспорт веществ объясняется её ранним отложением преимущественно в области плазмодесм и сдавливанием транспортных каналов. Кроме того, набухшая каллоза образует пробки в апопласте, тормозя также и апопластный транспорт. Тот факт, что каллоза сильно набухает в воде, определяет возможность влияния на осмотические градиенты в клетке и между клетками. Поэтому образование каллозы может изменить концентрационные градиенты разных веществ, что отразится на их пассивном транспорте по градиенту концентрации.
Локальное отложение каллозы в neck-области плазмодесм может быть одной из ранних реакций растения на неблагоприятные факторы среды. При длительном действии повреждающего фактора отложение каллозы происходит по всей поверхности поврежденных клеток, приводя к изоляции очагов повреждения [Wu & Dimitman, 1970; Shimomura & Dijkstra, 1975; Ryals et al., 1996; Donofrio & Delaney, 2001]. В присутствии каллозы тормозится также дальний транспорт вирусов [Leisner & Turgeon, 1993] и грибных патогенов [Bailey et ah, 1990].
Короткое время жизни и быстрая обмениваемость каллозы обеспечивается эффективно регулируемым отношением активностей двух ферментов - каллозосинтазы и (3-1,3-глюканазы [Overall & Blackman, 2001]. Каллозосинтаза (каллозо-В-глкжансинтаза) - трансмембранный белок, векторно локализованный в плазматической мембране. Оптимальная активность этого фермента наблюдается при рН около 7. Субстрат, УДФГ, поступает со стороны цитоплазмы, а продукт синтеза - каллоза -депонируется во внеклеточном матриксе [Kohle et al., 1985]. Активность каллозосинтазы зависит от фосфолипидного окружения фермента и не опосредована кальмодулином. Каллозосинтаза малоактивна в здоровых клетках и быстро активируется при стрессах [Kauss, 1985].
Показана ведущая роль кальция при инициировании процесса каллозообразования [Kauss, 1985; Fink et al., 1987]. Кальций опосредует действие многих регуляторов содержания каллозы в тканях. Например, значительное влияние на накопление каллозы оказывает инозитидтрифосфат, активируемый G-белком. 1Р3 способствует синтезу каллозы, воздействуя на кальциевые каналы и обеспечивая поступление кальция в клетку. Кальций совершенно необходим для синтеза каллозы, скорее всего, именно из-за непосредственного влияния на каллозосинтазу [Kohle et al., 1985; Kauss & Jeblick, 1986, 1987; Fink et al, 1987]. В присутствии хелатора, ЭДТА, отложение каллозы резко снижается [Eschrich, 1965; Kohle et al, 1985]. Ингибиторы Са2+-каналов, нифедипин и гадолиниум, также блокируют синтез каллозы [Kartusch, 2003]. С другой стороны, синтез каллозы может быть инициирован и Са2+-независимым способом, например, обработкой трипсином [Kauss et al., 1993] или спиростанолом [Messiaen et al., 1995]. Предполагается, что in vivo помимо кальция необходимы какие-то дополнительные эндогенные регуляторы [Waldmann et al., 1988] и что одним из них может быть локализованный в вакуоли Р-фурфурил-р-глюкозид. Перераспределение таких регуляторов между вакуолью и цитоплазмой является одним из способов воздействия на синтез каллозы.
Искусственная индукция синтеза каллозы и ингибирование р-1,3-глюканазы при действии дигитонина
Сравнение содержания каллозы в растениях векторного контроля и обеих формах трансгенов обнаруживало корреляцию с активностью р-1,3-глюканазы (рис. 14). Более высокое содержание каллозы наблюдали в растениях векторного контроля, характеризующихся наименьшей активностью фермента. В трансгенных растениях, в которых ферментативная активность была значительно выше, содержание каллозы было ниже контрольного уровня.
Особенно низкое содержание каллозы наблюдали в листьях растений L-LamA4, характеризующихся наибольшей долей экстраклеточного фермента. В листьях LamA4, в которых доля апопластной р-1,3-глюканазы была вдвое меньше, содержание каллозы не отличалось заметно от контрольных растений. У таких растений общая активность р-1,3-глюканазы увеличивалась по сравнению с контролем больше чем в 3 раза, в то время как содержание каллозы снижалось только на 11%, такое снижение было недостоверным. Эти данные предполагают, что активность экстраклеточной р-1,3-глюканазы в гораздо большей степени, чем внутриклеточного фермента приводит к снижению содержания каллозы в тканях.
