Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Мочеполовой трихомоноз (обзор литературы) 19
1.1. Таксономия возбудителя трихомоноза 19
1.2. Биологические свойства возбудителя 21
1.3. Патогенез мочеполового трихомоноза 27
1 .4. Инфекционная иммунология трихомоноза 28
1.5. Лабораторная диагностика мочеполового трихомоноза 35
1.6. Классификация и клинические формы мочеполового трихомоноза 51
1.7. Терапия мочеполового трихомоноза 65
Глава 2. Общая характеристика клинических наблюдений и методов исследований 78
2.1. Общая характеристика пациентов 78
2.2. Методы исследования 78
2.2.2.Методы микроскопической диагностики урогенитального трихомоноза 83
2.2.2.1. Световая микроскопия 83
2.2.2.2. Фазово-контрастная микроскопия 85
2.2.2.3. Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) 86
2.2.2.4. Микроскопия с дополнительным контрастированием 86
2.2.2.5. Электронная микроскопия 86
2.2.3. Иммуноферментный анализ 88
2.2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 91
2.2.5. Культуральные исследования 93
2.2.6. Микробиологическая диагностика УГИ 101
2.2.6.1. Микроскопическая диагностика 101
2.2.6.2. Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) 101
2.2.6.3. Культуральная диагностика УГИ 101
2.2.7. Исследования на культурах клеток 103
2.2.8. Иммунологические исследования 105
2.2.9. Уретроскопия 105
2.2.10. Ультразвуковое исследование (УЗИ) 106
2.2.11. Этиопатогенетическое лечение 106
2.2.12. Фармакологическая характеристика препарата Бестим 108
2.2.13. Оценка результатов диагностических методов 109
2.2.14. Методы статистической обработки результатов исследований 111
Глава 3. Характеристика больных с урогенитальными инфекциями 113
3.1. Общая характеристика группы обследованных с подозрением на УГИ 113
3.2. Характеристика жалоб и клинических симптомов 115
3.3. Клинико-микробиологическая характеристика пациентов 118
Глава 4. Характеристика больных острым урогенитальным трихомонозом 124
4.1. Общая характеристика группы обследованных 124
4.2. Характеристика жалоб и клинических симптомов 124
4.3. Результаты этиопатогенетического лечения острого трихомоноза 128
Глава 5. Характеристика больных хроническим урогенитальным трихомонозом 132
5.1. Общая характеристика группы обследованных 132
5.2. Характеристика жалоб и клинических симптомов 135
5.3. Клинико-лабораторная характеристика 140
5.4. Построение линейных дискриминантных функций для прогноза успешности терапии 146
5.5. Результаты этиопатогенетической терапии хронического трихомоноза 150
Глава 6. Микробиологические аспекты диагностики трихомоноза 155
6.1. Оценка информативности методов прямого обнаружения Т. vaginalis 155
6.1.1. Оценка информативности методов прямого обнаружения Т. vaginalis у мужчин и женщин 155
6.2. Изучение роли округлых морфологических форм трихомонад в патологии УГТ 196
6.2.1. Изучение ультраструктурных и цитоморфологических особенностей морфологических форм Т.vaginalis. 196
6.2.2. Изучение ультраструктурных особенностей округлых форм Т. vaginalis. 196
6.2.3. Определение цитоморфологических признаков округлых форм Т.vaginalis методами световой микроскопии T.vaginalis 205
6.2.3.1. Световая микроскопия нативных препаратов T.vaginalis 205
6.2.3.2. Световая микроскопия препаратов T.vaginalis, окрашенных метиленовим синим 212
6.2.3.3. Фазово-контрастная микроскопия препаратов T.vaginalis 212
6.2.3.4. Дифференциально-интерференционный контраст нативных препаратов T.vaginalis 225
6.2.3.5. Комбинированная микроскопия нативных препаратов T.vaginalis 225
6.2.4. Изучение цитопатогенного действия округлых форм Т. vaginalis на культуре клеток 233
6.3. Совершенствование культуральной диагностики трихомоноза 233
6.3.1. Подбор оптимальной концентрации антимикотических препаратов для повышения селективных свойств модифицированной среды Даймонд 235
6.3.2. Оценка эффективности модифицированной питательной среды в сравнении с известными питательными средами для культивирования T.vaginalis 235
6.4. Изучение информативности и совершенствование серологической диагностики трихомоноза 241
6.4.1. Изучение информативности ИФА при обследовании больных с острой и хронической формой трихомоноза 241
6.4.2 Получение трихомонадных антигенов и определение их оптимальной концентрации для сорбции планшетов в ИФА 242
6.4.3. Изучение чувствительности модифицированного варианта ИФА у больных острой и хронической формой трихомоноза 243
6.4.4. Изучение уровня противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомонозом 250
6.4.5. Изучение динамики противотрихомонадных IgG-антител у пациентов после лечения 250
6.4.6. Изучение подклассов специфических противотрихомонадных IgG-антител у больных трихомонозом с целью повышения информативности ИФА 251
6.5. Метод определения чувствительности трихомонад к противопротозойным препаратам 255
6.6. Обоснование комплексного алгоритма микробиологической диагностики урогенитального трихомоноза 258
Глава 7. Иммунологические аспекты диагностики и лечения трихомоноза 271
7.1. Иммуннологические особенности у больных острым и хроническим трихомонозом 271
7.2. Иммунный статус больных с различным прогнозом терапии 276
7.3. Бестим в комплесной терапии хронического трихомоноза 283
Обсуждение результатов 297
Выводы 315
Практические рекомендации 319
Литература 321
Приложение 348
- Инфекционная иммунология трихомоноза
- Иммуноферментный анализ
- Характеристика жалоб и клинических симптомов
- Иммуннологические особенности у больных острым и хроническим трихомонозом
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время трихомоноз является одним из наиболее распространенных заболеваний, передающихся половым путем, которое по распространенности занимает первое место в мире Ежегодно в мире болеет трихомонозом 250 млн человек (Михайлов А В, Гасанова Т А, 2000, Баткаев ЭА, 2002, Чеботарев В В и др, 2003) Урогенитаяьный трихомоноз - многоочаговое заболевание, сопровождающееся большим числом осложнений, у мужчин регистрируются простатиты, эпидидимиты, везикулиты, купериты, циститы баланопоститы, рубцовые сужения уретры (Ильин И И, 1999, Gardner W A et al, 1986) У женщин трихомонадная инфекция приводит к развитию не только кольпита, эндоцервицита, цистита и проктита, но может играть существенную роль в формировании эктопий шейки матки, тубоовариальных гнойных образований, миомы матки Осложнения трихомоноза могут быть причиной бесплодия, патологии беременности, детской смертности, что имеет социальное значение (Васильев М М, 1990, Делекторский В В. и соавт, 1991, Ильин И И, 1991)
В то же время, многие аспекты трихомонадной инфекции остаются нерешенными, а некоторые требуют более глубокого изучения Клиническая картина урогенитального трихомоноза, по мнению ряда авторов, в настоящее время претерпевает патоморфоз, характеризуясь увеличением доли стертых и малосимптомных форм в общей структуре заболеваемости Недостаточно изучена роль атипичных морфологических форм возбудителя в патологии урогенитального тракта (Козлюк А С , Козлюк В А, 2001, Benchimol М , 2001)
В связи с этим важное значение приобретают вопросы своевременной и достоверной диагностики трихомонадной инфекции Микробиологическая диагностика нередко играет существенную роль в постановке диагноза данного заболевания При этом ее свойства варьируют в широких пределах и в значительной степени зависят от целого ряда факторов Наиболее доступными методами лабораторной диагностики трихомоноза являются микроскопия нативных, окрашенных препаратов и культуральное исследование Трудности при микроскопии создают как наличие в биологическом материале от больного разнообразных цитоморфологических форм трихомонад, трудно отличимых от клеток организма хозяина и усложняющих их дифференцировку, так и низкая концентрация простейших в биоматериале и потеря ими подвижности in vitro Предпочтительным методом диагностики трихомоноза является культивирование возбудителя в питательных средах Многочисленные составы питательных сред подобраны эмпирически Их селективность недостаточна для получения чистой культуры В ряде случаев трихомоноз протекает как смешанная инфекция, сочетающаяся с кандидозом Рост дрожжеподобных грибов рода Candida приводит к ингибированию размножения трихомонад и получению ложноотрицательного результата (Васильев ММ, 1980, Беднова В Н , 1985, Borchardt К А , 1991)
В настоящее время новая генодиагностическая технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) опережает остальные методы генодиагностики
трихомочоза по уровню чувствительности и специфичности (Сухова ЛП,
2000) Однако для проведения этого исследования необходимо хорошее
оснащение лабораторий, соблюдение всех технических требований при
обработке материала, что не всегда возможно даже в крупных диагностических
центрах Другим альтернативным методом является иммуноферментный
анализ При этом роль иммуноферментной диагностики трихомоноза остается
неопределенной в связи с недостаточным практическим опытом ее
использования В коммерческих иммуноферментных тест-системах
встречаются перекрестные реакции с антигенами сапрофитных трихомонад
Сравнительные исследования по чувствительности иммуноферментного
анализа при диагностике трихомоноза у больных с разными формами
заболевания до последнего времени не проводились
До настоящего времени метронидазол, синтезированный в 1958 году, как производное 5-нитроимидазола, остается стандартным и наиболее широко используемым препаратом в лечении трихомоноза Чрезмерно широкое, нередко необоснованное применение метронидазола привело к появлению устойчивых штаммов трихомонад, и, следовательно, к повышению рекомендуемых суммарных доз препарата (Швелидзе М Н, 1988, Абдумаликов Р А, Брагина ЕЕ , 1995, Милевская С Г, 1996) Терапия трихомоноза не всегда приводит к излечению больных По данным ряда авторов, неэффективность лечения составляет 2,2 - 44,1% (Grunberg Е Titsworth Е , 1974, Нарзикулов Р М , 1990) Кроме того, применение препаратов метронидазола нередко сопровождается целым рядом побочных явлений, реакций и осложнений (Маждраков Г Попхристов П, 1973, Жуков В И, 1983, Яковлев С В , 1997)
Недостаточно изучена роль гуморального и клеточного иммунитета при трихомонозе (Терас Ю X, 1964, Кисина В И, 198*8, Alderete J F , 1986, Ackers JP, 1990) Имеются лишь единичные работы, посвященные изучению цитокинового статуса при данном заболевании (Горина Е Ю, Бутов Ю С ,
2001) Сегодня предложено большое количество иммуномодуляторов При этом
нередко иммунотропные препараты из разных групп имеют одинаковые
показания к применению, отсутствуют четкие критерии выбора того или иного
иммуномодулятора Это особенно важно на современном этапе, когда
традиционно использовавшиеся препараты из группы нитроимидазолов
становятся все менее эффективными ввиду возрастающей резистентности к ним
Т vaginalis и возникает вопрос об использовании полноценной и разумно
достаточной иммунокоррекции у таких пациентов Остаются дискутабельными
вопросы о факторах, определяющих хронизацию инфекционного процесса и
неэффективность его терапии
Цель исследования. На основании комплексного клинико-микробиологического, иммунологического обследования и результатов этиотропной терапии разработать диагностическую и терапевтическую стратегию ведения пациентов с трихомонозом
Задачи исследования.