СК в листьях всех типов растений - векторного контроля и трансгенов, - снижая активность р-1,3-глюканазы, одновременно повышала содержание каллозы (рис. 146). Однако прямой зависимости между степенью изменения в присутствии СК общей ферментативной активности и содержания каллозы и в этом случае не заметили. Так, наименьшее снижение в присутствии СК ферментативной активности наблюдали в варианте NPT (около 1 ед/мг белка по сравнению с примерно 3 ед/мг белка в трансгенах), в то же время у растений NPT-варианта несколько сильнее, чем в трансгенных растениях, увеличивалось содержание каллозы (рис. 146). Это подтверждает заключение о том, что не общая активность глюканазы, а локализованный в апопласте фермент оказывает влияние на содержание каллозы в тканях.
Достоверные изменения размера некрозов, характеризующего межклеточный транспорт ВТМ, были замечены только в растениях L-LamA4: в этом варианте размер некрозов увеличивался примерно на 25% (табл. 7). В листьях растений LamA4 размер некрозов был практически таким же, как в листьях векторного контроля. То есть, значительное повышение общей активности р-1,3-глюканазы в листьях растений варианта LamA4 не привело к изменению транспорта вируса, так же как оно не приводило к заметному изменению содержания каллозы в тканях листа. Эти данные подчеркивают, что наибольшее значение для транспорта ВТМ, так же как и для содержания каллозы имеет апопластная Р-1,3-глюканаза. По-видимому, 15%-ное увеличение ферментативной активности в апопласте, характерное для растений LamA4, недостаточно для оказания влияния ни на содержание каллозы, ни на транспорт вируса. При повышении активности апопластной глюканазы на 30% (растения L-LamA4) происходило достоверное уменьшение содержания каллозы и стимуляция транспорта вируса (табл. 7). В трансгенных растениях табака-содержание каллозы было в 2 раза меньше, чем в векторном контроле. Таким образом, межклеточное распространение ВТМ коррелировало с содержанием каллозы в тканях листа, регулируемым активностью апопластной (3-1,3-глюканазы.
Введение СК в среду инкубации при 31 С, когда транспорт вируса не ограничен защитными реакциями растения, снижало размер некротических повреждений во всех вариантах опыта (табл. 7). При этом наибольшее снижение размера некрозов наблюдали в растениях контрольного варианта. В отличие от трансгенных растений LamA4, снижение размера некрозов у растений L-LamA4 было недостоверным. Таким образом, как мы и предполагали, повышение активности р-1,3-глюканазы противодействовало влиянию СК на транспорт вируса. При этом обнаружилось, что важна активность фермента, локализованного в апопласте.
Приведенные данные позволяют заключить, что тормозящее межклеточный транспорт ВТМ действие СК связано с ингибированием активности апопластной глюканазы, приводящим к повышению содержания каллозы. Активности растительного и бактериального фермента одинаково реагировали на присутствие СК, поэтому эффекты СК на транспорт ВТМ не отличались в растениях дикого типа от эффектов, наблюдаемых в трансгенных растениях.
Для выявления возможности непосредственного действия СК на активность р-1,3-глюканазы, её вводили в инкубационную среду, используемую для определения активности фермента. Ферментативный препарат получали из необработанных салициловой кислотой листьев растений. Как видно из рисунке 15, использованные нами концентрации СК - до10"оМ -вызывали снижение активности В-1,3-глюканазы. Наиболее сильное снижение активности наблюдали при введении салициловой кислоты в концентрации 10"4М (рис. 15). Такие данные позволяют полагать, что ингибирование активности Р-1,3-глюканазы в присутствии СК может объясняться её непосредственным действием на фермент. Неожиданным явилось меньшее ингибирование активности фермента при концентрации СК 10"3 М, чем при 10" М. Возможно, что при такой высокой концентрации СК в инкубационной среде частично теряется сродство фермента к СК.