1 Провести анализ клинико-микробиологических особенностей
урогенитального трихомоноза
2 Определить цитоморфологические признаки Т vaginalis округлой
формы, позволяющие проводить диагностику при отсутствии типичных
грушевидных форм
-
Изучить жизнеспособность округлых морфологических форм трихомонад, а также их вирулентность на культурах перевиваемых клеток m vitro
-
На основе сравнительного анализа теоретически обосновать и экспериментально подтвердить оптимальный качественный и количественный состав питательной среды для культивирования трихомонад, а также на основе цельноклеточного трихомонадного антигена сконструировать ИФА тест-систему
-
Установить информативность методов лабораторной диагностики урогенитального трихомоноза и обосновать последовательность их использования при постановке диагноза
-
Провести сравнительный анализ эффективности применения различных противопротозойных препаратов в терапии трихомоноза и разработать методику определения m vitro резистентности Т vaginalis к метронидазолу
-
Изучить характер иммунопатологического процесса при урогенитальном трихомонозе и оценить клинико-микробиологическую эффективность иммуностимулирующего препарата Бестим в комплексной терапии трихомоноза
Научная новизна исследования. Впервые установлено, что и у округлых и у грушевидных форм Т vaginalis наблюдаются сходные ультраструктурные элементы постоянно конденсированные хромосомы в ядре клетки и цитоскелетная структура - коста. В цитоплазме клетки округлой формы отмечены характерные изменения по сравнению с грушевидными клетками частичная деградация синтетического аппарата клетки, редукция околоядерной эндоплазматической сети и связанной с ней аксостиллярной области, изменение характера содержимого гидрогеносом, изменение расположения рибосом и характера расположения кинетосом жгутиков
Доказано, что округлые трихомонады являются одной из морфологических форм в жизненном цикле простейшего Структурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме округлых форм, свидетельствуют о снижении физиологической активности клетки Установлено сохранение жизнеспособности трихомонад при переходе в атипичные цитоморфологические формы В тесте на культуре перевиваемых клеток HeLa установлена патогенность округлых трихомонад
Впервые проведена комплексная оценка современных методов лабораторной диагностики мочеполового трихомоноза Сформулированы диагностические алгоритмы Усовершенствована питательная среда для культуральной диагностики трихомоноза Установлено, что серологическая диагностика мочеполового трихомоноза имеет вспомогательное значение в постановке диагноза заболевания Впервые изучены субизотипы
специфических IgG-антител при трихомонозе, что позволило констатировать наличие у пациентов противотрихомонадных антител как к липосахаридным, так и к белковым антигенам простейшего
Установлено, что неблагоприятный прогноз лечения хронического трихомоноза ассоциирован с достоверно более низким, по сравнению с благоприятным прогнозом, содержанием в сыворотке крови иммунокомпетентных клеток с фенотипом CD 19+ Неблагоприятный прогноз терапии проявляется достоверным превышением концентрации ИЛ-1 и ИФН-у в сыворотке крови и смывах со слизистых урогенитального тракта Для лиц с благоприятным прогнозом терапии хронического трихомоноза характерна более высокая системная и местная продукция ИЛ-8
Впервые продемонстрирована клинико-микробиологическая
эффективность комбинированной терапии хронического трихомоноза с использованием иммуностимулятора Бестим Выявлено, что в процессе лечения Бестимом наблюдается увеличение количества клеток с CD3+ и CD4+ фенотипами, в то время как количество клеток с фенотипом CD8+ достоверно не изменялось Также при терапии Бестимом установлено повышение уровня сывороточного интерлейкина-4
Практическая значимость. Показано, что наиболее часто при микробиологической диагностике урогенитальных инфекций (УТИ) выявляется Т vaginalis В структуре УГИ преобладает хронический трихомоноз в виде моноинфекции При смешанных инфекциях с участием Т vaginalis наиболее частым вариантом является сочетание с дрожжеподобной и условнопатогенной бактериальной микрофлорой В структуре жалоб у мужчин наблюдается увеличение числа больных со снижением полового влечения и эрекции, а также пациентов с дискомфортом в области промежности Отличительной особенностью группы мужчин является отсутствие у трети больных местных клинических проявлений, без учета данных лабораторно-инструментальных исследований Одновременно в отношении данной категории населения не предусмотрены плановые организационные и диспансерные мероприятия по выявлению и лечению урогенитальных инфекций Эти обстоятельства в целом могут способствовать сохранению высокого уровня заболеваемости в популяции лиц мужского пола, тем самым являться источником инфекций урогенитального тракта
Установленные клинические особенности хронического трихомоноза в современных условиях определяют приоритеты в выборе методов микробиологической диагностики На основании многофакторного дискриминантного анализа разработаны высоко информативные и значимые математические модели, позволяющие определить прогноз, а также рациональную терапевтическую тактику
Результаты исследования могут использоваться в микроскопической дифференцировке округлых морфологических форм трихомонад при проведении микробиологической диагностики
Разработанная питательная среда для культуральной диагностики трихомоноза сочетает высокие ростовые свойства и низкую себестоимость
г*
Установлено, что результаты ПЦР носят предварительный характер и не могут быть использованы для достоверной диагностики трихомоноза ИФА может применяться в дополнение к существующим диагностическим подходам Обнаружение специфических антител к антигенам белковой природы в перспективе делает возможным получение их искусственных аналогов с целью стандартизации серодиагностики трихомоноза Предложенные диагностические алгоритмы позволяют повысить эффективность диагностики мочеполового трихомоноза при снижении временных и финансовых затрат Метод определения резистентности трихомонад к метронидазолу, отличающийся практической доступностью, может использоваться для определения прогноза и тактики лечения
Одновременное применение в терапии как острого, так и хронического
трихомоноза двух дрогаволротозойных препаратов различных
фармакологических групп (орнидазол и нифуратель) позволяет достичь более
выраженного клинико-микробиологического эффекта по сравнению со
стандартными схемами этиотропного лечения Применение Бестима в
комплексной терапии хронического трихомоноза оказывает
иммуностимулирующее действие и обладает выраженной клинической эффективностью Целесообразно его включение в схему комплексной терапии больных хроническим трихомонозом
Личное участие автора в получении результатов. Автором научно
обоснована методология исследования течения трихомоноза,
проанализированы клинико-лабораторные и иммунологические проявления заболевания на различных его этапах, разработаны математические модели для оценки прогноза заболевания, создан алгоритм по диагностике и тактике лечения пациентов
Автор планировал исследования, принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывал и участвовал в проведении всех лабораторно-инструментальных, иммунологических и ультразвуковых исследований, а также осуществлял мониторинг эффективности и безопасности противопротозойной и иммунотропной терапии Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов
Основные положения, выносимые на защиту.
-
В структуре обследованных больных инфекциями урогенитального тракта преобладают пациенты с хроническим трихомонозом в форме моноинфекции Клиническая картина хронического трихомоноза у мужчин характеризуется патоморфозом У трети мужчин при хроническом трихомонозе отсутствуют субъективные и объективные клинические симптомы, без учета результатов лабораторных и инструментальных исследований
-
Округлые морфологические формы Т vaginalis являются одной из стадий жизненного цикла простейшего и обладают прямым циюпатогенным действием на эпителиальные клетки Ультраструктурные изменения, наблюдаемые в цитоплазме клеток округлых форм, указывают на снижение физиологической активности простейшего
3. Культуральное исследование имеет решающее значение в диагностике мочеполового трихомоноза у мужчин У женщин микроскопия нативного препарата, отделяемого из урогенитального тракта, позволяет диагностировать мочеполовой трихомоноз в большинстве случаев Серологическая диагностика мочеполового трихомоноза (ИФА) имеет вспомогательное значение
4 Включение Бестима в комплексную терапию хронического трихомоноза проявляется положительным клинико-лабораторным эффектом лечения, при этом в периферической крови избирательно повышается концентрация иммунокомпетентных клеток с фенотипами CD3+ и CD4+ и продукция сывороточного ИЛ-4, а количество клеток с фенотипом CD8+ достоверно не изменяется
Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии ВМедА им СМ Кирова, СПб ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Областного КВД» (С -Петербург)
Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийском съезде врачей-инфекционистов (С-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (С-Петербург, 2004), Российско-Шведской конференции «Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С-Петербург, 2004), Научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (С -Петербург, 2004), УП Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреж-дении» (С-Петербург, 2005), Российской научно-практической конференции дерматовенерологов «Санкт-Петербургские дерматовенерологические чтения» (С-Петербург, 2005), заседаниях городского общества дерматовенерологов им ВМ Тарновского (С-Петербург, 2004, 2006), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 135-летию кафедры кожных и венерических болезней ВМедА (С-Петербург, 2004), 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С-Петербург, 2005), Научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С -Петербург, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С -Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С -Петербург, 2007)
По материалам исследования опубликовано 41 печатная работа, в том числе 1 учебно-методическое пособие, 9 статей, из которых 6 в реферируемых журналах
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 349 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 7 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав результатов собственных исследований), обсуждения полученных результатов, выводов, практических
рекомендаций, указателя литературы, включающего 259 источников, в том числе 93 отечественных и 166 зарубежных Текст содержит 93 таблицы, 2 формулы, 7 машинограмм и 25 рисунков
Инфекционная иммунология трихомоноза
Изучение антигенных свойств Т. vaginalis проводилось в течение длительного времени. Представления об антигенном строении простейшего изменялись в зависимости от методов исследований. Наибольшие успехи в понимании структуры, функций и свойств трихомонадных антигенов были достигнуты с помощью методов нммуноферментного анализа, нммупоблоттинга и иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (Petrin D. etal., 1998).
Результаты исследований антигенной гетерогенности трихомонад отличаются разноречивостью и указывают на наличие от 4 до 8 серотипов возбудителя (Honingberg В.М., 1990). Показано, что использование в непрямом варианте ИФА антигена нескольких штаммов трихомонад позволяет добиться увеличения показателей чувствительности при выявлении специфических иммуноглобулинов, по сравнению с использованием гомологичного антигена (CogneM. etal., 1985).
Современные знания об антигенной структуре микроорганизмов расширяются в связи с возможностью выявления отдельных антигенных детерминант (Ackers J.Р. , 1990). Исследования антигенного строения трихомонад проводились с целью выявления как общих, так и видоспецифических имму-ногенных клеточных структур. При этом обращают на себя внимание два принципиальных научных подхода: в первом случае (наиболее распространенные исследования) изучался спектр трихомонадных антигенов, реагирующих с сыворотками крови больных; во втором подходе основное внимание уделялось более подробному анализу консервативности и вариабельности антигенных детерминант с использованием моноклональных антител (МКАТ) известной специфичности (Ackers J.Р., 1990).
Продемонстрировано наличие как специфических, так и общих антигенов у различных видов трихомонад Т. vaginalis, Т. tenax, Т. intestinalis (Kott Н.А., 1961).
При изучении локализации антигенов на поверхности клетки Т. vaginalis обнаружено свыше 20 высокоиммуногенных мембранных белков (Беднова В.Н. и др., 1990; Alderete J.F., 1983; Connelly R.J. et ah, 1985; Garber G.E. et ah, 1986; 1986; Khalifa K.K. et ah, 2004). Молекулярная масса всех обнаруженных белков колеблется от 20 до 300 кДа. На основании данных об иммуно-генности трихомонадных антигенов целесообразно выделение групп протеинов: более 100 кДа, от 65 до 100 кДа и менее 65 кДа (Alderete J.F., 1990).
Показано, что наибольшей иммуногенностью обладают антигены 65 и 92 кДа (Alderete J.F., 1983). У большинства штаммов Т. vaginalis присутствует белок 100 кДа. Предполагается, что он может с успехом использоваться в серологической диагностике трихомоноза.
Антигены 40, 55, 72 и 92 кДа определены как экзопротеины, а белки 50, 78, 80 и ПО кДа ассоциированы с соматическими клеточными структурами (Khalifa К.К. et al., 2004). Наибольшая перспективность использования в иммунодиагностике трихомоноза прогнозируется для белков с молекулярной массой 23 и 60 кД.
В состав жгутикового аппарата Т. vaginalis входит более десяти белков с молекулярной массой от 20 до 120 кДа. При проведении иммуноблотта наибольшую иммуногенность проявили антигены с молекулярной массой 50 и 65 кДа (Jemilohum Р.Е., 1998).
Сыворотки крови больных трихомонозом специфически реагируют с полипептидами различной молекулярной массы за счет иммуноглобулинов класса IgG, IgM и IgA. Основной вклад в иммунореактивность сывороток крови вносят специфические IgG. Они реагируют с наибольшим количеством антигенов. Причем все сыворотки, содержащие иммуноглобулины класса IgG, взаимодействуют с белком 118 кДа, a IgM с 58 кДа (Wos S.M., 1986). По-видимому, сыворотки крови больных различаются по способности реагировать с трихомонадными антигенами. Выявлена положительная корреляция между титром сывороток крови в ИФА и количеством трихомонадных антигенов, реагирующих с этими же сыворотками в ИБ (Wos S.M., 1986).
При исследовании сывороток крови беременных женщин с асимптом-ным течением заболевания показано, что все IgG положительные сыворотки реагировали с общим иммуногенным белком 115 кДа. Этот белок был идентифицирован как паразитарный а-актинин, характерный не только для патогенной трихомонады. Данный структурный белок экспрессируется на всех стадиях жизненного цикла простейшего (Addis M.F. et al., 1999). Следующим по степени иммуногенности является антиген 140 кДа, антитела к которому присутствовали в 76-90% исследуемых клинических образцов. Видоспеци-фичность описанного протеина не изучалась (Addis et al., 1999).
В данных, полученных различными методами (РИП, РКА и РНИФ), наблюдаются некоторые расхождения, что указывает на необходимость использования нескольких методик при изучении антигенного состава микроорганизмов (Honingberg В.М., 1990).
В большинстве случаев различия в иммунологической реактивности сывороток крови наблюдаются при проведении иммуноблоттинга с высокомолекулярными антигенами (более 150 кДа). Отмечено, что расхождения в результатах серологического тестирования могут быть связаны не только со степенью иммуногенности микробных белков, но и с индивидуальными особенностями иммунного ответа у больных.
Девис-Хейман с соавт. (Davis-Hayman S.R. et al., 2000) методом РИП исследовали антигенную активность белков теплового шока Т. vaginalis. Было показано, что паразитарные белки молекулярной массой 167-169 и 137-140 кДа специфически реагировали с сыворотками больных трихомонозом как женщин, так и мужчин. Наибольшую иммунореактивность проявляют белки теплового шока с молекулярной массой 71-72, 45-47, 37-38, 35 и 31 кДа. При исследовании сывороток крови здоровых лиц качественные и количественные показатели иммунореактивности трихомонадных белков соответствовали результатам изучения материала от больных трихомонозом. Интересно отметить, что один белок с молекулярной массой 38 кДа взаимодействовал только с сыворотками инфицированных женщин, причем в 100% случаев. Исследователи высказывают предположение, что этот белок является строго специфичным для женщин, страдающих трихомонозом (Davis-Hayman S.R. etal.,2000).
Обобщая результаты работы, можно выделить как минимум два трихомонадных антигена: с молекулярной массой в пределах 92-115 кДа (по данным различных авторов) и 58-65 кДа. Не исключено, что расхождения в определении молекулярной массы связаны с особенностями проведения лабораторных исследований. Потенциальная консервативность указанных антигенных областей делает их перспективными для использования в серологической диагностике трихомоноза, при отсутствии перекрестной реактивности с сыворотками крови здоровых лиц. Этот вопрос требует дополнительного изучения.
Параллельно с описанными работами изучение антигенной гетерогенности трихомонад проводилось с использованием панелей моноклональных антител методом непрямой иммунофлюоресценции (Mason P.R., 1979). Описана гетерогенность штаммов Т. vaginalis по иммунореактивности в РНИФ. Показано, что два из девяти МКАТ реагировали со всеми изолятами. Четыре МКАТ проявили высокую иммунореактивность, различающуюся при исследовании географических изолятов (Krieger J.N. et al., 1985). Предполагается возможность использования МКАТ с целью индикации возбудителя в клиническом материале. К сожалению, антигенная специфичность использованных МКАТ не исследовалась, что затрудняет более продуктивный анализ результатов работы.
При изучении иммуногенных свойств гликопротеина с молекулярной массой 267 кДа, с использованием соответствующего по специфичности МКАТ в методе проточной цитофлюореметрии установлены два фенотипа трихомонад. (Aldrete et al., 1986). «Негативные» фенотипы (не экспрессируют антиген 267 кДа) обладают цитотоксической активностью, в то время как «позитивные» (экспрессируют белок 267 кДа) ее лишены. Предполагается, что существует взаимосвязь между экспрессией этого белка и вирулентностью трихомонад. Кроме того, часть штаммов гетерогенна, а часть однородна по показателям фенотипирования. В последующих исследованиях гетерогенные, по способности связываться с МКАТ к гликопротеину 267 кДа, штаммы были объединены в группу с «промежуточным» фенотипом (Alderete J.F., 1986).
Иммуноферментный анализ
ИФА с использованием коммерческой иммуноферментной тест-системы «ТрихомоноБест-IgG стрип». Постановка данного исследования проводилась в соответствии с приложенной инструкцией к диагностической иммуноферментной тест-системе.
Первоначально в каждую лунку планшета с иммобилизированными три-хомонадными антигенами вносили 300 мкл промывочного раствора ФСБ и однократно промывали в течение 5 минут. Далее во все лунки добавляли 80 мкл раствора для разведения сывороток, а в любые две лунки вносили 20 мкл отрицательного контрольного образца и в одну лунку 20 мкл положительного контрольного образца. Следующим этапом реакции было внесение исследуемых сывороток крови больных в лунки планшета в количестве 20 мкл, получая, таким образом, разведение 1:5. Далее планшет заклеивали клейкой пленкой и инкубировали при 37С в течение 30 минут. По окончании инкубации удаляли содержимое лунок и пятикратно промывали лунки промывочным раствором ФСБ. В каждую лунку планшета вносили 100 мкл конъюгата в рабочем разведении и инкубировали при температуре 37С в течение 30 минут. Затем лунки планшета пятикратно промывали и в каждую лунку вносили 100 мкл хромогена. Планшет помещали на 30 минут в темное место. На последнем этапе реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл стоп-реагента. Результаты ИФА регистрировали с использованием вертикального фотометра Multiscan-MC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм. Результаты исследования оценивались только в том случае, если среднее значение ОП в контроле К- и К+ соответствовали следующим требованиям: ОП ср. (К+) 0,6, а ОП ср. (К-) 0,25. ОП критическое рассчитывали по следующей формуле:
ОП крит = ОП ер (К-) + 0,25
К- - отрицательный контрольный образец
К+ - положительный контрольный образец
ОП крит - критическое значение оптической плотности образца
ОП ер (К-) - среднее значение оптической плотности отрицательного образца.
Для получения трихомонадного антигена было проведено выделение изолята Т. vaginalis от инфицированной женщины с острой формой урогени-тального трихомоноза. Для получения биомассы простейшего, изолят Т. vaginalis культивировали на модифицированной питательной среде Даймонд в течение 4- суток при температуре 37С. В исследование отбирался материал, соответствующий следующим критериям: подвижные Т. vaginalis грушевидной формы, в количестве более 20 кл/мкл, без сопутствующей микрофлоры.
Трихомонадный антиген получали двумя способами:
1) Замораживание/оттаивание:
Полученную культуру клеток трихомонад центрифугировали при 3000 об/мин (центрифуга MLW23, Германия) в течение 10 мин, далее дважды промывали 0,01М ФСБ (рН-7,2) и дважды 0,02М КБК (рН-9,6). Затем производили 10-кратное замораживание/оттаивание полученного осадка клеток трихомонад. Режим заморозки при температуре -20С (холодильная камера), в течение часа, а оттаивание при комнатной температуре.
2) Ультраозвучивание:
Культуры клеток Т. vaginalis трижды центрифугировали в стерильном изотоническом растворе при 3000 об/мин (центрифуга MLW23, Германия). Клетки разрушали ультразвуком на приборе УЗДН-ІУ-42 в течение 30 мин при частоте 22 кГц.
Концентрацию белка в растворе антигена определяли по методу Лоури.
Процедура постановки модифицированного варианта ИФА.
АГ - иммобилизованный трихомонадний антиген; АТХ - антитела, выявляемые в сыворотке крови; К - конъюгат: антитела к иммуноглобулинам человека, меченные ферментом.
Твердой фазой во всех вариантах ИФА служили 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола (Costar, США).
Описание реагентов:
— 0,02 М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (рН-9,6) использовался для приготовления рабочего раствора антигена и последующей сорбции планшетов;
— для промывки планшетов в перерывах между основными этапами реакции, разведения сывороток и приготовления рабочего раствора конъюгата использовался фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,15 М хлористого натрия и с добавлением 0,1% твин-20 (ФСБ);
- субстратный раствор включает в себя 0,05 М цитратный буфер (рН 5,0), перекись водорода (0,035%) и ТМБ;
- для выявления специфического комплекса антиген-антитело использовались пероксидазные конъюгаты на основе моноклональных антител, направленных к изотипспецифичным эпитопам IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG, IgM. Все из использованных моноклонов были получены из лаборатории гибридомных технологий ЦНИ рентгенорадиологического института МЗ РФ (руководитель д.м.н., профессор Климович В.Б.).
Раствор антигена вносили по 100 мкл в лунки планшета и оставляли при -4С на 24 часа. После адсорбции планшеты промывали внесением в каждую лунку по 200 мкл раствора 0,01М ФСБ.
Затем в лунки помещали по 100 мкл исследуемых сывороток в разведении 1:10, приготовленном на 0,01М ФСБ. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при температуре 37С с последующим трехкратным отмыванием 0,01М ФСБ, после чего в лунки вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата. Планшеты инкубировали 30 минут при температуре 37 С и после пятикратного промывания лунок ФСБ добавляли по 100 мкл субстратного раствора. После 15±1 мин. экспозиции при температуре 20±2С реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2М H2SO4 и определяли оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции на вертикальном фотометре Multiscan-MC (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм.
Характеристика жалоб и клинических симптомов
В большинстве наблюдений как в группе мужчин, так и у женщин, были установлены манифестные клинические формы хронического трихомоноза. Одновременно, у 28,3% мужчин наблюдалось асимптомное течение инфекции, что достоверно отличало данную группу от женщин (20,6%) (таблица 5.5).
По сравнению с группой пациентов с УГИ у мужчин с хроническим трихомонозом достоверно чаще отмечались тянущие боли в мошонке (10,8%), характеризующие расширение очага воспалительных изменений и вовлечение в патологический процесс яичек и их придатков (таблица 5.6). Еще одной отличительной особенностью больных хроническим трихомонозом являлось отсутствие жалоб в 28,3% случаев (р 0,05).
Женщины с хроническим трихомонозом наиболее часто предъявляли жалобы на зуд, жжение и выделения из влагалища (таблица 5.7). Отсутствие жалоб было описано только у 10,3% пациенток. По сравнению с женщинами в группе больных УГИ при хроническом трихомонозе значимо выше частота жалоб на жжение во влагалище (р 0,05).
Сравнительная характеристика клинических симптомов у пациентов с подтвержденным диагнозом «урогенитальныи трихомоноз» представлена таблице 5.8. В группе лиц с установленным диагнозом «хронический трихомоноз» достоверно чаще отмечались слизисто-гнойные выделения из уретры. В 34,4% случаев местные клинические симптомы у мужчин отсутствовали. Данный факт может свидетельствовать как о постепенном стихании воспалительных явлений в урогенитальном тракте с течением времени, так и о возможности привыкания больных к имеющимся симптомам. Следует отметить, что в большинстве подобных случаев при углубленном инструментально лабораторном обследовании выявлялись незначительные признаки воспаления в области задней уретры и в половых железах.
Топическая локализация воспалительных изменений в УГТ у мужчин характеризуется преобладанием признаков уретропростатита (таблица 5.9). У всех пациентов диагноз был установлен на основании данных анамнеза, клинических проявлений, лабораторных данных, уретроскопии и УЗИ предстательной железы. Обращает внимание достаточно высокая частота развития такого осложнения как стриктуры уретры разной степени выраженности (таблица 5.10). Мягкий и твердый инфильтраты встречались значительно реже в 11,9 и 7,5% случаев соответственно.
Характеристика клинических симптомов у пациенток с диагнозом «хронический трихомоноз» представлена в таблице 5.11.
У пациенток с урогенитальным трихомонозом наиболее часто отмечались выделения из влагалища (78,8%), гиперемия стенок вагины (58,9%), достоверно реже присутствовали эрозии наружных половых органов и эрозия шейки матки (р 0,05). Таким образом, наличие выделений из влагалища являлось одним из основных клинических симптомов мочеполового трихомоноза у женщин. При сравнении частоты встречаемости жалоб на выделения из влагалища с фактическим наличием данного клинического симптома у заболевших выяснилось, что данный клинический признак имелся достоверно чаще, чем указания на него (р 0,05). Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что большинство женщин с трихомонозом, имея выделения из влагалища, считают себя здоровыми. Возможно, это является одной из эпидемиологических предпосылок столь широкого распространения данного заболевания.
В отличие от мужчин у женщин отсутствие клинических проявлений было менее характерно и не превышало 20,5%.
В 43,8% у женщин с хроническим трихомонозом наблюдались распространенные воспалительные изменения, включая уретрит, эндоцервицит и вагинит (таблица 5.12). Изолированные поражения УГТ выявлялись достоверно реже (р 0,05).
Иммуннологические особенности у больных острым и хроническим трихомонозом
В литературе имеются достаточно обширные сведения о наличии сдвигов в иммунном статусе при различных ИППП. Показано, что изменения обладают специфичными чертами и касаются различных звеньев иммунитета (неспецифические факторы защиты, показатели функциональной активности нейтрофилов, Т- и В-клеточные звенья). Большинство исследователей предполагают взаимосвязь и взаимообусловленность подобных изменений. Установлена взаимосвязь иммунных нарушений и стадий инфекционного процесса. Исходя из этого прогнозируется, что эффект иммунотерапии может быть обусловлен этапом патологического процесса.
В тоже время литературных сведений об особенностях иммунных изменений при трихомонадной моноинфекции, особенно хронической, практически не встречается.
Другим проблемным вопросом является неоднозначность при выборе перечня конкретных иммунологических показателей для исчерпывающей оценки состояния пациента. Указывается возможность ориентировочной оценки иммунных сдвигов по результатам общеклинического анализа крови, фагоцитарной активности лейкоцитов, уровням сывороточных иммуноглобулинов. Одновременно результаты исследований показателей клеточного иммунитета и цитокинового статуса используются исключительно в научных публикациях и практически не учитываются на практике.
Поэтому сохраняет актуальность проведение исследований по выявлению минимального и достаточного перечня показателей состояния иммунной системы для использования их клиническими специалистами.
Дополнительные сложности возникают при определении нормальных параметров из числа клеточных и гуморальных факторов иммунитета. По данным различных авторов конкретные нормативы в иммунологии могут различаться.
В связи с вышесказанным, мы попытались провести селекцию наиболее информативных показателей, характеризующих состояние иммунного статуса и выявить их взаимосвязь с клиническими особенностями течения трихомоноза.
Анализ общепринятых клинических лабораторных сведений (таблица 7.1) не выявил различий в группах пациентов с острым и хроническим трихомонозом по сравнению с группой сравнения (р 0,05).
Изучение клеточных показателей иммунитета у больных острым трихомонозом позволило выявить динамику иммунного статуса в процессе терапии (таблица 7.2). После лечения установлено достоверное снижение абсолютного числа клеток периферической крови с фенотипом CD3+ и CD4+. Этот факт может быть связан со снижением воспалительных проявлений в УГТ на фоне эффективной терапии. Динамика концентрации ИЛ-4 и ИЛ-8 характеризовалась разнонаправленностью (таблица 7.3). Концентрация сывороточного ИЛ-4 достоверно повышалась в ближайшие после окончания лечения сроки. Подобная динамика ИЛ может быть обусловлена активацией возбудителем трихомоноза иммунного ответа по Th2 типу. Уровень сывороточного ИЛ-8 напротив снижался в результате лечения, что, скорее всего, связано со снижением местной воспалительной реакции на слизистых УГТ.
Иммунологические показатели при хроническом трихомонозе принципиально не отличались от таковых при остром заболевании (таблица 7.4). В тоже время отмечены достоверно более низкие абсолютные значения содержания клеток с фенотипами CD3+ и CD4+ при хроническом трихомонозе вследствие большей длительности инфекционного процесса и снижения выраженности местных воспалительных реакций. Положительная динамика ИЛ-8 в процессе терапии хронического трихомоноза может объясняться развитием неспецифической воспалительной реакции после эрадикации простейших (таблица 7.5).
Отличий в иммунологических показателях при обследовании мужчин и женщин выявлено не было (таблицы 7.6, 7.7, 7.8, 7.9). Группа мужчин характеризовалась повышение в динамике лечения уровней сывороточных ИЛ-1 и ИЛ-8. Повышение концентрации ИЛ-1 мы объясняем возможной активацией иммунной системы по ТЫ типу, а повышение ИЛ-8 с усилением неспецифических воспалительных изменений на слизистых УГТ.
Таким образом, были выявлены зависимости в данных иммунологических исследований от диагноза (острый и хронический трихомоноз) и сроков обследования. С целью уточнения характера иммунологических изменений при трихомонадной инфекции мы суммировали данные исследований с учетом длительности заболевания на момент обследования пациентов.
Данные исследований до лечения указывают на то, что при длительности заболевания от 12 до 24 месяцев характерно достоверное снижение клеток с фенотипом CD3+ (таблица 7.10). Этот факт отражает развивающееся иммунодефицитное состояние, природа которого требует дополнительного изучения. Следует отметить, что эффективное лечение способствует нормализации клеточных факторов иммунитета у данной категории пациентов (таблица 7.12).
Одновременно, при сроках заболевания более 6 месяцев, установлено достоверное повышение концентрации сывороточных ИЛ-4 и ИЛ-8, отражающих интенсификацию иммунного ответа при хронизации заболевания (таблица 7.11). Уровни данных ИЛ у пациентов с меньшими сроками трихомоноза отличаются снижением, вероятно связанным с повышенным потреблением факторов иммунитета при остром инфекционном процессе. Эффективная терапия приводит к компенсаторному повышению концентрации ИЛ-4 и ИЛ-8 (таблица 7.13).
![Современные аспекты клиники, диагностики и лечения бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста [Электронный ресурс]](/i/i/4469/182026.png "Современные аспекты клиники, диагностики и лечения бактериального вагиноза у женщин репродуктивного возраста [Электронный ресурс] Аксенова Ольга Александровна")
